CYTOLOGIA - ćw. 5 06.05.2011r.
Rozmaz możliwy do oceny:
prawidłowo utrwalone komórki nabłonka płaskiego zajmują > 10% powierzchni szkiełka
minimalna liczba komórek poddanych ocenie: 8-12 tys.
minimum dwie grupy dobrze utrwalonych komórek endocerwikalnych i/lub metaplastycznych
każda grupa musi składać się przynajmniej z 5 komórek
krwinki czerwone, zmiany związane z zapaleniem przysłaniają < 75% komórek
wyschnięcie preparatu dotyczy < 75% komórek
Rozmaz nie nadaje się do oceny:
brak identyfikacji pacjenta na szkiełku
rozmaz ubogokomórkowy (< 10% szkiełka stanowią komórki płaskonabłonkowe)
> 75% komórek zasłoniętych jest przez krwinki czerwone, elementy zapalne, złe utrwalenie, materiał obcy, zbyt gruby preparat
IMMUNOCYTOCHEMIA (ICC)
1. Rodzaje materiału do reakcji immunocytochemicznej
rozmazy komórkowe
cytospiny
preparaty ThinPrep, SurePath
bezpośrednie odciski tkanek
cell-bloki
2. W badaniach ICC należy
stosować kontrolę i testy na specyficzność przeciwciał
dokładnie standaryzować wszystkie etapy danej metody
stosować wzrastające rozcieńczenia specyficznego przeciwciała aż do rozcieńczeń nie dających odczynu pozytywnego
w reakcjach kontrolnych zastępować specyficzne przeciwciała przez surowicę od zwierzęcia tego samego gatunku
w odczytywaniu wyniku reakcji ICC kierować się istotnymi informacjami pochodzącymi z innych badań
3. Warunki umożliwiające prawidłowo wykonane ICC:
prawidłowo rozprowadzony materiał na odtłuszczonym szkiełku podstawowym
materiał naniesiony na szkiełko podstawowe o zwiększonej adhezyjności
usuniecie z próbki krwinek czerwonych oraz śluzu
4. Utrwalenie materiału
Warunki umożliwiające prawidłowe wykonanie ICC
utrwalenie w alkoholu etylowym 95% musi być wykonane bez opóźnienia - niedopuszczenie do wyschnięcia wyniki fałszywie dodatnie
materiał, który był utrwalony utrwalaczami aerozolowymi posiada więcej komórek opłaszczonych na szkiełku - niż utrwalony w alkoholu etylowym - ten typ utrwalania minimalizuje utratę komórek w materiale badanym
5. Immunocytochemia
1) Utrwalenie materiału
2) Uwodnienie (roztwory buforowane pH ok.8,0; nawadnianie nie powinno trwać dłużej niż 1minutę)
3) Odkrywanie antygenów (tylko IAC)
3) Zahamowanie endogennej aktywności enzymatycznej
Istotna przyczyna artefaktów - obecność w analizowanych komórkach enzymów o takiej samej aktywności, jak enzym znakujący użyte przeciwciało.
Zahamowanie aktywności peroksydacyjnej - inkubacja skrawków w metanolowym lub wodnym roztworze H2O2.
4) Blokowanie miejsc nieswoiście wiążących przeciwciała
Krótkotrwała inkubacja materiału, przed reakcją immunoenzymatyczną, z białkiem pochodzącym od innego zwierzęcia niż to od którego uzyskano swoiste przeciwciało.
- np. albumina surowicy bydlęcej (BSA)
- surowica zwierzęcia nieimmunizowanego
Blokowanie nie zapobiega tworzeniu się mocnych, specyficznych wiązań pomiędzy antygenem a zastosowanym przeciwciałem !!!
5) Lokalizacja
I etap - inkubacja komórek ze swoistym, nieznakowanym przeciwciałem
II etap - inkubacja komórek z drugim, znakowanym przeciwciałem, skierowanym przeciwko immunoglobulinie zwierzęcia, od którego uzyskano pierwsze przeciwciało
Złożoność procedury zwiększa jednak możliwość wystąpienia reakcji niespecyficznych.
6) Wykrywanie enzymów znacznikowych
Uzyskany w wyniku reakcji barwny - nierozpuszczalny produkt wyznacza miejsce lokalizacji kompleksu wykrywanego antygenu z przeciwciałem.
- Wykrywanie aktywności peroksydazy chrzanowej - metoda z użyciem 3,3'-diaminobenzydyną (DAB)
Prowadzi do wytworzenia brązowego polimeru nierozpuszczalnego w wodzie, alkoholu ani rozpuszczalnikach organicznych, wykazującego zdolność do wiązania metali ciężkich (w badaniach na poziomie mikroskopu elektronowego).
Dodanie soli miedzi, kobaltu, niklu, lub złota do płynu inkubacyjnego z DAB powoduje wzmocnienie intensywności reakcji i zmienia barwę brązowego produktu na niebieski lub czarny, co pozwala niekiedy, zwłaszcza przy słabej reakcji na zwiększenie jej wyrazistości.
6. Etapy reakcji ICC
Blokowanie aktywności endogennej peroksydazy |
woda utleniona 3% |
|
woda redestylowana |
|
PBS |
Blokowanie tła |
BSA |
|
płukanie w PBS |
Inkubacja z przeciwciałem I |
I przeciwciało |
|
PBS |
Inkubacja z przeciwciałem II |
zestaw EnVision+ |
|
PBS |
Barwienie DAB+ |
Substrate Chormogen Solution DAB+ |
|
woda bieżąca |
Podbarwianie jąder komórkowych |
hematoksylina Mayera |
|
bieżąca woda |
Odwodnienie |
alkohol 80% |
|
alkohol 90% |
|
alkohol 96% |
|
alkohol 99,8% |
|
aceton |
Prześwietlenie |
ksylen I |
|
ksylen II |
|
ksylen III |
|
ksylen IV |
Zamknięcie w medium |
|
7. Reakcje kontrolne
- stanowią gwarancję wiarygodności wyników procedury,
- maja na celu potwierdzić swoistość stosowanej metody i wykryć wszelkie artefakty.
Dodatnia reakcja kontrolna:
- przeprowadzana na wybranej, modelowej tkance zawierającej wykrywany antygen
- reakcja wskazuje na prawidłowość stosowanej procedury
Ujemna reakcja kontrolna
1) z pominięciem przeciwciała swoistego:
Wykrywa nieswoiste wiązanie przez tkankę drugiego przeciwciała/ i lub endogenną aktywność enzymatyczną.
2) z pominięciem swoistego przeciwciała i wtórnego preciwciała
Zabarwienie tkanki świadczy o endogennej aktywności enzymatycznej w badanym materiale, lub o niespecyficznym wiązaniu przez tkankę kompleksów enzym-antyenzym.
3) Reakcja z zastąpieniem swoistego przeciwciała nieswoistą surowicą
surowica nieswoista, czyli pochodzącą od zwierzęcia (tego samego gatunku), ale nie poddanego immunizacji.
Ujawnia nieswoiste wiązanie przeciwciał z badaną tkanką.