BAKTERIE LAB:
-mają status GRAS bakterie bezpieczne i niechorobotwórcze dla ludzi
-należą do nich Lactococcus, Lactobasillus, Streptococcus i Bifidobacterium spp.
-wiele z nich stosowanych jako PROBIOTYKI, wywierają korzystny wpływ na zdrowie człowieka
Probiotyki:Żywe drobnoustroje stanowiące uzupełnienie diety człowieka, które podawane w odpowiednich ilościach wywierają korzystny wpływ na organizm. Odkryte przez Miecznikowa
Cechy probiotyków:
1.pochodzą z naturalnej mikroflory
2.oporne na działanie enzymów trawiennych i żółci
3.zdolne do kolonizacji przewodu pokarmowego i trwałego przyjegania do nabłonka jelita
4.wytwarzają substancje hamujące wzrost innych drobnoustrojów
5.wykazują antagonizm wobec patogenó
STOSUJE SIĘ JAKO NOŚNIK AKTYWNYCH BIOLOGICZNIE CZĄSTECZEK np.ANTYGENÓW W celach PROFILAKTYCZNYCH I TERAPEUTYCZNYCH |
6.poprawiają smak produktów
BAKTERIE LAB DZIĘKI TEMU, ŻE WYWIERAJĄ KORZYSTNY WPŁYW NA ORGANIZM I MAJĄ NISKĄ IMMUNOGENNOŚĆ
(mogą być wielokrotnie stosowane)
Lactobacillus składniki naturalnej mikroflory
Streptococcus
Lacococcus lactis nie kolonizuje przewodu pokarmowego
Bakterie mlekowe:
Homofermentatywne
Heterofermentatywne
Pałeczki, laseczki
Nieruchliwe, nieprzetrwalnikujące
W jamie ustnej wywołują prochnicę
Na plazmidzie cechy oporności na bakteriofagi, antybiotyki, wytwarzanie bakteriocyn
ĆWICZENIE:Przed zastosowaniem bakterii mlekowych w szczepionkach należy określić ich właściwości:
1.wykorzystanie laktozy
2.produkacja kwasu mlekowego
3.własności proteolityczne
4.produkcja bakteriocyn
2.produkcja kwasu mlekowego
Pożywka:
-M17 agar
-laktoza
-purpura bromokrezolowa
Posiew:Dowolny
Obserwacja: Zażółcenie wokół kolonii
Wnioski: Pod wpływem zakwaszenia środowiska przez kwas mlekowy purpura bromokrezolowa zmienia zabarwienie na żółty
3.własności proteolityczne
Pożywka:
-mleko odtłuszczone
-agar
-glukoza
Posiew: Kreską
Obserwacja: Przejaśnienia
Wnioski: Szczep ma właściwości proteolityczne
4.produkcja bakteriocyn
Pożywka:
-glukoza
-agar
Posiew: dolna warstwa szczep podkładkowy, w postaci murawy, nakraplamy szczep badany(wytwarzający bakteriocyny)
Obserwacja: Przejaśnienia
Wnioski: obecność bakteriocyn
Nizyna jest najepiej poznaną bakteriocyną. Produkowana przez Lactococcus lactis zyskała status GRAS (generally recognised as safe). Posiada bardzo niską toksyczność, dawka letalna to 7 mg/kg. Oczyszczona nizyna jest odporna na ogrzewanie w 1000C przez 10 min. w pH 2,0. Stosowana jako środek konserwujący w 46 krajach w produktach mlecznych i puszkowanej żywności. Jej aktywność obejmuje szeroki zakres szczepów takich jak: Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Listeria i Mycobacterium jak również spory i formy wegetatywne Bacillus i Clostridium. Działanie lantybiotyków nie ogranicza się tylko do bakterii gramdodatnich, zaobserwowano również aktywność przeciwko bakteriom gramujemnym E.coli i Salmonella. Nizyna używana jest jako biokonserwant od około trzydziestu lat, ale mechanizm jej działania wyjaśniony został dopiero w ostatnich latach.. Wrażliwe organizmy wykazały zaburzenia w syntezie DNA, RNA, białek i polisacharydów
WYKORZYSTANIE BIAŁEK BAKTRYJNYCH PATOGENÓW W MEDYCYNIE
Czynniki rozprzestrzeniania:
zewnątrzkomórkowe enzymy hydrolityczne ułatwiające patogenom rozprzestrzenianie się w organizmie gospodarza i dotarcie do właściwej niszy ekologicznej
np. proteazy, nukleazy, kolagenazy...
