Wykład 6

T: Metody rozdzielcze - część 1

Metody rozdzielcze

Grupa metod	Metody
Podziałowe	ekstrakcja chromatografia
Wytrąceniowe	wytrącanie wytrącanie z nośnikiem
Elektroanalityczne	elektroliza elektroforeza
Fizyczne	destylacja suszenie krystalizacja
Mechaniczne	ultrawirowanie sedymentacja dializa

Chromatografia - metoda rozdziału mieszanin pomiędzy fazy układu chromatograficznego:

• fazę nieruchomą

- ciało stałe

- ciecz na nośniku

- żel

• fazę ruchomą

- gaz

- ciecz

- gaz w stanie nadkrytycznym (fluid)

Chromatografia jest metodą wykorzystywaną do:

• rozdziału mieszanin

• analizy jakościowej i ilościowej składników mieszanin

Metody stosowane w chromatografii

Metoda analizy czołowej

- składnik o najmniejszym powinowactwie do fazy stacjonarnej ma największą prędkość, stanowi pierwsze pasmo od dołu kolumny i jedyne, które można uzyskać w stanie czystym

Metoda rugowania

- składniki mieszaniny są oddzielane od siebie za pomocą roztworów o różnych właściwościach wypierających (wykazujących silniejsze zdolności adsorpcyjne niż substancje rozdzielane)

Metoda wymywania (elucyjna) - podstawowa, umożliwia rozdział i ilościowe odzyskanie poszczególnych składników mieszaniny

- rozwijanie chromatogramu przez przemywanie kolumny czystym rozpuszczalnikiem lub serią rozpuszczalników o coraz większej mocy elucyjnej

Oddziaływania międzycząsteczkowe

próbka próbka

faza stacjonarna faza faza

stacjonarna ruchoma

Chromatografia Chromatografia cieczowa

gazowa

Rodzaje oddziaływań międzycząsteczkowych

1. Siły kulombowskie między jonami - głównie w chromatografii jonowymiennej

2. Wynikające z oddziaływań między jonami i cząsteczkami z indukowanym przez jony dipolem

3. Oddziaływania związane z tworzeniem wiązań wodorowych (specjalna forma oddziaływań typu dipol-dipol). Występuje między wodorem a atomem elektroujemnym np. O, N, F

4. Oddziaływania donorowo-akceptorowe - występujące pomiędzy składnikiem zawierającym układ p-elektronowy i wykazującym niewielką energię jonizacji, a drugim składnikiem układu o dużym powinowactwie do elektronu (np. kationem metalu przejściowego)

5. Siły van der Waalsa:

• wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi trwały moment dipolowy (dipol-dipol)

• wynikające z oddziaływań między cząsteczkami będącymi dipolami i cząsteczkami, w których moment dipolowy jest indukowany przez sąsiadujące cząsteczki

• oddziaływania między obojętnymi atomami lub cząsteczkami = siły dyspersyjne (wskutek wzajemnego oddziaływania poruszających się elektronów dwóch sąsiednich układów elektronowych)

Siły dyspersyjne występują we wszystkich cząsteczkach, a w przypadku połączeń niepolarnych jedynie te siły powodują oddziaływania międzycząsteczkowe.

oddziaływania międzycząsteczkowe

różnice w zatrzymywaniu rozdzielanych substancji przez fazę stacjonarną

większe powinowactwo substancji do fazy stacjonarnej

większa wartość współczynnika podziału (lub współczynnika adsorpcji)

późniejsze opuszczanie kolumny przez substancję i większa wartość jej czasu retencji

Śledzenie przebiegu procesu chromatograficznego

Substancje barwne - bezpośrednio

Substancje bezbarwne

• chromatogram stały - przeprowadza się substancje bezbarwne w związki barwne

• chromatogram ciekły - rejestrowanie stężenia substancji w wycieku przez pomiar

- zmian absorpcji światła

- współczynnika załamania światła

- zmian potencjału elektrycznego

- zmian przewodnictwa

- natężenia prądu płynącego przez badany roztwór

- zmian pH

- radioaktywności

Technika elucyjna (wymywania) rozdziału składników mieszanin metodami chromatograficznymi:

• próbka analizowanej mieszaniny -> szczyt kolumny chromatograficznej

• przepuszczenie fazy ruchomej

• efekt rozdziału chromatograficznego = wykres zależności wskazań detektora od czasu lub objętości fazy ruchomej (chromatogram)

Podstawy teoretyczne - parametry retencyjne

Całkowity czas retencji (t_R) = czas liczony od momentu wprowadzenia próbki do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku (momentu pojawienia się na wyjściu z kolumny maksymalnego stężenia wymywanego związku)

Całkowita objętość retencji (V_R) = objętość fazy ruchomej potrzebna do wymycia składnika, mierzona od momentu wprowadzenia próbki do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku:

