Hodowla i identyfikacja bakterii

Metody diagnostyki mikrobiologicznej

• Metody mikroskopowe

• Metody hodowlane

• Metody immunologiczne

• Metody biochemiczne

• Metody oparte na biologii molekularnej

• Ocena lekowrażliwości

1. Preparaty mikroskopowe

	Preparat bezpośredni	Preparat pośredni
Wykonanie	Wykonywany z materiału klinicznego pobranego od pacjenta	Wykonywany z drobnoustrojów wyhodowanych na podłożu mikrobiologicznym
Obraz	Drobnoustroje i komórki pochodzące z materiału, np. erytrocyty, nabłonki itp.	Tylko drobnoustroje
Metody barwienia	Waysona	Grama, Burri-Ginsa, Dornera, Wirtza-Conklina, Ziehl - Neelsena

II. Metody hodowlane

Pożywki bakteryjne

• Obecnie na rynku dostępne są gotowe podłoża i składniki do pożywek, w formie odwodnionej lub proszku o wystandaryzowanym składzie:

• zapewnienie powtarzalności warunków hodowli,

• porównywanie wyników doświadczeń prowadzonych w różnym czasie lub różnych laboratoriach.

• skrócenie czasu przygotowania do doświadczeń.

Podłoże mikrobiologiczne powinno:

• zapewnić odpowiednią ilość przyswajalnych składników pokarmowych, zarówno organicznych, jak i nieorganicznych (energetycznych i budulcowych),

• zawierać określone czynniki wzrostowe,

• mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,

• zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp do tlenu,

• wykazywać właściwą temperaturę i pH.

Podział podłoży

• Ze względu na konsystencję

• Płynne (bulion mięsny, bulion mózgowo-sercowy)

• Półpłynne (0,5-1% agaru)

• Stałe (1,5-3% agaru)

• Ze względu na zawartość substancji

• Syntetyczne (skład chemiczny całkowicie zdefiniowany)

• Półsyntetyczne (skład chemiczny częściowo zdefiniowany)

• Naturalne ( skład chemiczny zdefiniowany w przybliżeniu)

• Ze względu na ilość i jakość składników odżywczych

• Proste (podstawowe) - przeznaczone dla drobnoustrojów o niskich wymaganiach odżywczych, np. Bulion zwykły (płynne), Woda peptonowa (płynne), Agar zwykły (stałe), Żelatyna (stałe).

• Złożone (wzbogacone):

• Rosną na nich bakterie wymagające,

• Składają się z pożywki prostej i składnika wzbogacającego , np. krew zwierzęca, żółtka kurzego.

• Przykłady: agar z krwią (stałe), podłoże Müller-Hinton (stałe; do antybiogramów- hydrolizat kazeiny).

Agar z krwią:

• Pozwala na różnicowanie gatunków i rodzajów - typ hemolizy:

• α - częściowa

• β - całkowita

• γ - brak hemolizy

Müeller-Hinton - podłoże do oceny lekowrażliwości

• Podłoża wybiórczo - namnażające

• Przeznaczone dla określonych drobnoustrojów.

• Zawierają podłoża proste lub wzbogacone, do których dodano substancje przyspieszających wzrost określonych mikroorganizmów i hamujące lub uniemożliwiające wzrost innych.

• Przykład: bulion z żółcią, podłoże SS

• Podłoża wybiórczo - różnicujące

• Są przeznaczone dla wybranych bakterii, które są różnicowane na drodze właściwości biochemicznych

Podłoże Chapmana dla gronkowców :

• czynnik wybiórczy: 7,5% NaCl (hamuje wzrost większości drobnoustrojów

• czynnik różnicujący: mannitol

• Staphylococcus aureus fermentuje mannitol zakwaszając środowisko - duże kolonie otoczone żółtą strefą;

• Staphylococcus epidermidis - mannitolo (-) - małe kolonie bez żółtego zabarwienia)

Podłoże MacConkey'a (MCA) - dla pałeczek Gram - ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae

• czynniki wybiórcze: dezoksycholan sodu i fiolet krystaliczny - hamują wzrost bakterii Gram (+)

• czynnik różnicujący - laktoza

• bakterie rozkładające laktozę (E. coli) tworzą różowo zabarwione kolonie

• bakterie nierozkładające laktozy (Proteus vulgaris) - kolonie przezroczyste

• Pałeczki rozkładające dezoksycholan sodu dają wokół kolonii strefę wytrąconego kwasu dezoksycholowego.

Podłoże Saburaud'a -wybiórcze dla grzybów (obniżone pH, zawiera antybiotyki: cykloheksamid i chloramfenikol)

• Podłoża specjalne - hodowla drobnoustrojów „wybrednych”, o specjalnych wymaganiach wzrostowych

Agar czekoladowy - zawiera zhemolizowaną krew (otrzymuje się przez zagotowanie agaru z krwią, proces ten uwalnia czynniki wzrostowe z krwinek) rosną na nim Haemophillus spp., Neisseria spp.