dużą ich liczbę wytwarzają Staphylococcus i Streptococcus
Streptokoki produkują:
streptodornazanukleaza, rozpuszcza wszelkie substancje w ropniach
streptokinaza aktywuje plazminogen, przez zmianę jego konformacji, dając plazminę- proteazę serynową, która rozkłada fibrynę w skrzepie i kazeinę w doświadczeniu
substancje pochodzenia bakteryjnego stosowane w medycynie:
substancje do terapii terapia przeciwzakrzepowa
streptokinaza
streptodornaza
(alteptazarekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu)
(preparaty pochodzenia ludzkiego (pochodne aktywatorów plazminogenu tPa i uPa, które są proteazami serynowymi, aktywują na)
białko Pla z Yersinia pestis, które aktywuje plazminogen na drodze hydrolizy
(proby SOMATYCZNEJ TERAPII GENWEJumieszczenie w kom.endothelium genu warunkującego wytwarzanie aktywatora plazminogenu)
strategie aktywacji plazminogenu przez mikroorg.:
-wytwarzanie zewnątrzkom. aktywatora plazminogenu
-przez receptory dla plazminogenu na powierzchni błony lub organelli lub pl zdolne do wyłapywania i wiązania plazminogenu, co doprowadza do jego aktywacji
toksyna botulinowa:
w medycynie:
-leczenie zeza
-leczenie przykurczy mięśni - porażenie mózgowe
w kosmetyce:
-wygładzanie zmarszczek BOTOX
produkowana przez Clostridium botulinum
egzotoksyna, neurotoksyna
mieszanina kilku białek (typy A-G), najbardziej toksyczne A,B,E, a C i D toksyczne dla zwierząt
wrażliwa na wysoką temperaturę i na wysokie zasolenie
blokuje wydzielanie acetylocholiny w synapsach, powoduje rozluźnienie mięśni
3. dekstran:
- środek zastępczy krwi płyn, który przetacza się do krwi, aby przywrócić objętość krwi, aby małe naczynia włosowate się nie zapadły
polimer o wysokim ciężarze cząsteczkowym, składnik śluzu Leuconostoc mesentedoides
4.wykorzystanie rekombinowanych białek: insulina,szczepionki podjednostkowe
Łatwa procedura i niskie koszty powodują, że systemy bakteryjne i drożdżowe to najczęściej stosowane systemy ekspresyjne.
Po transformacji odpowiednich szczepów i hodowli w małej objętości, identyfikujemy klony wykazujące znaczny poziom ekspresji produkowanego białka. Na tej podstawie wybieramy odpowiedni system ekspresyjny. Ostatnim etapem jest oczyszczanie białka z wykorzystaniem metod chromatograficznych. Czystość uzyskanych preparatów jest potwierdzana przez analizy SDS-PAGE i HPLC.
5.Immunotoksyny: - lecznie niektó®ych form nowotworów
Immunotoksynami nazywamy połączenia przeciwciał monoklonalnych z toksynami. Zasada działania takich koniugatów polega na tym, że po przyłączeniu się do danego antygenu (np. na powierzchni komórki nowotworowej) toksyna może niszczyć komórkę niosącą ten antygen. W ten sposób mogą być niszczone określone komórki bez szkody dla innych komórek organizmu.