V_R = F₀ ∙ t_R

F₀ - prędkość wypływu fazy ruchomej z kolumny (cm³/min)

Zerowy czas retencji (t_M) = czas przebywania w kolumnie substancji, która nie oddziałuje z fazą stacjonarną (np. He w chromatografii gazowej)

Zerowa objętość retencji (V_M):

V_M = F₀ ∙ t_M

Zredukowany czas retencji (t'_R) = różnica między całkowitym i zerowym czasem retencji

t'_R = t_R - t_M

Zredukowana objętość retencji (V'_R):

V'_R = V_R - V_M

Zredukowany czas retencji i zredukowana objętość retencji charakteryzują zatrzymywanie się próbki na fazie stacjonarnej i są wielkościami charakterystycznymi dla danej substancji.

Względny czas retencji:

r_i,w = t'_Ri / t'_Rw

„i” - dowolna substancja

„w” - substancja wzorcowa

Współczynnik retencji (k):

k = (t_R - t_M) / t_M

lub

liczba moli X w fazie stacjonarnej n_S c_SV_S

k = = =

liczba moli X w fazie ruchomej n_m c_mV_m

c_S, c_m - stężenie składnika X w fazie ruchomej i stacjonarnej

V_S, V_m - objętość fazy ruchomej i stacjonarnej

zawartość substancji w fazie nieruchomej

R_f =

zawartość substancji w fazie ruchomej

Równowaga podziału ma charakter dynamiczny - cząsteczki przemieszczają się pomiędzy fazami.

1

R_f =

1+k

R_f - współczynnik przepływu/współczynnik prędkości/współczynnik zatrzymania

Ułamek zawartości substancji w fazie nieruchomej wynosi:

k

= 1 - R_f

k + 1

W chromatografii planarnej stosuje się współczynnik R_M

1 - R_f

R_M = log = log k

R_f

Współczynnik selektywności a - wpływa na oddalanie pików

tR_B - t_M k_B

a = =

tR_A - t_M k_A

tR_A, tR_A - czasy retencji substancji A i B

k_A, k_B - współczynniki retencji substancji A i B

Sprawność kolumny

• zdolność kolumny do wytwarzania wąskich pików

• wyznacza się liczbą półek teoretycznych (N), która zależy od liczby równowag wzdłuż kolumny

Półka teoretyczna = objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i nieruchomej.

Kolumna chromatograficzna składa się z N półek toretycznych:

L = N ∙ H

L - długość kolumny; H- wysokość równoważna półce teoretycznej; N - liczba półek

Po wprowadzeniu substancji na „pierwszą półkę” kolumny ulega ona podziałowi między fazę ruchomą i stacjonarną, zgodnie z wartością współczynnika podziału K.

Zdolność rozdzielcza kolumny (R_S)

tR₂ - tR₁

R_S = 2 ∙

w₁ + w₂

tR2, tR1 - czasy retencji substancji 1,2

w_1,w₂ - szerokości pików mierzone przy podstawie

R_S - zależy od:

• selektywności wyrażanej współczynnikiem selektywności a

• sprawności kolumny - liczby półek teoretycznych N

• retencji wyrażonej ułamkiem zawartości substancji w fazie nieruchomej

Klasyfikacja metod chromatograficznych

Podstawę klasyfikacji mogą stanowić:

1. Stan skupienia fazy ruchomej

2. Stan skupienia fazy stacjonarnej

3. Natura zjawisk będących podstawą procesu chromatograficznego

4. Techniki eksperymentalne

Ad 1. Stan skupienia fazy ruchomej

• chromatografia gazowa

• chromatografia cieczowa

• chromatografia fluidalna

Ad 2. Stan skupienia fazy stacjonarnej - ciało stałe lub ciecz na nośniku

Faza ruchoma	Faza stacjonarna	Skrót nazwy
gaz	ciecz	GLC
ciecz	ciecz	LLC
gaz	ciało stałe	GSC
ciecz	ciało stałe	LSC

Ad 3. Natura zjawisk będących podstawą procesu chromatograficznego - zjawiska należące do oddziaływań na granicy faz:

• adsorpcja

• podział substancji między dwie nie mieszające się ciecze

• wymiana jonowa

• powinowactwo chemiczne/biologiczne

• efekty sitowe

Są to:

• chromatografia adsorpcyjna

• chromatografia podziałowa

• chromatografia jonowymienna

• chromatografia sitowa (sączenie molekularne, chromatografia żelowa)

• chromatografia powinowactwa

Chromatografia adsorpcyjna

Rozdział mieszanin jest uwarunkowany różnym powinowactwem adsorpcyjnym składników mieszaniny (adsorbatu) do odpowiednio dobranej fazy stacjonarnej, zwanej adsorbentem

Zalety:

