1) Technika mikroskopowa

* stanowi podstawowe narzędzie badań struktur komórkowych

* nie umożliwia uzyskania dokładnych informacji o składzie chemicznym i funkcjach organelli komórkowych

2) Metody i techniki pracy sprawdzone w fizyce, chemii i medycynie, wykorzystywane do badania komórek i tkanek

* delikatne rozbijanie komórek lub tworzenie za pomocą detergentów porów w błonie komórkowej (w ten drugi sposób uwalniane są białka czy DNA bez zniszczenia komórek)

* uzyskuje się wówczas homogenat - zawiesinę komórkową

* techniki frakcjonowania - techniki rozdzielania zawartości komórek

* ultrawirówka - urządzenia stosowane w technikach frakcjonowania, w którym badane próbki poddaje się działaniu siły odśrodkowej

* poszczególne organelle różnią się masą i gęstością, więc stosuje się wirowanie różnicowe, tzn. ze wzrastającą szybkością (do 100tys obrotów/min) i w określonym czasie

- najcięższe organelle opadają na dno próbówki, tworząc osad

- ponad nimi pozostaje roztwór, który po przelaniu do następnej próbówki nadal poddawany jest wirowaniu

* uzyskane frakcje komórkowe można dalej oczyszczać za pomocą wirowania równowagowego w gradiencie gęstości

- osad do wirowania nanosi się (nawarstwia) na powierzchnię odpowiedniego roztworu (np. fikolu o zróżnicowanym stężeniu), rosnącym w kierunku dna próbówki i następnie wiruje

- podczas wirowania w gradiencie gęstości składniki komórki wędrują do rejonów o gęstości, która jest równa ich własnej, tworząc tam pasma zawierające oczyszczone frakcje

* frakcje zbiera się oddzielnie i poddaje dalszym badaniom

3) autoradiografia - pozwala na kontrolowanie przebiegu reakcji po uprzednim oznakowaniu radioizotopami uczestniczących w niej związków

* substancje promieniotwórcze występują w organizmie w ilościach śladowych i jeśli zostaną wprowadzone do organizmu, wbudowuje je on do swoich związków chemicznych

* przemiany RNA

- aby śledzić przemiany RNA w komórkach embrionalnych (zarodkowych), można inkubować komórki z radioaktywnym prekursorem tego związku, znakowanym np. izotopem wodoru ³H

- po inkubacji materiał poddaje się rutynowej technice histologicznej: sporządza się skrawki, umieszcza na szkiełkach podstawowych, preparaty pokrywa się emulsją fotograficzną zawierającą AgBr i pozostawia w ciemności (nawet na kilka miesięcy)

- w tym czasie promieniowanie emitowane przez izotop promieniotwórczy trafia na AgBr i powoduje pojawienie się w nim metalicznego srebra

- po wywołaniu autoradiogramu można np. dokładnie określić lokalizację „promieniotwórczego” RNA w komórce albo rozpoznać określone sekwencje DNA

- przy zastosowaniu bardzo cienkich skrawków można oglądać autoradiogramy pod mikroskopem elektronowym

4) chromatografia - metoda pozwalająca rozdzielać jednorodne mieszaniny związków, np. białek, aminokwasów lub barwników asymilacyjnych

- wykorzystuje się siły oddziaływania rozdzielanych składników z fazą ruchomą i nieruchomą

* chromatografia bibułkowa

- stosowana np. w rozdzielaniu barwników roślinnych

- ekstrakt barwników, uzyskiwany przez roztarcie (np. w moździerzu) liści wybranej rośliny z odpowiednim rozpuszczalnikiem

(np. alkoholem), stanowi mieszaninę składników, które należy rozdzielić

- bibuła chromatograficzna to faza nieruchoma (stacjonarna), a mieszanina rozpuszczalników (np. eteru i benzenu lub benzyny i benzenu) to faza ruchoma

- na bibułę chromatograficzną nanosi się w linii startu przesączony ekstrakt barwników i całość suszy

- do szklanego naczynia (komory chromatograficznej) wlewa się mieszaninę rozpuszczalników (układ rozwijający), przykrywa i zostawia

- po wysyceniu wnętrza komory chromatograficznej oparami rozpuszczalników umocowuje się w niej pasek bibuły, zanurzając go poniżej linii startu w układzie rozwijającym

- mieszanina rozpuszczalników wsiąka w bibułę dzięki jej woskowatości i unosi się ku górze, a wraz z nią przemieszczają się barwniki

- szybkość przemieszczania się barwników jest różna

- barwnik najłatwiej rozpuszczalny i najsłabiej absorbowany przez bibułę przesuwa się najszybciej, co w efekcie prowadzi do rozdzielenia wszystkich barwników na pasku bibuły

- zajmują one określone miejsca na chromatografie

- stężenie barwników można mierzyć na powierzchni, jaką zajmują na pasku bibuły, a przede wszystkim można je ekstrahować (robić wyciąg) z bibuły za pomocą czystego rozpuszczalnika i poddać dalszej analizie