Przciwciałorozpoznaje kom. docelową
Toksynazabija
ĆWICZENIE:Cel:Wykazanie aktywności sklonowanego w kom. E coli genu streptokinazy
1.Przygotowanie konstuktów
gen sck sklonowany i zsekwencjonowany
stanowi niezależną jednostkę transkrypcyjną
na końcu aminowym znajduje się peptyd synałowy, odcinany w czasie wydzielania przez komórkę, rejon środkowy genu jest niezbędny do aktywności białka
Utworzenie banku genowmowego DNA z wykorzystaniem wysokokopijnych plazmidów pTZ19R
Znalezienie klonów kazeinolitycznych
Przeklonowanie genu skc do pBR322 otrzymując dużo bardziej stabilny plazmid rekombinacyjny pSB1
w tym plazmidzie
gen skc wyrażany z własnego promotora
P RBS ATG s.s. skc T
Białko peryplazmatyczne, kolonie mukoidalne
Skc+
Fragment DNA pSB1 sklonowano w pUC18 gdzie jest LacZ
FUZJA TRANSKRYPCYJNA
w tym plazmidzie p8
P.laktozowy RBS ATG s.s. skc T
ekspresja genu skc pod kontrolą promotora lac
Białko peryplazmatyczne, kolonie mukoidalne
Skc+
Skonstruowanie FUZJI TRANSLACYJNEJ genu lacZ i skc, powstaje plazmid rekombinacyjny pKH2
w tym plazmidzie
P RBS ATG lacZ skc T
Białko cytoplazmatycznebrak sekw.sygnałowej, fuzja z beta-galaktozydazą-> oba geny w jednej ramce odczytu, kolonie niemukoidalne
CWICZENIE:Test szalkowy wykazujący aktywność streptokinaz:
streptokinaza-plazminogendegradacja kazeinystrefy przejaśnienia wokół koloni wytwarzających streptokinazę, obserwacja mukoidalności koloniiwynik peryplazmatycznej lokalizacji streptokinazy
Przygotowanie szalek:
1.wylać szalki LB z antybiotykiem
2.Przygotować wierzchnią warstwę (agaroza +bufor, NaCl, jałowe mleko, plazminogen)
TRANSFORMACJA SZCZEPÓW E.coli DNA PLAZMIDOWYM KODUJĄCYM STREPTOKINAZĘ:
1.Do odpowiednich kom.kompetentnych dodać preparat DNA
2.Inkubować w lodzie 15minut. Zawieszone w glicerolu
3.Zawiesinę bakterii przenieść do temp. 42-44 na 40 sekund
4.Dodać do 1 ml podłoża LB i inkubować 40 minut w 37 stopniach
5.Wysiać odpowiednio rozcieńczoną mieszaninę transformującą na podłoże selekcyjne
pSB1/E.coli
warstwa dolna LB+Tc//warstwa górna LB + mleko+plazminogen
Obserwacje: kolonie śluzowate- białko peryplazmatyczne, są przejaśnienia dookoła kolonii, nie dookoła wszystkich kolonii są przejaśnienia to jest efekt małej wydajności promotora
p8/E.coli
warstwa dolna LB+Amp//warstwa górna LB +mleko+plazminogen
Obserwacje: kolonie śluzowate, są przejaśnienia, podrost wynika ze skorzystania z beta-laktamazy innych bakterii
pKH2/E.coli
warstwa dolna LB +Amp//warstwa górna LB+mleko+plazminogen
Obserwacje:obecność przejaśnien, brak śluzowatego wyglądu
Podrost największe kolonie - właściwe transformanty
-malutkie kolonie nie są oporne, wykorzystują cudze enzymy
kontrola - Bluescript mleko + plazminogen
SZCZEPIONKI NOWEJ GENERACJI:
Z ćwiczeń 3 Szczepionki:
atenuowane np. przez delecję genó odpowiedzialnych za wirulencję
zabite mikroorganizmy
białka
Zalety atenuacji (musimy mieć pewność, że atenuacja jest nieodwracalna):
Indukcja intensywniejszej odpowiedzi imm., zabite org, indukuję bardzo słabą
Stosowanie atenuowanych organizmów do przeniesienia antygenów innych patogenów
odwrotna wakcynologia
mamy sekwencję genomu-> analiza in silico program wykrywa geny kodujące białka powierzchniowe
WYKORZYSTANIE BAKTERII MLEKOWYCH JAKO NOŚNIKA ANTYGENU:
-atenuowanae bakterie mlekowe
-antygen wklonowany do DNA bakterii mlekowych
-antygen powinien ulegać ekspresji promotory konstytutywne lub indukowalne
-antygen powinien być wydzielany na zewnąrz komórkipowinien mieć sekwencję syngałową
-antygen może być albo na plazmidzie (w wielu kopiach-plazmidy wielokopijne)
-antygen może być na chromosomie (+silny promotor)
rozważa się użycie bakterii LAB jako nośników antygenów
Izolacja genów kodujących determinanty patogenezy
Listeria monocytogenes:
Organizm modelowy w badaniach nad odp.imm.generowaną wewnątrzkom.