- specyficzność

- uniwersalność

- duże możliwości zmiany warunków rozdziału (zmiana solwentu i adsorbentu)

- czułość

Ograniczenia:

- może być stosowana gdy niewielkie różnice struktury chemicznej pociągają za sobą duże różnice w powinowactwie adsorpcyjnym

- składniki adsorbatu nie mogą reagować ze sobą ani z solwentem czy adsorbentem

- składniki adsorbatu nie mogą być adsorbowane nieodwracalnie przez adsorbent

Klasyfikacja adsorbentów

A. Pod względem natury chemicznej:

1. Nieorganiczne = Al₂O₃, MgO, krzemiany naturalne i syntetyczne

2. Organiczne = węgiel, skrobia, sacharoza, poliamidy

3. Mieszane = talk + cukier; CaCO₃+ talk

4. Specyficzne = silikażel o specyficznych porach; kolumny mocznikowe, z ziemi okrzemkowej pokryte histonem

B. Ze względu na właściwości chemiczne

1. Kwasowe (SiO₂)

2. Zasadowe (CaO)

3. Amfoteryczne (Al₂O₃)

4. Obojętne (węgiel aktywowany

C. Ze względu na zdolność i pojemność adsorpcyjną

1. Silne (aktywowany kwas krzemowy, aktywowany Al₂O₃, aktywowany MgO, ziemia Fullera = uwodnione glinokrzemiany magnezu)

2. Średnie (CaCO₃, CaHPO₄, Ca₃(PO₄)₂, MgO, Ca(OH)₂)

3. Słabe (sacharoza, skrobia, inulina, talk, Na₂CO₂)

D. Ze względu na polarność

1. Silnie polarne (SiO₂, Al₂O₃)

2. Słabo polarne (MgO, CaCO₃)

3. Niepolarne (węgiel aktywowany, grafit, talk)

Szereg eluotropowy rozpuszczalników

eter naftowy

CCl₄

cykloheksan

eter etylowy

aceton

benzen elucja adsorpcja

toluen

estry kwasów organicznych

chloroform

alkohole

H₂O

pirydyna

kwasy organiczne

Klasyfikacja rozpuszczalników

1. Węglowodory (eter naftowy, pentan, heksan, benzen)

2. Pochodne chlorowcowe (chloroform, czterochlorek węgla)

3. Alkohole (metylowy, etylowy, n-propylowy, izo-propylowy)

4. Etery (etylu, butylu, amylu, fenylu)

5. Kwasy organiczne (octowy, laurylowy, palmitynowy)

6. Estry (octan butylu)

7. Zasady organiczne (pirydyna)

8. Różne (woda)

Czynniki wpływające na powinowactwo adsorpcyjne = wpływające na dokładność rozdziału

Zdolność adsorbowania się zależy od właściwości cząsteczek adsorbowanych:

• wielkości

• budowy przestrzennej

• liczby i położenia

- podwójnych wiązań

- podstawników niepolarnych i polarnych

• rodzaju podstawników

• w szeregu homologicznym rośnie wraz z masą cząsteczkową

Szereg adsorpcyjny związków organicznych

kwasy i zasady

związki hydroksylowe, aminowe, tiozwiązki

aldehydy, ketony, estry

związki chlorowcowe

węglowodory nienasycone

węglowodory nasycone

Reguła !

- im większa polarność adsorbatu tym silniejsza adsorpcja na polarnym adsorbencie z niepolarnego solwentu

- im mniejsza polarność adsorbatu tym silniejsza adsorpcja na niepolarnym adsorbencie z polarnego solwentu

Właściwy dobór elementów układu chromatograficznego odbywa się na drodze empirycznej

Chromatografia podziałowa

Poszczególne składniki mieszaniny w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi pomiędzy dwie nie mieszające się fazy:

• ruchomą - gaz, ciecz (najczęściej rozpuszczalnik organiczny)

• stacjonarną - ciecz osadzona na porowatym nośniku (najczęściej H₂O)

Prędkość poruszania się składników mieszaniny w kolumnie

• jest funkcją podziału tych składników w dwu pozostających w stanie równowagi fazach

• składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy stacjonarnej poruszają się wolniej niż składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy ruchomej

Rozdział jest wynikiem różnych szybkości migracji, spowodowanych różnymi wartościami współczynnika podziału (K), który wyraża wzór Nernsta:

K = c_s / c_m

c_s - stężenie molowe substancji w fazie stacjonarnej

c_m - stężenie molowe substancji w fazie ruchomej

V_s

t_R = t_M 1+ K

V_m

V_R = V_m + K ∙ V_s

V_R - objętość retencji próbki

V_s - objętość fazy stacjonarnej

V_m - objętość fazy ruchomej

K - współczynnik podziału

t_R - czas retencji

t_M - czas zerowy

1. Wzrost K powoduje wzrost t_R

2. Wzrost V_s powoduje wzrost t_R

3. t_R zależy od szybkości przepływu fazy ruchomej (_m) - wzrost powoduje skrócenie czasu retencji t_R

t_R = 1/ _m

4. t_R zależy od długości kolumny (L)

Wartość K nie zależy od ilości substancji w przypadku roztworów rozcieńczonych !

