Izolowanie DNA z pełnej krwi uproszczoną metodą ekstrakcji fenolowej

Materiał: Krew pełna

Odczynniki:

• Fenol pH 8.0

• Mieszanina: fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1)

• Chloroform

• octan sodu 3M

• Izopropanol

• 70% alkohol etylowy

Procedura izolacji:

1. Do probówki typu eppendorf zawierającej 500 ul fenolu dodać 500 ul krwi,

2. Wytrząsać energicznie (vortex),

3. Wirować (10 minut, 12000xg, w temp. pokojowej),

4. Zebrać fazę wodną do nowej probówki zawierającej 500 ul mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, zworteksować,

5. Wirować (10 minut, 12000xg, w temp. pokojowej),

6. Zebrać fazę wodną do nowej probówki zawierającej równą objętość chloroformu, zworteksować,

7. Wirować (10 minut, 12000xg, w temp. pokojowej),

8. Zebrać fazę wodną do nowej probówki zawierającej 3 objętości izopropanolu i 1/10 objętości octanu sodu,

9. Wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki i wstawić do zamrażarki -80ºC na 10-30 minut,

10. Wyjąć probówki z zamrażarki i wirować (10-30 minut, 12000xg, 4ºC),

11. Delikatnie (uważając na osad na dnie probówki) zebrać supernatant, po czym dodać 500 ul 70% etanolu,

12. Wirować (10-30 minut, 12000xg, 4ºC),

13. Delikatnie (uważając na osad na dnie probówki) zebrać supernatant, suszyć w temp. pokojowej lub 37ºC,

14. Osad rozpuścić w 100ul wody dejonizowanej bądź buforu TE,

* * *

15. Wykonać pomiar absorbancji w spektrofotometrze przy dł. fali 260, 280 i 320 nm w celu oznaczenia ilości oraz czystości preparatu.

16. Odczytać stosunek absorbancji A260/280 (czystość preparatu), oraz obliczyć stężenie z wzoru: A(260-320) x 50 x rozc. = stężenie [ug/ml]

---