CYTOLOGIA-cw5, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia


CYTOLOGIA - ćw. 5 06.05.2011r.

Rozmaz możliwy do oceny:

Rozmaz nie nadaje się do oceny:

IMMUNOCYTOCHEMIA (ICC)

1. Rodzaje materiału do reakcji immunocytochemicznej

2. W badaniach ICC należy

3. Warunki umożliwiające prawidłowo wykonane ICC:

4. Utrwalenie materiału

Warunki umożliwiające prawidłowe wykonanie ICC

5. Immunocytochemia

1) Utrwalenie materiału

2) Uwodnienie (roztwory buforowane pH ok.8,0; nawadnianie nie powinno trwać dłużej niż 1minutę)

3) Odkrywanie antygenów (tylko IAC)

3) Zahamowanie endogennej aktywności enzymatycznej

Istotna przyczyna artefaktów - obecność w analizowanych komórkach enzymów o takiej samej aktywności, jak enzym znakujący użyte przeciwciało.

Zahamowanie aktywności peroksydacyjnej - inkubacja skrawków w metanolowym lub wodnym roztworze H2O2.

4) Blokowanie miejsc nieswoiście wiążących przeciwciała

Krótkotrwała inkubacja materiału, przed reakcją immunoenzymatyczną, z białkiem pochodzącym od innego zwierzęcia niż to od którego uzyskano swoiste przeciwciało.

- np. albumina surowicy bydlęcej (BSA)

- surowica zwierzęcia nieimmunizowanego

Blokowanie nie zapobiega tworzeniu się mocnych, specyficznych wiązań pomiędzy antygenem a zastosowanym przeciwciałem !!!

5) Lokalizacja

I etap - inkubacja komórek ze swoistym, nieznakowanym przeciwciałem

II etap - inkubacja komórek z drugim, znakowanym przeciwciałem, skierowanym przeciwko immunoglobulinie zwierzęcia, od którego uzyskano pierwsze przeciwciało

Złożoność procedury zwiększa jednak możliwość wystąpienia reakcji niespecyficznych.

6) Wykrywanie enzymów znacznikowych

Uzyskany w wyniku reakcji barwny - nierozpuszczalny produkt wyznacza miejsce lokalizacji kompleksu wykrywanego antygenu z przeciwciałem.

- Wykrywanie aktywności peroksydazy chrzanowej - metoda z użyciem 3,3'-diaminobenzydyną (DAB)

Prowadzi do wytworzenia brązowego polimeru nierozpuszczalnego w wodzie, alkoholu ani rozpuszczalnikach organicznych, wykazującego zdolność do wiązania metali ciężkich (w badaniach na poziomie mikroskopu elektronowego).

Dodanie soli miedzi, kobaltu, niklu, lub złota do płynu inkubacyjnego z DAB powoduje wzmocnienie intensywności reakcji i zmienia barwę brązowego produktu na niebieski lub czarny, co pozwala niekiedy, zwłaszcza przy słabej reakcji na zwiększenie jej wyrazistości.

6. Etapy reakcji ICC

Blokowanie aktywności endogennej peroksydazy

woda utleniona 3%

woda redestylowana

PBS

Blokowanie tła

BSA

płukanie w PBS

Inkubacja z przeciwciałem I

I przeciwciało

PBS

Inkubacja z przeciwciałem II

zestaw EnVision+

PBS

Barwienie DAB+

Substrate Chormogen Solution DAB+

woda bieżąca

Podbarwianie jąder komórkowych

hematoksylina Mayera

bieżąca woda

Odwodnienie

alkohol 80%

alkohol 90%

alkohol 96%

alkohol 99,8%

aceton

Prześwietlenie

ksylen I

ksylen II

ksylen III

ksylen IV

Zamknięcie w medium

7. Reakcje kontrolne

- stanowią gwarancję wiarygodności wyników procedury,

- maja na celu potwierdzić swoistość stosowanej metody i wykryć wszelkie artefakty.

- przeprowadzana na wybranej, modelowej tkance zawierającej wykrywany antygen

- reakcja wskazuje na prawidłowość stosowanej procedury

1) z pominięciem przeciwciała swoistego:

Wykrywa nieswoiste wiązanie przez tkankę drugiego przeciwciała/ i lub endogenną aktywność enzymatyczną.

2) z pominięciem swoistego przeciwciała i wtórnego preciwciała

Zabarwienie tkanki świadczy o endogennej aktywności enzymatycznej w badanym materiale, lub o niespecyficznym wiązaniu przez tkankę kompleksów enzym-antyenzym.

3) Reakcja z zastąpieniem swoistego przeciwciała nieswoistą surowicą

surowica nieswoista, czyli pochodzącą od zwierzęcia (tego samego gatunku), ale nie poddanego immunizacji.

Ujawnia nieswoiste wiązanie przeciwciał z badaną tkanką.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Cytologia-ćw-8.04.2011, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
CYTOLOGIA ćw4, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
cyto wejścia 2010, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
Barwienie w cytodiagnostyce, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
cytologia moczu, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
cytologia - w I - 25.03, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
co to sonda i jak ja znakujemy, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
koło1-materiał, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Immunologia, Immunohematologia
chemia kliniczna-wykad 2, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna, semestr V
lKoło, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna
Chemia kliniczna 20.12.2010, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna, semestr V
koło, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna
lista na egzamin-1, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, biochemia kliniczna, biochemia kliniczna
2010-Pytania otwarte, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, analiza instrumentalna
koło białka 2010, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna, koło białak osocza
7.Czy możliwa jest rejestracja czystych widm elektronowych, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, analiza
pytania na chemie lipidy, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna
Chemia kliniczna - 18.10, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna, semestr V
Wykład 22, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna

więcej podobnych podstron