OZNACZANIE ZAWARTOŚCI BIAŁKA W MLEKU METODĄ KJELDAHLA

Jednym ze sposobów oznaczania zawartości białka w produktach spożywczych jest analiza ilości azotu i przeliczanie jej na zawartość białka. Białka występujące w organizmach roślinnych i zwierzęcych stanowią 50% suchej masy komórki. W ich skład wchodzi węgiel (51%), wodór (7%), tlen (24%), azot (16%) a także siarka (1%), fosfor (0.4%) i inne pierwiastki (0,6%). Ilość azotu zależy od specyficznego składu poszczególnych białek dlatego mnożniki białkowe różnią się od siebie nieznacznie i wynoszą, np.:

- białka żółtka jaja kurzego 6,67

- białka mleka 6,38

- białka mięsa 6,25

- białka żyta, pszenicy, grochu 5,70.

Aby ujednolicić sposób obliczania zawartości białka korzystając z ilości azotu wprowadzono jeden przelicznik równy 6.25.

Zasada oznaczania azotu metodą Kjeldahla polega na przeprowadzeniu azotu zawartego w związkach organicznych w amoniak w wyniku mineralizacji za pomocą stężonego kwasu siarkowego. Wytworzony NH₃ z nadmiarem kwasu siarkowego(VI) tworzy (NH₄)₂SO₄. Do pozostałości po mineralizacji dodaje się wodorotlenku sodu w celu wydzielenia amoniaku, który oddestylowuje się z parą wodną do odbieralnika zawierającego kwas solny lub siarkowy(VI) o znanym stężeniu i znanej objętości. Nadmiar kwasu odmiareczkowuje się roztworem wodorotlenku sodu.

Aparatura i odczynniki

• kolby Kjeldahla,

• zestaw Parnasa-Wagnera

• H₂SO₄ stężony; 0,1 mol/dm³

• CuO

• H₂O₂ 30 %

• NaOH około 33% (m/m) - rozpuścić 250g NaOH w 500 ml wody destylowanej

• NaOH 0,1 mol/dm³

• Fenoloftaleina

• Wskaźnik mieszany Tashiro

I. Mineralizacja

Odważyć na wadze technicznej około 1 gram produktu spożywczego (odtłuszczone mleko w proszku) i przenieść ilościowo do kolby Kjeldahla, dodać 0,1 gram CuO, lekko zwilżyć wodą destylowaną, zalać 5 ml stężonego H₂SO₄ i pozostawić na 24 h. Dodać 10 ml 30 % H₂O₂ i pozostawić na około 1-2 godziny. Mineralizować ostrożnie ogrzewając w płaszczu grzejnym do pojawienie się białych dymów. Kolbę pozostawić do ostygnięcia.

II. Alkalizowanie roztworu po mineralizacji i odpędzanie amoniaku z parą wodną za pomocą zestawu Parnasa-Wagnera

Pozostałość po mineralizacji w kolbie Kjeldahla rozcieńczyć (ostrożnie) 30 cm³ wody destylowanej i dodać 4-5 kropli fenoloftaleiny. Roztwór przelać za pomocą lejka (9) do kolby (1) zestawu. Kolbę i lejek przemyć trzykrotnie używając po 10 cm³ wody destylowanej. Do odbieralnika (3) odmierzyć nadmiar roztworu kwasu siarkowego(VI) w ilości i o stężeniu podanym w tabeli 1 i dodać 4-5 kropli wskaźnika mieszanego. Odbieralnik ustawić pod chłodnicą (5) w taki sposób, aby jej wylot był zanurzony w kwasie. Do próby dodać przez lejek roztwór wodorotlenku sodu 33% do zabarwienia fenoloftaleiny (około 25 cm³) i dodać jeszcze 10 cm³ nadmiaru. Do kolby okrągłodennej (2) wlać wodę destylowaną (połowę objętości kolby) za pomocą lejka (10), przy otwartym kranie (7). Pod wylot łapacza kropel (6) ustawić odbieralnik (4). Kolbę okrągłodenną (2) ogrzewać, a kiedy woda zacznie wrzeć przystąpić do alkalizowania roztworu w kolbie (1). Zamknąć krany (7) i (8) i prowadzić destylację z parą wodną, z równoczesnym odpędzaniem amoniaku. Po około 45 minutach obniżyć odbieralnik, dokładnie wytrzeć końcówkę odbieralnika i kroplę destylatu nanieść na czerwony papierek lakmusowy. Jeśli barwa nie zmieni się na niebieską zakończyć destylację. Wyłączyć płaszcz grzejny. W kolbie (2) na skutek oziębienia wytwarza się podciśnienie, powodujące wciągnięcie pozostałości z kolby (1) do łapacza kropel (6). W celu opróżnienia zestawu szybko ć kran (8) i zebrać niepotrzebną pozostałość w odbieralniku (4). Roztwór z odbieralnika (3) odstawić do miareczkowania. Zestaw przepłukać kilkakrotnie wodą destylowaną.

III. Miareczkowanie nadmiaru H₂SO₄

Znajdujący się w odbieralniku roztwór siarczanu(VI) amonu i nadmiar kwasu siarkowego(VI) miareczkować roztworem sodu (0.1 mol/dm³) do zmiany barwy wskaźnika mieszanego z fioletowoczerwonej na żółtą. Równolegle wykonać próbę porównawczą z takimi samymi odczynnikami i w takich samych warunkach lecz bez badanej próbki destylując w identyczny sposób wodę destylowaną (50cm³ H₂SO₄ 0,1 M + 50cm³ H₂O)

Sposób obliczeń

X =

Gdzie:

V_B - objętość roztworu H₂SO₄ odmierzona do odbieralnika [cm³]

V₂ - objętość roztworu NaOH (0,1 mol/dm³) zużyta na zmiareczkowanie próby [cm³]

V₃ - objętość roztworu H₂SO₄ odmierzona do odbieralnika, próby porównawczej [cm³]

V₄ - objętość roztworu NaOH (0,1 mol/dm³) zużyta na zmiareczkowanie próby porównawczej [cm³]

m_p - masa odważki próby [g]

0,0014 - zawartość azotu odpowiadająca 1 cm³ roztworu miareczkującego [g/cm³]

Zawartość białka (y) w mleku obliczyć w procentach masowych, wg wzoru:

y = 6,38*x

Tabela 1. Objętości i stężenia H₂SO₄ stosowanego do pochłaniania amoniaku

Masa azotu całkowitego w odważce [mg]	Stężenie H2SO4 [mol/dm^3]	objętość H2SO4 [cm^3]
0-30 31-50 51-65	0,1	25 40 50
66-80 81-100 101-125	0,2	35 40 50
126-170 171-200 201-235	0,5	25 30 35

Sprawozdanie

Sprawozdanie powinno zawierać krótki wstęp teoretyczny, opis wykonywanego ćwiczenia, obliczenia zawartości białka w mleku wraz ze statystyką oraz wnioski.

Pracownia specjalistyczna - dr Aneta Jastrzębska

Oznaczanie zawartości białka metodą Kjeldahla

---