Laboratorium z biotechnologii

Ćwiczenie 11

Temat:

Biosynteza lizyny.

Data wykonania ćwiczenia: 02.06.2009 r.

2. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było wyznaczenie: dynamiki wzrostu biomasy, dynamiki zużycia glukozy oraz nagromadzenia lizyny w procesie biosyntezy L-lizyny przy użyciu auksotroficznego mutanta Corynbacterium glutamicum. W ćwiczeniu zostały oznaczone pH i temperatura wpływające na trwałość lizyny w płynach pofermentacyjnych w obecności lub bez dodatku stabilizatora.

3. Wykonanie ćwiczenia

Biosynteza L-lizyny była prowadzona przy użyciu auksotrofa Corynebacterium glutamicum, w podłożu zawierającym jako źródło C glukozę, a jako źródło N dodane były sole amonowe. Hodowla była prowadzona w kolbach na wstrząsarce.

1. . Dynamika wzrostu szczepu

Pobieramy 1 ml zawiesiny komórek wprowadzamy do probówki i odpowiednio rozcieńczamy wodą destylowaną. Próby dokładnie mieszamy dla uzyskania równomiernej dyspersji masy komórkowej w płynie. W pobranych próbach z odpowiednich godzin hodowli mierzymy absorbancję na spektrofotometrze przy długości fali λ= 540 nm wobec próby kontrolnej którą jest woda destylowana.

2.2. Dynamika zużycia glukozy

Przygotowujemy odpowiednie rozcieńczenia glukozy do krzywej wzorcowej, tak aby stężenie cukru wynosiło 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 µg/ml. Do probówek wprowadzamy po 1 ml odpowiednio rozcieńczonej glukozy i po 1 ml odczynnika miedziowego. Zawartość probówek dokładnie mieszamy i wstawiamy na 10 minut do wrzącej łaźni wodnej. Po ochłodzeniu dodajemy po 1 ml odczynnika Nelsona i 2 ml H₂O. Mierzymy absorbancję przy długości fali 520 nm wobec próby odczynnikowej w której zamiast cukru była woda destylowana.

Przygotowujemy odpowiednie rozcieńczenia płynu pohodowlanego:

10 x2000

20 x2000

30 x500

40 x200

50 x200

60 x200

70 x200

Do probówek wprowadzamy po 1 ml odpowiednio rozcieńczonego supernatantu i po 1 ml odczynnika miedziowego. Zawartość probówek dokładnie mieszamy i wstawiamy na 10 minut do wrzącej łaźni wodnej. Po ochłodzeniu dodajemy po 1 ml odczynnika Nelsona i 2 ml H₂O. Mierzymy absorbancję przy długości fali 520 nm wobec próby odczynnikowej użytej do wyznaczenia krzywej wzorcowej. Na podstawie krzywej wzorcowej obliczamy stężenie zużytej glukozy w próbach.

Tabela 1. Wyniki pomiarów dla krzywej wzorcowej

Ilość glukozy [µg/ml]	Asorbancja
10	0,17
20	0,20
30	0,23
40	0,34
50	0,46
60	0,55
70	0,75
80	0,83

Tabela 2. Oznaczenie cukrów:

czas hodowli [h]	rozcieńczenie	absorbancja	Z krzywej wzorcowej [µg glukozy/cm3]	Ilość cukru [µg/cm3]	Ilość cukru [g/dm^3]
10	2000	0,31	30	60 000	60
20	2000	0,26	32	64 000	64
30	500	0,20	20	10 000	10
40	200	0,19	19	38 00	3,8
50	200	0,23	23	46 00	4,6
60	200	0,21	21	42 00	4,2
70	200	0,16	16	32 00	3,2

Przykładowe obliczenie dla 40 godzin hodowli:

A - absorbancja

X - ilość glukozy [g/ dm³]

R. - rozcieńczenie

Z - ilość cukru odczytana z krzywej wzorcowej [μg/cm³]

