Ćwiczenia nr 9
OTRZYMYWANIE I ANALIZA ELEKTROFORETYCZNA DNA PLAZMIDU BAKTERYJNEGO
WSTĘP O PLAZMIDZIE
Cechy plazmidu wykorzystane na ćwicz to:
Małe
Brak wolnych końców
Wiele kopii
(istnieje też plazmid liniowy, szczególnie, gdy w komórce występuje DNA liniowe)
Extra cechy na plazmidzie:
Zdolność do syntezy toksyn
Zdolność do syntezy enzymów pozwalających wykorzystać jako źródło C związki trudno degradowalne
Geny odporności na antybiotyki
Zdolność do syntezy enzymów restrykcyjnych i modyfikacyjnych
Istnieje plazmid F (kilka tys par zasad - bp) - zdolność do integrowania w chromosom bakteryjny = EPISOM.
Są też inne koliste cząsteczki DNA, w chloroplastach i mitochondriach, nie będące plazmidami - DNA chlpl, DNA mt.
Wielokopijność to zdolność plazmidu do tworzenia wielu kopii w komórce. Patrząc do tabelki nr3 mamy przykład pUC, który jest zmutowanym plazmidem pMB1. Mutacja polegała na zmianie jednego nukleotydu w obrębie ori, co wyłączyło kontrolę nad regulatorami liczby kopii i przekształcił się w pUC i pBR322. Te dwa ostatnie mutanty nie występują naturalnie w przyrodzie.
Ale, po co robimy wiele kopii?? To ułatwia izolację plazmidów wykorzystywanych w laboratorium do badań w domenie m.in. medycyny i biotechnologii.
W komórce eukariotycznej może występować plazmid bifunkcjonalny, posiadający 2 grupy cech.
Pierwsza część (bakt) odpowiada za namnożenie wraz z cechami extra
Druga część odpowiada za funkcjonowanie w komórce eukar:
posiada elementy regulujące transkrypcję i eukar ori (cechy uzyskane od wirusów).
Musi mieć również jakiś marker, żebyśmy mogli odróżnić tą specjalną kom eukar od innych. Są to np. uromycyna i zeomycyna. (Są też specjalne markery dla drożdży).
Na ćwicz zajmujemy się pBR322, który w komórce występuje w pewnym zakresie: 0,1 - 5 fg. Dlaczego taka rozbieżność? Normalnie jest go 50x mniej od genoforu, stąd 0,1 fg. Ale to dość mało do izolacji - przeprowadzamy amplifikację chloramfenikolem. Polega to na tym, że sztucznie zwiększamy ilość kopii do 1000 - 2000 na kom.
Namnażamy bakt na podłożu selekcyjnym z TET i AMP (antybiotyki), żeby wyrosły nam tylko bakt na nie odporne.
↓
działamy chloramfenikolem, który zatrzymuje syntezę białek
↓
stop podziałów genoforu
plazmid może się dalej replikować, bo ma system oparty na białkach stabilnych
↓
po kilkunastu h otrzymujemy 1-2 tys kopii + korzystne proporcje, bo nie potrzebujemy DNA genoforu ani białek w dużych ilościach (zależy nam tylko na plazmidzie)
WYKONANIE ĆWICZENIA
odwirowujemy pożywkę, której nie potrzebujemy
zawieszamy w GTE: glc - zapewnia odpowiednie ciśnienie osmotyczne
TRIS - bufor zapewnia odpowiednie pH. Wiadomo, że w różnym pH białka i inne cząst mogą zmieniać kształt/rozpuszczalność
Wersenian sodowy - unieczynnia nukleazy zabierając im kofaktor - jony Mg 2+
Zawieszając komórki w GTE zwiększamy dostępność ich dla dodawanych później substratów.
dodajemy SDS i NaOH:
sds - otwiera błony i wnętrze komórki wypływa
- opłaszcza białka, które otrzymują ładunek (-)
NaOH - zwiększamy pH denaturacja DNA chromosomowego. Jest
ono o wiele większe od plazmidu. Nici się rozplatają i są fragmentowane na długie liniowe odcinki, co NIE powoduje wytrącania z roztworu.