Izolacja i charakterystyka mutantów insercyjnychokreślenie funkcji i lokalizacji genów kodujących determinanty patogenezy
Determinanty patogenezy Listeria:
-listeriolizyna O (LLO, gen hly, egzotoksyna, główny czynnik wirulencji, z rodziny hemolizyn)
-fosfolipaza
Listeria wnika drogą pokarmową (odporna jest na działanie HCl i enzymów trawiennych)
Przylega do komórki (adhezyny, internaliny)
Przenika do kępek Peyera, ma internalinę, która wywołuje fagocytozę
Zdolność przenikania bakterii przez błony wakuoli jest uwarunkowana aktywnością hemolityczną wydzielenie LLO, białko Act A odpowiedzialne jest za ruch , fosfolipaza odpowiedzialna jest za hydrolizę lipidów
Hemolizyny hly
Fosfolipazy plc
MHC II MHC I
Listeria pobudza I i II układ zgodności tkankowej
Wykorzystanie w szczepionkach antygenów zewnętrznych (MHC I)(nukleoproteina wirusa grypy NP), antygeny powierzchniowe- najbardziej zmienne=> szczepionki stają się nieskuteczne
Wykorzystanie białek wewnętrznych => są lepsze, bo stabilniejsze!!!
Sposoby atenuacji:
osłabienie szczepu=> mutageneza=> pasażowanie
Szczepionka nowej generacji (chromosom Listeria + obce antygeny np. nukleoproteiny wirusa grypy...antygeny nowotworowe=> szczepionki przeciwnowotworowe)
Przewaga szczepionek nowej generacji nad starymi!!! Pytanie?
Użycie bakterii patogennej
niepatogennej z czynnikami patogenezy
WYSPY PATOGENNOŚCI- Kodują zespół czynników wirulencji, na chromosomie lub plazmidzie
PCR:
-łańcuchowa reakcja polimerazy
-metoda powielania DNA in vitro, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.
Powielony frag. Nie musi być oddzielony od reszty genomu, po amplifikacji odzielamy fragment dzięki ELEKTROFOREZIE w żelu agarozowym
Wykorzystanie B. Subtilis jako nośnika antygenów:
zawiera wklonowany do kasety SPAC gen kodujące hemolizynę L.monocytogenesnabycie cech patogenazdolność do wnikania do komórki
doklonowanie do kasety genu kodującego białko przeciw któremu chcemy wywołać odpowiedź immunologiczną
ĆWICZENIE:
1.Izolacja DNA B.subtilis
Zwirować nocną hodowlęzlać supernatantosad zawiesić w SSC (NaCl+cytrynian sodu)zwirowaćzlać supernatantosad zawiesić w buforze lizującym (bufor fosforanowy+sacharoza+lizozym)inkubowaćdodać roztworu lizującego ściany mureinowe (Tris+EDTA+SDS)inkubować w 37inkubować w 75stopniachpróbkę zworteksować i wirowaćpobrać supernatantdodać do supernatantu bufor ORANGE-DX i wymieszaćmieszaninę przenieść do minikolumnywirowaćwyrzucić przesączumieścić minikolumnę w probówce odbierającejdodać buforu płuczącego Wash-DX->wirowaćznowu wylaćwirować w celu usunięcia resztek buforu płuczącegominikolumnę umieścić w sterylnym eppendorfiedodać buforu Elution-DXpozostawic ją na 2 min w temp. Pokojowej zwirować i mamy!