1. Dynamika nagromadzenia lizyny

Do probówek zawierających po 3 ml buforu fosforanowego wprowadzamy wzorcowy roztwór lizyny w ilości 2, 4, 6, 8, 10, 12 µl. Następnie dodajemy po 50 ml roztworu 2-merkaptoetanolu i po 50 µl roztworu diacetylobenzenu. Próby mieszamy i po upływie 10 minut mierzymy natężenie fluroscencji przy długości fali światła wzbudzającego 365 nm i długości fali światła emitowanego 445 nm. Sporządzamy krzywą wzorcową zależności intensywności fluorescencji od stężenia lizyny.

Próby płynu pofermentacyjnego, z którego usunięto biomasę rozcieńczamy 20-krotnie wodą destylowaną i oznaczamy lizynę w sposób analogiczny jak dla roztworów wzorcowych. Do analizy pobieramy 10 µl rozcieńczonej badanej próby.

1. Wpływ pH i temperatury na trwałość lizyny w płynach pofermentacyjnych w obecności lub bez dodatku stabilizatora

Przygotowujemy próby płynów pofermentacyjnych o zróżnicowanych wartościach pH: 3, 7, 12. Próby dzielimy na dwie części. Do jednej dodajemy pirosiarczanu sodu w ilości 0,15 % w stosunku o objętości płynu, a drugą pozostawiamy bez zmian. Wszystkie próby przenosimy do wrzącej łaźni wodnej na okres jednej godziny. Ochłodzone próby rozcieńczamy 20- krotnie wodą destylowaną i oznaczamy w nich zawartość lizyny.

3. Opracowanie wyników

Tabela 3. Zestawienie wyników dynamiki wzrostu szczepu, wykorzystania glukozy i nagromadzenia lizyny w podłożu

Wzrost szczepu		Zużycie glukozy		Nagromadzenie lizyny
Czas hodowli [h]	Sucha biomasa [g/dm^3]	Czas hodowli [h]	Ilość cukrów [g/dm^3]	Czas hodowli [h]	Ilość lizyny [g/dm^3]
2	0,4	0	65	10	<0,5
4	1	10	60	20	<0,5
6	4,4	20	64	30	14
8	4,4	30	10	40	16,5
10	4,6	40	3,8	50	17
14	3,8	50	4,6	60	18
16	4,9	60	4,2	70	19,5
18	5	70	3,2
20	4,2

Tabela 4. Zestawienie wyników dla wpływu pH i temperatury na trwałość lizyny w płynach pofermentacyjnych w obecności lub bez dodatku stabilizatora.

pH	Bez stabilizatora		Z dodatkiem stabilizatora
		Ilość lizyny [g/dm^3]	Strata [%]	Ilość lizyny [g/dm^3]	Strata [%]
3 7 12	19,5 19 17,8	0 2,56 8,72	19,5 19,3 18,1	0 1,03 7,18

Przykładowe obliczenia:

Strata w gramach:
19,5 g - 19 g = 0,5 g

Strata procentowa:

4. Wnioski

• Z wykresu 1 odczytujemy, że szczep rósł do 20 godzin, później wzrost jest zminimalizowany z powodu wyczerpania substancji niezbędnych do wzrostu (treonina). Glukoza, jako źródło węgla w pożywce, degradowana jest najszybciej w początkowym okresie wzrostu szczepu, po czym spada po 30 godzinach hodowli. Wraz z czasem hodowli rośnie ilość lizyny produkowana przez szczep auksotroficznego mutanta Corynebacterium glutamicum.

• Wraz ze wzrostem pH maleje ilość lizyny w płynie pofermentacyjnym. Większe straty są w przypadku braku stabilizatora, z dodatkiem stabilizatora płyn pofermentacyjny, w którym jest lizyna, jest trwalszy . Dodawany do probówek pirosiarczan sodu chroni lizynę przed zniszczeniem przez różne czynniki (pH, temperaturę), straty w porównaniu z próbami bez stabilizatora są mniejsze.

---