plazmid nawet jak się zdenaturuje to i tak nie może się do końca rozwinąć, bo nie ma wolnych końców. Nici się rozdzielają, ale pozostają blisko siebie. (teoretycznie DNA też mogłoby tworzyć takie oczka, ale jest zdecydowanie za długą cząst, żeby przetrwał w takich warunkach w takiej postaci)
RNA może być bardzo łagodnie hydrolizowany, ale to są słabe warunki
nic nam się nie wytrąca, nic nie obserwujemy
nie możemy mieszać za mocno, bo DNA chr zostanie zdenaturowane na zbyt małe odcinki, co przeszkodzi nam później
dodajemy AcK (octan potasu) zmniejszamy pH do 7.
DNA się wytrąca. Dlaczego skoro pH jest i tak dość wysokie jak na zmuszenie DNA do wytrącenia? Renaturacja jest możliwa, gdy powolutku odejmujemy czynnik denaturujący (temp, pH). Wtedy DNA ma czas na znalezienie komplementarnych odcinków i dopasowanie odpowiednio końców, co zajmuje dużo czasu(efekt suwaka). Jeśli czynniki odejmiemy szybko (jak tu - skokowa zmiana pH) to dopasowanie jest błędne i tworzy wielki niedopasowany agregat, który się strąca.
Gdybyśmy za dużo mieszali to odc. DNA byłyby za małe i nie wytrącałyby się takie ładne agregaty.
Plazmid ma już etap dopasowywania końców za sobą, bo tak naprawdę nigdy się one nie rozdzieliły, więc łatwiej renaturuje i się nie wytrąca.
Wytrąca się RNA wysokocząsteczkowe - 16S rRNA i 23S rRNA
potas
Strąca kompleksy SDS-białko
SDS-B + K+ SDS-B-K ↓
Wirowanie
OSAD: DNA chr
Wysokocząst RNA
Białka
Resztki niezlizowanych bakterii
SUPERNATANT:
DNA plazmidowe
Niskocząst RNA
Substraty dodawane przez nas
Metabolity komórkowe (sole mineralne itp.)
nasze DNA bardzo rozcieńczone i w towarzystwie rzeczy, które hamują enzymy restrykcyjne.
Musimy prowadzić dalsze oddzielanie.
dodajemy etanol
Wirujemy.
etanol wytrąca DNA plazmidowe i niskocząsteczkowe RNA. Nie powinno być już zanieczyszczeń pozostałymi związkami, ale było ich tak dużo (roztwór nasycony) i ich część też się wytrąca.
Można zastosować zamiast etanolu izopropanol lub aceton. Izopropanol jest lepszy pod względem ekonomiczności: proporcje zużycia etanolu : DNA to 2,5 : , izopropanolu 0,7 : 1. Jednak izopropanol jest mniej lotny, więc trudniej go usunąć z probówki.
Supernatant wyrzucamy
OSAD CZYSTY DNA/RNA JEST NIEWIDOCZNY. Jeśli coś widać, to są to nasze zanieczyszczenia.
dodajemy 70% etanolu
Wirowanie.
Ewentualne sole i domieszki zostają wypłukane i są w supernatancie.
DNA/RNA zostaje w osadzie.
Mamy teraz już tylko kwasy nukleinowe, więc możemy przystąpić do elektroforezy.
ELEKTROFOREZA
Przed rozpoczęciem elektrfr trzeba się pozbyć całego etanolu!!!! - W jego obecności DNA/RNA się trudno rozpuszczają, a przecież do wykonania elektrfr należy je mieć w formie rozpuszczonej. Poza tym trudniej się nanosi na żel.
DNA powinien opaść na dno studzienki. Żeby to się udało musimy go dodatkowo obciążyć. Etanol zwiększa gęstość cieczy i DNA w jego obecności może wypłynąć na wierzch i do stracimy. Dlatego dodatkowo wykorzystujemy ORANŻ G (barwnik +glicerol), który nam obciąży DNA.
CO TO JEST? Ruch cząsteczek obdarzonych ładunkiem do odpowiedniej elektrody w polu elektrycznym o stałym natężeniu.
