CYTOLOGIA - ćw. 5 06.05.2011r.

Rozmaz możliwy do oceny:

• prawidłowo utrwalone komórki nabłonka płaskiego zajmują > 10% powierzchni szkiełka

• minimalna liczba komórek poddanych ocenie: 8-12 tys.

• minimum dwie grupy dobrze utrwalonych komórek endocerwikalnych i/lub metaplastycznych

• każda grupa musi składać się przynajmniej z 5 komórek

• krwinki czerwone, zmiany związane z zapaleniem przysłaniają < 75% komórek

• wyschnięcie preparatu dotyczy < 75% komórek

Rozmaz nie nadaje się do oceny:

• brak identyfikacji pacjenta na szkiełku

• rozmaz ubogokomórkowy (< 10% szkiełka stanowią komórki płaskonabłonkowe)

• > 75% komórek zasłoniętych jest przez krwinki czerwone, elementy zapalne, złe utrwalenie, materiał obcy, zbyt gruby preparat

IMMUNOCYTOCHEMIA (ICC)

1. Rodzaje materiału do reakcji immunocytochemicznej

• rozmazy komórkowe

• cytospiny

• preparaty ThinPrep, SurePath

• bezpośrednie odciski tkanek

• cell-bloki

2. W badaniach ICC należy

• stosować kontrolę i testy na specyficzność przeciwciał

• dokładnie standaryzować wszystkie etapy danej metody

• stosować wzrastające rozcieńczenia specyficznego przeciwciała aż do rozcieńczeń nie dających odczynu pozytywnego

• w reakcjach kontrolnych zastępować specyficzne przeciwciała przez surowicę od zwierzęcia tego samego gatunku

• w odczytywaniu wyniku reakcji ICC kierować się istotnymi informacjami pochodzącymi z innych badań

3. Warunki umożliwiające prawidłowo wykonane ICC:

• prawidłowo rozprowadzony materiał na odtłuszczonym szkiełku podstawowym

• materiał naniesiony na szkiełko podstawowe o zwiększonej adhezyjności

• usuniecie z próbki krwinek czerwonych oraz śluzu

4. Utrwalenie materiału

Warunki umożliwiające prawidłowe wykonanie ICC

• utrwalenie w alkoholu etylowym 95% musi być wykonane bez opóźnienia - niedopuszczenie do wyschnięcia wyniki fałszywie dodatnie

• materiał, który był utrwalony utrwalaczami aerozolowymi posiada więcej komórek opłaszczonych na szkiełku - niż utrwalony w alkoholu etylowym - ten typ utrwalania minimalizuje utratę komórek w materiale badanym

5. Immunocytochemia

1) Utrwalenie materiału

2) Uwodnienie (roztwory buforowane pH ok.8,0; nawadnianie nie powinno trwać dłużej niż 1minutę)

3) Odkrywanie antygenów (tylko IAC)

3) Zahamowanie endogennej aktywności enzymatycznej

Istotna przyczyna artefaktów - obecność w analizowanych komórkach enzymów o takiej samej aktywności, jak enzym znakujący użyte przeciwciało.

Zahamowanie aktywności peroksydacyjnej - inkubacja skrawków w metanolowym lub wodnym roztworze H₂O₂.

4) Blokowanie miejsc nieswoiście wiążących przeciwciała

Krótkotrwała inkubacja materiału, przed reakcją immunoenzymatyczną, z białkiem pochodzącym od innego zwierzęcia niż to od którego uzyskano swoiste przeciwciało.

- np. albumina surowicy bydlęcej (BSA)

- surowica zwierzęcia nieimmunizowanego

Blokowanie nie zapobiega tworzeniu się mocnych, specyficznych wiązań pomiędzy antygenem a zastosowanym przeciwciałem !!!

5) Lokalizacja

I etap - inkubacja komórek ze swoistym, nieznakowanym przeciwciałem

II etap - inkubacja komórek z drugim, znakowanym przeciwciałem, skierowanym przeciwko immunoglobulinie zwierzęcia, od którego uzyskano pierwsze przeciwciało

Złożoność procedury zwiększa jednak możliwość wystąpienia reakcji niespecyficznych.

6) Wykrywanie enzymów znacznikowych

Uzyskany w wyniku reakcji barwny - nierozpuszczalny produkt wyznacza miejsce lokalizacji kompleksu wykrywanego antygenu z przeciwciałem.

- Wykrywanie aktywności peroksydazy chrzanowej - metoda z użyciem 3,3'-diaminobenzydyną (DAB)

Prowadzi do wytworzenia brązowego polimeru nierozpuszczalnego w wodzie, alkoholu ani rozpuszczalnikach organicznych, wykazującego zdolność do wiązania metali ciężkich (w badaniach na poziomie mikroskopu elektronowego).

Dodanie soli miedzi, kobaltu, niklu, lub złota do płynu inkubacyjnego z DAB powoduje wzmocnienie intensywności reakcji i zmienia barwę brązowego produktu na niebieski lub czarny, co pozwala niekiedy, zwłaszcza przy słabej reakcji na zwiększenie jej wyrazistości.

6. Etapy reakcji ICC

Blokowanie aktywności endogennej peroksydazy	woda utleniona 3%
		woda redestylowana
		PBS
	Blokowanie tła	BSA
		płukanie w PBS
	Inkubacja z przeciwciałem I	I przeciwciało
		PBS
	Inkubacja z przeciwciałem II	zestaw EnVision+
		PBS
	Barwienie DAB+	Substrate Chormogen Solution DAB+
		woda bieżąca
	Podbarwianie jąder komórkowych	hematoksylina Mayera
		bieżąca woda
	Odwodnienie	alkohol 80%
		alkohol 90%
		alkohol 96%
		alkohol 99,8%
		aceton
	Prześwietlenie	ksylen I
		ksylen II
		ksylen III
		ksylen IV
Zamknięcie w medium

7. Reakcje kontrolne

- stanowią gwarancję wiarygodności wyników procedury,

- maja na celu potwierdzić swoistość stosowanej metody i wykryć wszelkie artefakty.

• Dodatnia reakcja kontrolna:

- przeprowadzana na wybranej, modelowej tkance zawierającej wykrywany antygen

- reakcja wskazuje na prawidłowość stosowanej procedury

• Ujemna reakcja kontrolna

1) z pominięciem przeciwciała swoistego:

Wykrywa nieswoiste wiązanie przez tkankę drugiego przeciwciała/ i lub endogenną aktywność enzymatyczną.

2) z pominięciem swoistego przeciwciała i wtórnego preciwciała

Zabarwienie tkanki świadczy o endogennej aktywności enzymatycznej w badanym materiale, lub o niespecyficznym wiązaniu przez tkankę kompleksów enzym-antyenzym.

3) Reakcja z zastąpieniem swoistego przeciwciała nieswoistą surowicą

surowica nieswoista, czyli pochodzącą od zwierzęcia (tego samego gatunku), ale nie poddanego immunizacji.

Ujawnia nieswoiste wiązanie przeciwciał z badaną tkanką.