* chromatografia kolumnowa

* chromatografia cienkowarstwowa

5) elektroforeza - metoda rozdzielania jednorodnych mieszanin

- możliwa do zastosowania w polu elektrycznym - dzięki wędrującym cząsteczkom obdarzonym ładunkiem elektrycznym

- wykorzystuje się ją głównie do rozdzielania i oczyszczania mieszanin białek, aminokwasów i kwasów nukleinowych (w warunkach, w których sumaryczny ładunek elektryczny cząsteczek jest różny od zera)

* immunoelektoforeza

* elektroforeza bibułowa

* elektroforeza żelowa - znalazła szerokie zastosowanie w medycynie klinicznej w analizie białek osocza krwi i badaniach odchyleń od normy tych związków

1) hodowle komórkowe i tkankowe - umożliwiają badanie procesów komórkowych in vitro (poza organizmem)

* zakłada się je umieszczając małe fragmenty ciała, np. skóry, w odpowiedniej pożywce

* po kilkudziesięciu godzinach na obwodzie tego fragmentu pojawiają się wywędrowujące z niego komórki - fibroblasty (komórki twórcze tkanki łącznej właściwej)

* komórki te się dzielą, co powoduje powiększanie hodowli

* hodowla pierwotna - złożona z tkanek pobranych bezpośrednio z organizmu

* po pierwszym przeniesieniu komórek do innego naczynia, czyli po tzw. pierwszym pasażu, po pewnym czasie uzyskuje się tzw. linię komórkową

* linie komórkowe wyprowadzane z tego samego materiału mogą się znacznie różnić właściwościami w zależności od warunków hodowli

* liczne komórki in vitro starzeją się i obumierają, obserwuje się różne zjawiska towarzyszące temu procesowi, m.in. uszkodzenia DNA, zmiany stężenia RNA, skracanie chromosomów

* wyodrębnia się też białka znamionujące rychłą śmierć komórek

2) hodowle tkankowe prowadzi się również, wykorzystując komórki roślinne różnych organów

* w takich hodowlach uczeni mogą regenerować całe rośliny hodowane na syntetycznych pożywkach wzbogaconych w substancje hormonalne

* metody hodowli komórkowej i tkankowej roślin pozwalają śledzić procesy wzrostu i rozwoju roślin, otrzymywać rośliny o korzystnych cechach genetycznych, dokonywać zmian składu genetycznego

1) Barwienie fluorescencyjne

* technika nadawania kolorów składnikom komórek i tkanek przy użyciu barwników fluorescencyjnych

* fluorescencja - właściwość wypromieniowywania przez barwnik fluorescencyjny światła innego koloru niż światło wcześniej zaabsorbowane

* barwnik fluorescencyjny (np. oranż akrydyny) ma zdolność do wyemitowania fluorescencji o długości fali większej niż zaabsorbowana

* dzięki tej technice możliwe jest przyżyciowe barwienie struktur i substancji komórkowych (bez zaburzania życia komórki)

* efekty barwienia można zaobserwować z zastosowaniem mikroskopu fluorescencyjnego, który ma nadfioletowe źródło światła w postaci lampy rtęciowej lub światła emitowanego przez laser (mikrofotografia konfokalna)

2) Znaczenie barwienie

* pozwala na uwidacznianie struktur komórkowych słabo lub zupełnie niemożliwych do zobaczenia w preparatach świeżych (niebarwionych)

* barwienie pojedyncze - używa się jednego barwnika

* barwienie złożone - używa się wielu barwników kolejno lub równocześnie

* najczęściej używane barwniki

* nowoczesne techniki stosowane w cytologii, neurobiologii i embriologii eksperymentalnej (np. z procesach klonowania zarodków)

* polegają na zabiegach chirurgicznych, przeprowadzanych przy użyciu mikronarzędzi (mikropipet, mikroskalpeli), poruszanych z wielką precyzją za pomocą tzw mikromanipulatorów

* ciekawym przykładem są tu mikroiniekcje

- DNA wprowadza się bezpośrednio do jądra zapłodnionej komórki jajowej za pomocą mikropipety szklanej o średnicy 0,1 mikrometra

- zabieg wykonuje się pod mikroskopem

- jest powszechnie stosowany w celu uzyskiwania zwierząt zmodyfikowanych genetycznie

BIOFIZYCZNE I BIOCHEMICZNE METODY BADANIA KOMÓREK

HODOWLE IN VITRO KOMÓREK I TKANEK

BARWIENIE KOMÓREK

Struktura/składnik komórkowy	Barwnik	Efekt barwny
Ściana komórkowa celulozowa	Karmin ałunowy	Czerwony
Ściana komórkowa zdrewniała	Zieleń jodowa	Zielony
Jądro komórkowe	Czerwień jądrowa	Jasnoczerwony
Ziarna skrobi	Płyn Lugola	Fioletowo-niebieski
Krople tłuszczu	Sudan III i IV	Czerwony

MIKROMANIPULACJE

---