Składniki PCR:
-matryciwy DNA nasz preparat
-dNTP roztwór trinukleotydów
-sekw. Flankujące interesujące nas geny prawy i lewy primer
-termostabilną polimerazę
-woda dejonizowana
-bufor
Analiza produktów PCR:
Do probki dodać barwniknanieść do dołkównałożyć wzorzecrozdzielać w żelu agarozowymżel zabarwić bromkiem etydyny
KREW+TOKSYNY BAKTERYJNELIZA
Określenie aktywności hemolitycznej supernatantu pohodowlanego:
Przygotowanie krwi baranka:
Odpłukanie osocza od erytrocytów
-krew zawiesić w PBS(sól fizjologiczna buforowana)zwirowaćodrzucić supernatantkrwinki zawiesić w PBSpłukać 3 razy
Przygotowanie próbek do testu
PBS+zawiesina erytrocytów preinkubować
Do probówek z erytrocytami i PBS dodać:
Supernatant znad badanych szczepów SDS woda
PROBA BADANA KONTROLA + KONTROLA -
Inkubować zwirować probki supernatant rozcieńczyć 10xZmierzyć absorbancję (ślepa próba=kontrola -)
Obliczenie aktywności w jednostkach hemolitycznych:
Absorbancja kontroli - = 0 jednostek
Absorbancja kontroli+ (SDS)=100 jednostek hemolitycznych
Np.
1.347 - 100 j.h.
0 - 0 j.h.
0.01347 - 1 j.h.
0.061 - x j.h. x=4.5 j.h
OPATRUNEK FAGOWY
Fagi:
Wewnątrzkomórkowe pasożyty bakterii zdolne do reprodukcji w innych komórkach
Pozbawione własnego metabolizmu (nie syntezują zw.drobnocząsteczkowych i nie mogą syntezować ani pobierać energii)
Odkrywcy fagów: Frederick Twort i Felix D'Herelle (wprowadził pojęcie bakteriofag i terapia fagowa)
Maisin wyleczył w 1921 zakażoną gronkowcami skórę
D'Herelle zastosował fagi do walki z czerwonką, cholerą, dżumą, tyfusem, infekcjami skórnymi
Po odkryciu antybiotyków zostały:
1.Gruzja Tibilisi - sterylizacja pomieszczen, walka z zakażeniami
2.Polska Ośrodek Terapii Doświadczalnej- Bruno Jasiński, Wrocław-opracowanie terapii przeciwko czeronce, biegunkom, zakażeniom krwi, zapaleniu opon mózgowych, owrzodzeniom, zakażeniom pooperacyjnym i pooparzeniowym
Wzrost szczepów antybiotykoopornych-powrót do terapii fagowych.
Projekty badawcze:
walka z paciorkowcami jelitowymi opornymi na wankomycynę, które zabijają chorych na nowotwory i AIDS
walka z Salmonella,Shigella i E.coli w produktach mięsnych i drobiowych
krople do oczu przeciwko zakażeniom gronkowcowym
walka z bakteriami MRSA (odporne na antybiotyki S.aureus)
wniosek o patent bandaża PhagoBioDerm
BAKTERIOFAGI:
2 postaci:
-faza wegetatywna (wewnątrzkomórkowa)- nie widać go
-faza spoczynkowa - obserowalny
Swoistość względem gospodarza:
Adsorpcja cząsteczek fagowych odbywa się z udziałem odpowiednich białek fagowych i receptorów komórkowych np. receptor faga lambda łączy się z białkiem LamB E.coli.