W przypadku:

- roztworów stężonych

- gdy fazy graniczące częściowo mieszają się ze sobą

stężenie solutu wyrażamy w gramach na jednostkę objętości

k = c _{faza nieruchoma}/c _{faza ruchoma}

k = stosunek podziału, gdzie [c] = [% m/v]

Stopień rozdziału dwóch substancji A i B = miara selektywności rozdziału

b = k_A/k_B

k_A - stosunek podziału substancji A między fazę ruchomą i nieruchomą

k_B - stosunek podziału substancji B między fazę ruchomą i nieruchomą

Nośniki ciekłej fazy stałej

• nie powinny wykazywać właściwości adsorpcyjnych

• nie powinny wchodzić w reakcje z solwentem (fazą ruchomą)

• nie powinny wchodzić w reakcje z rozdzielanymi substancjami

• powinny wiązać i zatrzymywać fazę nieruchomą

Nośniki zatrzymujące fazę wodną:

• - żel krzemionkowy

• - ziemia okrzemkowa

• - skrobia

• - celuloza

Nośniki o właściwościach hydrofobowych:

• - kauczuk wulkanizowany

• - chlorokauczuk

Faza ruchoma w chromatografii podziałowej

- chloroform

- alkohol butylowy

- alkohol amylowy

- pirydyna

- kolidyna

- chinolina

- krezol

Chromatografia podziałowa fazy normalnej

= nośnik z osadzoną na nim cieczą polarną (najczęściej H₂O) + niepolarny solwent

Chromatografia podziałowa fazy odwróconej (RP)

= nośnik z niepolarna fazą nieruchomą + polarny solwent

Chromatografia jonowymienna

Podstawą podziału są reakcje wymiany jonowej między jonami z roztworu a jonami związanymi z fazą stacjonarną, która stanowią jonity.

Jonity = nierozpuszczalne substancje wielkocząsteczkowe o budowie jonowej, zdolne do wymiany jonów według reakcji:

(MR^{- —} Y⁺)_j + (X⁺)_r -> (MR^{- —} X⁺)_j + (Y⁺)_r (kationit)

(MR^{+ —} Y^-)_j + (X^-)_r -> (MR^{+ —} X^-)_j + (Y^-)_r (anionit)

Kationity = wymieniacze jonowe o charakterze kwasów lub ich soli, wymieniające z roztworem kationy

Anionity = wymieniacze jonowe o charakterze zasad bądź ich soli, wymieniające z roztworem aniony

Pojemność wymienna (zdolność wymienna jonitu) = ilość jonów, która może być wymieniona przez jednostkę masy lub objętości jonitu

[mol/kg wymieniacza] lub [mmol/g wymieniacza]

Cykl jonitacyjny

• sorpcja - jony na jonicie ulegają wymianie na jony w roztworze

• elucja - regeneracja jonitu za pomocą roztworu elektrolitu zawierającego jon wymienny o większym powinowactwie do złoża jonitu niż jon/jony wprowadzone w czasie sorpcji

Czynniki wpływające na proces wymiany jonów

1. Budowa wymieniacza - struktura przestrzenna

- wielkość cząsteczek jonitu

- liczba i rodzaj poprzecznych wiązań = usieciowanie

2. Ilość i rodzaj grup funkcyjnych

- silnie polarne grupy funkcyjne (-SO₃H; =NH₂OH) - zdysocjowane prawie w 100%, wykazują zdolność wymiany jonów w szerokim zakresie pH

- słabiej dysocjujące grupy mogą uczestniczyć w wymianie jonów tylko przy wysokich(-COOH; -OH; -SH) lub niskich (-NH₃OH) wartościach pH

Chromatografia sitowa

Podstawę podziału stanowią różnice w rozmiarach cząsteczek - rozdział zachodzi na skutek różnicy mas cząsteczkowych rozdzielanych związków.

Sita molekularne

1. Sephadex - na bazie dekstranu

2. Sepharose - granulowana forma agaru

3. Sephacryl - całkowicie syntetyczne sito molekularne

Teoria filtracji żelowej

• cząsteczki o określonych rozmiarach dyfundują w głąb ziaren żelu tylko na określoną głębokość

• większe cząsteczki są eluowane wcześniej niż mniejsze

• faza nieruchoma = rozpuszczalnik zalegający wnętrze ziaren żelu

• faza ruchoma = rozpuszczalnik przemieszczający się pomiędzy ziarnami żelu

10

---