INŻYNIERIA GENETYCZNA
Temat: Trawienie plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi.
Zagadnienia:
Enzymy restrykcyjne
Zasady trawienia plazmidowego DNA
Ogólne zasady trawienia plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi:
Teoretyczna wydajność trawienia: 1U (unit) enzymu trawi w ciągu 1 godziny 1µg DNA
Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się buforu dla enzymów w stosunku 1:10 do końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej
Ilość enzymów nie powinna przekraczać 10% objętości mieszaniny reakcyjnej
Próbek nie należy worteksować.
DNA można trawić jednocześnie kilkoma enzymami. Należy wtedy dobierać bufor w taki sposób, aby był on kompatybilny ze wszystkimi używanymi enzymami.
Większość enzymów dobrze trawi DNA w temperaturze 37°C
Niektóre enzymy wykazują tzw. „star activity”. Aktywność „star” polega obniżeniu lub na częściowym zaniku specyficzności enzymu, co objawia się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne. Najczęstszy zanik specyficzności polega na cięciu sekwencji różniących się od restrykcyjnej jednym nukleotydem, cięciu sekwencji krótszych o nukleotydy początkowe. Aktywność star można redukować stosując się do zaleceń producenta enzymów, takich jak:
używania enzymu w minimalnej ilości potrzebnej do pocięcia danej ilości DNA (zmniejsza ilość glicerolu w próbce oraz zapewnia odpowiedni stosunek enzymu do DNA, wydłuża jednak czas reakcji);
pozbycie się śladów odczynników organicznych (szczególnie etanolu używanego powszechnie do izolacji DNA);
zapewnienie odpowiednio wysokiej lub specjalne zawyżanie siły jonowej (niektóre enzymy są jednak inhibowane przez wysoką siłę jonową);
utrzymywanie pH reakcji w okolicach 7,0 (wyższe pH reakcji bywa efektem używania niewystarczająco czystego DNA izolowanego metodą lizy alkalicznej);
używanie Mg2+ jako jonów dwuwartościowych wspomagających pracę enzymu i unikanie zanieczyszczeń innymi jonami.
Procedura:
Składanie mieszanin reakcyjnych (na 20µl):
woda
DNA 1-2 µl
bufor 2 µl
enzym 0,3 µl
Inkubacja w łaźni wodnej w 37 °C 1,5 godziny
Trawione DNA przechowywać w -20 °C.