• Podłoża transportowe - umożliwiają przeżycie bakterii w czasie transportu.

• Podłoża transportowo - namnażające. Ich skład chemiczny umożliwia namnażanie się bakterii w czasie transportu.

Metody wykonania posiewu na podłoża stałe

Posiew redukcyjny - proces posiewania podzielić można na cztery części.

Po pobraniu materiału wcześniej wysterylizowaną w płomieniu palnika ezą należy rozprowadzić go po podłożu do około 40% szerokości szalki Petriego (etap 1).

Następnie sterylizujemy użytą ezę, dla wygody obracamy płytkę o 90° i powtarzamy czynność (etap 2).

Obracamy znów płytkę Petriego (trzymając się obranego kierunku) i powtarzamy czynności (etap 3).

W etapie 4 ezą poruszamy w taki sposób, aby zmieścić się w górnej części etapu trzeciego i wolnej przestrzeni pośrodku. W tym momencie posiew został zakończony, płytkę możemy włożyć do cieplarki.

III. Metody immunologiczne

• Techniki diagnostyczne oparte są na reakcjach immunologicznych antygen (Ag) - przeciwciało (Ig) i stosowane w diagnostyce chorób zakaźnych do wykrywania jakościowo i/lub ilościowo antygenów (identyfikacja drobnoustrojów), bądź przeciwciał w surowicy, płynach ustrojowych, tkankach;

• Reakcje Ag - Ig zależą m.in. od: powinowactwa (affinity) i zachłanności (avidity) Ig do Ag, od obecności innych czynników (dopełniacz), stężenia reagentów, temp. itd.

Podział metod immunologicznych

• Odczyny, w których zachodzi bezpośrednie łączenie się antygenu z przeciwciałem: immunofluorescencja, odczyny radioimmunologiczne i immunoenzymatyczne bezpośrednie.

• Odczyny, w których zachodzą różne reakcje fizykochemiczne (aglutynacja bezpośrednia, aglutynacja pośrednia, koaglutynacja, immunoprecypitacja) lub w których uczestniczą dodatkowe elementy (np. nośniki, dopełniacz).

• Interakcje trzeciorzędowe - wykorzystujące pewne efekty biologiczne np. fagocytoza - opsonizacja, chemotaksja, immunoadherencja.

ODCZYNY AGLUTYNACYJNE

• Aglutynacja - immunochemiczna, swoista agregacja cząstek (bakterie, grzyby, erytrocyty, syntetyczne koloidy) opłaszczonych antygenami lub przeciwciałami.

Aglutynogeny ( Ag) + aglutyniny (Ig) = aglutynant

• Zastosowanie odczynów bezpośrednich:

• odczyn Widala - w diagnostyce duru brzusznego (S. typhi) i durów rzekomych (S. paratyphi A, B lub C),

• odczyn Weil-Felixa - w diagnostyce duru plamistego i innych riketsjoz (zjawisko paraaglutynacji),

• odczyn Weigla - w diagnostyce duru plamistego,

• odczyn Wrighta - w diagnostyce brucelozy (Brucella spp.).

• Zastosowanie odczynów pośrednich:

• do wykrywania obecności czynnika reumatoidalnego (RF) w RZS

• do wykrywania antystreptolizyny O w zakażeniach paciorkowcowych,

• do wykrywania CRP w surowicy (tzw. aglutynacja bierna odwrócona),

• do wykrywania Ag rotawiusów, adenowirusów,

• do identyfikacji bakterii (Streptococcus spp. wg Lancefield, Salmonella spp.)

ODCZYNY LITYCZNE

• Odczyn wiązania dopełniacza (OWD) - wykrywane są Ig (rzadko Ag) wiążące dopełniacz. Warunkiem związania dopełniacza jest powstanie kompleku Ag-Ig. Układ wskaźnikowy (krwinki baranie i przeciwciała dla nich) pozwala uwidocznić przyłączenie się dopełniacza.

• Zastosowanie:

• określenie miana Ig w diagnostyce serologicznej zakażeń Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella typhi, Brucella, Mycobacterium leprae, Listeria monocytogenes,

• diagnostyka zakażeń grzybiczych (kandydiaza, asergiloza) i pasożytniczych (toksoplazmoza, pneumocystodoza), wirusowych (grypa, świnka, cytomegalia, kleszczowe zapalenie mózgu), kiły (odczyn Wassermana WR, wg Kolmera z użyciem Ag krętkowych).

IV. Metody biochemiczne

• Hodowle na pożywkach

• podłoże MacConkey'a, podłoże Chapman'a, podłoże DCA.

• Wykrywanie katalazy (wykonanie: na szkiełku podstawowym z kroplą soli fizjologicznej rozprowadzamy badaną kolonię bakteryjną i obserwujemy efekt pienienia bądź jego brak)

• bakterie katalazo(+) - pienienie (Staphylococcus spp.)