Kwasy nukleinowe jako polianiony (PO32-)n Anoda
Nasze cząsteczki różnią się kształtem i wielkością (białka w rozdziale elektrofr różnią się dodatkowo ładunkiem). To jest podstawą rozdziału.
Proces rozdziału wspomagamy utrudniając drogę cząsteczkom przez wprowadzenie zawady przestrzennej: żelu agarozowego. Gdybyśmy wrzucili mieszaninę kwasów nukleinowych razem „w kupie” to wszystkie przesuną nam się w str anody jednocześnie. Ale na żelu muszą się przeciskać i to zwiększa różnicę w zdolności migrowania. Tym trudniej im większy stopień usieciowania.
Jak można kontrolować stopień usieciowania? Zwiększając stężenie agarozy, ale tylko do poziomu 2-3%. Dalej używamy poliakrylamidu. To pozwala na rozdzielenie coraz mniejszych związków.
Tabela nr 8 pokazuje wykres wzorcowy dla oznaczania Dna liniowego. Ten różni się tylko długością i można wyznaczyć zależność liniową między wielkością i długością migracji. Dla plazmidu to nie działa, bo oprócz wielkością, różni się jeszcze kształtem.
W elektrofr mamy do czynienia z 2 substancjami pomarańczowymi: ORANŻ G I BROMEK ETYDYNY.
ORANŻ G - mniejszy od niskocząsteczkowego RNA i też anion - migruje najszybciej z całego towarzystwa i wyznacza czoło elektrofr - widoczny. Jeśli do końca żelu, to kwasy są już db rozdzielone (jeżeli mamy do czynienia z mieszaniną różniącą się znacząco wielkością składników).
BROMEK ETYDYNY - KARCYNOGEN!!!!! Jest to nasz wywoływacz. Po skończonej elektrofr dyfunduje w żel i tworzy kompleksy z kwasami nukleinowymi. Ze względu na budowę aromatyczną (duża zawartość pierścieni aromatycznych) wykazuje absorpcję w zakresie UV.
Rozdzielone zw. po elektrofr przez krótki czas zostają w tym samym miejscu, potem rozdyfundowują - trzeba sprawnie wykonywać czynności.
Co możemy zobaczyć na żelu??
formy ccc-/ ccc+ plazmidu
negatywne superskręty(-) lub pozytywne (+). Przekształcenie jednej formy w drugą następuje pod wpływem zwiększenia stęż bromku etydyny, który interkaluje w obręb helisy i powoduje rozkręcanie superskrętów. Dalsze zwiększanie stężenia prowadzi do przeprowadzenia plazmidu w formę ccc+. Dalsze dodawanie nie zmienia już kierunku skręcania, a więc również kierunku migracji na żelu (forma kolista idzie wolniej od ccc).
forma oc plazmidu
otwarta kulista, wygląda jak plazmid. Wytwarza się pod wpływem działania nukleaz, lub w wyniku uszkodzenia mechanicznego
forma liniowa plazmidu
można ją otrzymać w wyniku działania enzymów restrykcyjnych
niskocząsteczkowe RNA
mieszanina różnych niskocząsteczkowych RNA idzie jako prostokąt, ale potem plama, co jest wynikiem stałego działania prądu i rozdyfundowania.
NUKLEOTYDY - ich nie widać, bo nie mamy dla nich wywoływacza. Same nie potrafią wiązać br.et. migrują bardzo szybko. Powstają przez działanie RNAzy. Mogła nie zadziałać skutecznie, jeśli stężenie jej było niewystarczające, lub gdy pozostały resztki etanolu.
DNA chromosomowe
mogły zostać, jeśli za silnie wstrząsaliśmy i powstały bardzo krótkie odcinki, nie mogące renaturować do strącalnych agregatów.
Dla DNA chr nie ma znaczenia, gdzie jest br.et. możemy wprowadzić go do probówki z kwasami, może być w żelu lub w płynie do elektroforezy.
UWAGI
Można zastosować chromatograf jonowymienny do rozdziału DNA od RNA.
Aby określić wielkość plazmidu, trzeba by go było przeprowadzić w formę liniową i wykorzystać wykres wzorcowy.