Brak receptora dla fagaoporność na bakteriofaga
Mechanizmy zmieniające swoistośc (warunkujące oporność bakterii)
Mutacje bakterii w wyniku których zmieniają się białka receptorowe
Mutacje faga warunkujące adhezhę do zmienionych receptoró
Restrykcje i modyfikacje
\mycobacterium smegmatis z fagiem może służyć jako wektor w leczeniu gruźlicy
Na 1 bakterie przypada 10 fagó
10^30- ilość bakterii na Ziemii
10^31- ilość fagó na Ziemii
Dobre źródło fagó:
Ścieki komunalne, wody, studzienki
RÓŻNICE MIĘDZY ANTYBIOTYKAMI A BAKTERIOFAGAMI
Antybiotyk musi być podawany ciągle, natomiast liczba fagó wzrasta, aż do momentu kiedy zaobserwujemy wyleczenie pacjenta
MOC fagowa preparatu: ILOŚĆ CZĄSTEK FAGOWYCH/ML
Opatrunek fagowy musi mieć dużą powierzchnię kontaktu ze skórą(płyny, galaretki), stosuje się szkielety organiczne np. substancje żelowe. Moc opatrunku bada się przez obserwacje stref zahamowania wzrostu.
WYKONANIE OPATRUNKU FAGOWEGO:
1.Znaleźć bakterie, wyizolować ją w stanie czystym
2.Dobrać bakteriofaga, oczyścić, namnożyć
3.Nanieść go na ranę
Ćwiczenie:
CEL:Przygotowanie opatrunku fagowego:
opatrunek fagowy w postaci immobilizowanej w ŻELU AGAROZOWYM zawiesiny fagowej
opatrunek w postaci immobilizowanej w ŻELU AGAROZOWYM zawiesiny fagowej umieszczonej na nośnikuGAZA
opatrunek w postaci nasączonego zawiesiną faga nośnika organicznego - GAZA
Kontrole:
Kontrola negatywna KO zamiast zawiesiny faga RF
Kontrola pozytywna(antybiotykowa) K1 RF+antybiotyk (np.1 mikrogram x ml^-1)
1.Krzywa lityczna:
-hodowle bakterii zaszczepić zawiesiną faga
-określić OD startowe
-hodowlę prowadzić przez dwie godziny, OD mierzyć co 30 minut
-określić miano faga i ilość bakterii w hodowli dwugodzinnej
-zwirować bakterieSUPERNATANT (źródło fagów)
2.Izolacja specyficznych fagów
Próbkę gleby (źródło faga)dodajemy do hodowli bakteryjnej
Inkubacja 37 prze dwa dni
1ml zbieramy, wirujemy, zbieramy supernatant
dodajemy chloroform do supernatantu, worteksujemy
wirujemy
Określić miano faga w rozcieńczeniu -1 i -6 na szalkach duwarstwowych
Inkubować w 37
Zebrać cienką warstwę agaru z powstałych łysinek do eppendorfa
3.Zbadanie swoistości faga
na szalki z agarem odżywczym nanieść zawiesinę faga w postaci kreski
bakterie nanieść w postaci kresek poprzecznych
inkuboać w 37
obserwować strefy zahamowania wzrostu
4.Przygotowanie opatrunku fagowego:
pobrać supernatant
a)zmieszać s. z agarem
b)zmieszać s. Z agarem-> nasączyć gazę
c)nasączyć gazę supernatantem
-przygotować kontrole
5.Zbadanie aktywności i trwałości opatrunku fagowego
przeprowadzić tego samego dnia i po upływie tygodnia
-przygotować szalki dwuwarstwowe
-podzielić je na 4
-połozyć opatrunki
-inkubować
-oznaczyć wielkość stref zahamowania wzrostu
SZALKI DWUWARSTWOWE:
Na dola cienka warstwa agaru stałego
Na górze agar + bakterie
Obliczenie miana faga:
Wylać cienką warstwę agaru
Przygotować serię rozcienczeń faga metodą próbókową
Do probówki pobrać agar +bakterie+fag i wylać to na agar
Inkubować
Obliczyć ilość łysinek i miano faga w roztworze wyjściowym
Oznaczenie ilości bakterii
Wylać warstwę agaru
Przygotować serie rozcieńczeń metodą probókową
Pobrać 0.1 próbki
Nakroplić i rozprowadzić głąszczką
Inkubować
Obliczyć ilość kolonii i miano bakterii w roztworze wyjściowym
Podniesienie indukowanej specyficzności odp.imm.
Stosowany do krótkotrwałego dostarczania antygenów
Limfocyt B
Limfocyt T cytotoksyczny
Bakteria
(obcy antygen)