• bakterie katalazo(-) - brak pienienia (Streptococcus spp.)

• Wykrywanie oksydazy (wykrywanie: na badaną kolonię nakrapiamy odczynnika Kovácsa, czyli roztwór dichlorowodorku tetrametylo-p-fenylenodiaminy w 1% wodnym roztworze kwasu askorbowego, i obserwujemy efekt zabarwienia koloni na kolor niebiesko-granatowy w ciągu 10 sekund bądź brak takiego zabarwienia)

• bakterie oksydazo(+) - zabarwienie kolonii (Psudomonas aeruginosa)

• bakterie oksydazo(-) - brak zabarwienia kolonii

Metody biochemiczne

• Testy biochemiczne - szeregi biochemiczne

• Rodzaje szeregów biochemicznych

• Test API

→ 20 Strep - dla paciorkowców

→ Coryne - dla Corynebacterium

→ Staph - dla gronkowców

→ 20 E - dla Enterobacteriacae

• Test ID

→ GN - dla pałeczek laktozo(-)

→ Staph - dla ziarenkowców

→ E - dla Enterobacteriacae (gł. laktozo-)

V. Metody oparte na biologii molekularnej

• Metody amplifikacji kwasów nukleinowych

• amplifikacja sondy molekularnej

• amplifikacja matrycy

VI. Metody oznaczania lekowrażliwości

Inokulum: liczba komórek bakteryjnych w podłożu płynnym, wyrażana jako liczba CFU (Colony Forming Units, jednostki tworzące kolonie) na mililitr.

MIC: (ang. minimal inhibitory concentration) określa najmniejsze stężenie leku, wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie.

MBC: (ang. minimal bactericidal concentration) określa minimalne stężenie leku wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych, przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie.

Antybiogram podstawowy: zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu

Antybiogram rozszerzony: zawiera rozszerzoną listę antybiotyków stosowanych wobec drobnoustrojów wielolekoopornych i/lub izolowanych z ciężkich zakażeń.

Oporność kliniczna: sukces terapeutyczny jest niemożliwy do osiągnięcia, pomimo zastosowania maksymalnych dawek leku.

Oporność krzyżowa: niewrażliwość na wszystkie leki z danej grupy chemicznej, lub czasem niespokrewnionych grup, gdy punkty uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie.

Oporność naturalna: stała cecha danego gatunku.

Oporność nabyta: nowa cecha szczepu wynikająca ze zmian materiału genetycznego.

Oznaczanie lekowrażliwości - metody jakościowe

• Metoda krążkowo-dyfuzyjna Kirby - Bauera

• jest oparta na dyfuzji antybiotyku zawartego w krążku do podłoża.

• jest najczęściej używaną metodą testowania lekowrażliwości: dobrze wystandaryzowana, powtarzalna, relatywnie tania.

• Zasada metody:

• Inoculum przygotować ze świeżej, osiemnastogodzinnej hodowli bakterii na podłożu MHA2. Kilka kolonii bakterii zawiesić w jałowym fizjologicznym roztworze 0,85% NaCl, celem uzyskania zawiesiny o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie od 1 × 10⁸ do 2 × 10⁸ CFU/ml.

• Gotową zawiesinę w ciągu 15 minut rozprowadzić na powierzchni podłoża MHA2 przy użyciu jałowej wymazówki.

• Po 15 minutach na posiane podłoże nałożyć krążki z antybiotykami i chemioterapeutykami. Nakłada się krążki w odległości 24 mm.

• Przygotowane płytki w ciągu następnych 15 minut wstawić do cieplarki i inkubować w warunkach tlenowych 16-18 godzin, w temperaturze 37°C.

• Wyniki interpretować zgodnie z zaleceniami NCCLS, według średnicy uzyskanych stref zahamowania wzrostu.

• Metoda przeglądowa

• Antybiotyk/chemioterapeutyk znajduje się w podłożu, na które wysiewa się badaną kolonię bakteryjną (posiew na całej powierzchni płytki).

• Wzrost drobnoustroju świadczy o oporności na zawarty w podłożu antybiotyk/chemioterapeutyk.

• Brak wzrostu świadczy o wrażliwości.

Oznaczanie lekowrażliwości - metody ilościowe

• E - testy - badanie jest oparte na dyfuzji antybiotyku zawartego w pasku bibułowym w gradiencie stężeń do podłoża, na którym wzrasta badany szczep.

1

Antybiogram - ocena lekowrażliwości

Hodowlę na podłożach wybiórczych

Metody biochemiczne

Metody immunologiczne

Metody molekularne

Identyfikacja poprzez

Preparat pośredni

Posiew na zestaw podłoży rutynowych w zależności od materiału i miejsca zakażenia

Preparat bezpośredni

Materiał od pacjenta

(pobrany adekwatnie do miejsca zakażenia)

---