INŻYNIERIA GENETYCZNA

Temat: Trawienie plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi.

Zagadnienia:

• Enzymy restrykcyjne

• Zasady trawienia plazmidowego DNA

Ogólne zasady trawienia plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi:

1. Teoretyczna wydajność trawienia: 1U (unit) enzymu trawi w ciągu 1 godziny 1µg DNA

2. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się buforu dla enzymów w stosunku 1:10 do końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej

3. Ilość enzymów nie powinna przekraczać 10% objętości mieszaniny reakcyjnej

4. Próbek nie należy worteksować.

5. DNA można trawić jednocześnie kilkoma enzymami. Należy wtedy dobierać bufor w taki sposób, aby był on kompatybilny ze wszystkimi używanymi enzymami.

6. Większość enzymów dobrze trawi DNA w temperaturze 37°C

7. Niektóre enzymy wykazują tzw. „star activity”. Aktywność „star” polega obniżeniu lub na częściowym zaniku specyficzności enzymu, co objawia się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne. Najczęstszy zanik specyficzności polega na cięciu sekwencji różniących się od restrykcyjnej jednym nukleotydem, cięciu sekwencji krótszych o nukleotydy początkowe. Aktywność star można redukować stosując się do zaleceń producenta enzymów, takich jak:

• używania enzymu w minimalnej ilości potrzebnej do pocięcia danej ilości DNA (zmniejsza ilość glicerolu w próbce oraz zapewnia odpowiedni stosunek enzymu do DNA, wydłuża jednak czas reakcji);

• pozbycie się śladów odczynników organicznych (szczególnie etanolu używanego powszechnie do izolacji DNA);

• zapewnienie odpowiednio wysokiej lub specjalne zawyżanie siły jonowej (niektóre enzymy są jednak inhibowane przez wysoką siłę jonową);

• utrzymywanie pH reakcji w okolicach 7,0 (wyższe pH reakcji bywa efektem używania niewystarczająco czystego DNA izolowanego metodą lizy alkalicznej);

• używanie Mg2+ jako jonów dwuwartościowych wspomagających pracę enzymu i unikanie zanieczyszczeń innymi jonami.

Procedura:

1. Składanie mieszanin reakcyjnych (na 20µl):

woda

DNA 1-2 µl

bufor 2 µl

enzym 0,3 µl

2. Inkubacja w łaźni wodnej w 37 °C 1,5 godziny

3. Trawione DNA przechowywać w -20 °C.