Ćwiczenie 4

Izolacja plazmidu do klonowania z wykorzystaniem zestawów
do izolacji DNA (miniliza), trawienie i elektroforeza plazmidu.

Materiał do kolokwium - instrukcja, metody izolacji DNA plazmidowego, klonowanie

Metoda ta jest wykorzystywana przede wszystkim do izolacji plazmidowego DNA z wielu małych hodowli. Może być wykorzystywana do identyfikacji klonów.

Procedura opiera się na tzw. metodzie alkalicznej, w której roztwory zasadowe użyte są
do denaturacji DNA, a następnie wykorzystując różnice w czasie renaturacji (koliste plazmidy, zawierające sczepione ze sobą nici DNA renaturują znacznie szybciej, niż DNA chromosomu bakteryjnego) można oczyścić DNA plazmidowe od DNA chromosomowego. Roztwór GL3 zobojętnia środowisko, a równocześnie powoduje wytrącenie DNA chromosomowego i białek. Istotne jest w tej metodzie przestrzeganie czasu trwania denaturacji alkalicznej, ponieważ zbyt długie przetrzymywanie DNA w roztworach zasadowych powoduje nieodwracalną denaturację. Takie DNA nie poddaje się reakcjom trawienia lub ligacji.

Zasada działania kolumny opiera się na zdolności DNA do adsorpcji na powierzchni krzemionki w obecności związków chaotropowych (denaturujących białka,
np. chlorowodorek guanidyny). Po przemyciu czysty DNA jest wymywany buforami o niskiej sile jonowej lub wodą.

Materiały i odczynniki:

Całonocna hodowla bakteryjna w 2 ml pożywki z antybiotykiem, schłodzona w lodzie
i odwirowana w temp. pokojowej, zamrożona

Kolumna do izolacji DNA (pojemność 20 μg DNA)

Roztwór L1 (do zawieszania bakterii: 50 mM Tris:HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA; 100 ug/ml RNaza A)

Roztwór L2 (do lizy bakterii: 0.2 N NaOH; 10% SDS)

Roztwór GL3 (zobojętniający: 3 M CH₃COOK; 5% CH₃COOH; 8 M chlorowodowek guanidyny)

Roztwór W (do przemywania kolumny)

Roztwór A1 (do przemywania kolumny)

H₂O (do wymywania DNA z kolumny)

Mikrowirówka

Termoblok

Enzym restrykcyjny EcoRI (10 U/μl)

Bufor do trawienia EcoRI 10x: (0.5 M Tris-HCl pH 7.5; 0.1 M MgCl₂; 1 M NaCl;
0.2% Triton X-100; 1mg/ml albuminy)

Agaroza (naważka 0.24 g)

Bromek etydyny (20 mg/ml)

Bufor LB do obciążania DNA (0.25% błękit bromofenolowy; 0.25% cjanol ksylenu;
30% glicerol)

Marker do DNA (DNA  /HindIII)

Bufor TAE do elektroforezy 50x (0.2 M Tris:octan; 0.05 M EDTA)

Aparat do elektroforezy horyzontalnej

Transiluminator

Wykonanie

1. Osad bakterii z całonocnej hodowli należy zawiesić dokładnie w 200 μl roztworu L1, dodać 200 μl roztworu L2 i wymieszać delikatnie przez odwracanie probówki 5-6 razy. Inkubować 3 min. w temperaturze pokojowej.

2. Dodać 400 μl roztworu GL3 i obracać probówkę delikatnie 6-8 razy. Odwirować
   przy maksymalnych obrotach przez 10 minut.

3. Supernatant nanieść na kolumnę i wirować 1 minutę na maksymalnych obrotach.

4. Przefiltrowany roztwór odrzucić, kolumnę przemyć 500 μl roztworu W, wirować
   1 minutę na maksymalnych obrotach, przefiltrowany roztwór odrzucić.

5. Przemyć kolumnę 700 μl roztworu A1, wirować 2 minuty na maksymalnych obrotach, przefiltrowany roztwór odrzucić.

6. Do elucji DNA przenieść suchą kolumnę do nowej probówki (podpisanej - DNA plazmidowe) i dodać 60 μl H₂O bezpośrednio na membranę. Inkubować 3 minuty
   w temperaturze pokojowej i odwirować 1 minutę na maksymalnych obrotach. Kolumnę wyrzucić.

7. 4 μl DNA zawiesić w 200 μl H₂O, zmierzyć ilość DNA spektrofotometrycznie, wykorzystując wzór:
   C [μg/μl] = (A₂₆₀ -A₃₂₀) x rozcieńczenie x 0.05
   W dzienniku laboratoryjnym musi być zapisane stężenie DNA plazmidowego oznaczone na ćwiczeniach.

8. Trawienie plazmidu enzymem EcoRI - Sporządzić mieszaninę do trawienia:
   DNA 0,5 μg
   10x bufor do EcoRI 2 μl
   EcoRI 0,5 μl (dodaje prowadzący ćwiczenia)
   H₂O do 20 μl
   Trawić w temperaturze 37⁰C, 1 godzinę

9. W tym czasie z naważki agarozy przygotować i wylać żel (0.8%, 30 ml)
   i przygotować preparat DNA nietrawionego:
   DNA 0.25 μg + H₂O do 10 μl + 2 μl Buforu LB

10. Po trawieniu nanieść próby DNA nietrawionego i DNA potrawionego EcoRI (10 μl + 2 μl buforu LB). Elektroforezę prowadzić 15-30 minut.

11. Preparaty nietrawionego i trawionego DNA należy dokładnie podpisać nazwą grupy, sekcji i datą, a następnie oddać do zamrożenia - będą wykorzystywane na następnych ćwiczeniach.

---