1. Ocena skuteczności dezynfekcji palców ręki.

• Wykonano posiew ze skóry palców na podłoże stałe agar krwawy za pomocą odcisku palca na płytce.

• Zdezynfekowano palec stosując mydło przez 7 sekund, następnie osuszono papierowym ręcznikiem.

• Po zastosowaniu dezynfekcji wykonano kolejny posiew na agar krwawy metodą odcisku palca na sektorze płytki.

• Płytki wstawiono do cieplarki i inkubowano 48 godzin w temperaturze 37°C

Wykonano preparat Grama: Na szkiełku rysujemy 2 kółka flamastrem oraz numerujemy ją. Uprzednio opaloną ezą pobieramy kropelkę soli fizjologicznej o wzorze NaCl i umieszczamy ją odpowiednio w zakresie kółek, na odwrotnej stronie płytki. Na tak przygotowaną płytkę umieszczamy opaloną ezą bakterie (bliżej numerka płytki bakterie z brudnego palca, dalej numerka - bakterie z jamy nosowej). Czekamy do wyschnięcia preparatu i następnie utrwalamy opalając przy pomocy palnika gazowego, w celu zabicia bakterii i przyklejenia ich do płytki. Należy pamiętać aby opalanie wykonywać stroną odwrotną niż umieszczone bakterie. Po utrwaleniu czekamy około 3 minuty, po czym preparat umieszczamy na podstawce i barwimy przy pomocy pipety, co następuje:

• fiolet krystaliczny (2-3min.),

• płyn Lugola (1-2min.) oraz płuczemy wodą (bakterie G- stają się bezbarwne, a G+ barwią się na różowo),

• alkohol etylowy (30sek.) i płukanie wodą,

• fuksyna zasadowa (1-2min.) oraz płukanie wodą (bakterie G- są widoczne) i suszenie bibułą.

Tak przygotowane bakterie można oglądać pod mikroskopem, dodając kroplę olejku imersyjnego, w celu powiększenia 1,2 raza zdolności rozdzielczej mikroskopu.

2. Ocena nosicielstwa gronkowca złocistego:

• Pobrano własny materiał jałowym wacikiem do posiewów z jamy nosowej

i wykonano posiew na podłoże Chapmana.

• Płytki inkubowano w cieplarce przez 48 godzin w temperaturze 37°C.

• Uzyskano wzrost bakterii, które nie odbarwiają podłoża z koloru malinowego na żółty, co oznacza brak występowania gronkowca złocistego.

• Wykonano preparat metodą Grama.

3. Wykonano posiew redukcyjny bakterii E. coli z hodowli (= metoda izolacji bakterii = uzyskanie pojedynczej kolonii bakterii):

• Pobranie materiału z hodowli uprzednio opaloną ezą i wykonanie posiewu na 1/3 podłoża płytki agar zwykły.

• Ezę opalono i przeciągnięto przez miejsce posiane, po czym rozprowadzenie materiału na kolejnej 1/3 powierzchni płytki, w drugim sektorze.

• Ezę opalono ponownie, przeciągnięto przez drugi sektor i wykonano posiew

w sektorze trzecim.

1. TESTY wykrywające poszczególne bakterie:

- Gronkowiec złocisty (G+) - SST /Staphy Slide Test/ - pobieramy ezą szczep oraz dodajemy kroplę odczynnika. Jeżeli bakterie będą zlepione, to mamy do czynienia z S.aureus.

- Gronkowiec ropny (G+) - test wrażliwości na bacytracynę - jeżeli bakteria nie rośnie, to substancja na nią działa (hamuje wzrost) i mamy do czynienia z S.pyogenes.

- Dwoinka zapalenia płuc (G+) - test wrażliwości na optochinę - korzystając z odpowiednich krążków możemy stwierdzić, czy bakteria jest S.pneumoniae czy nie.

- Dla pałeczek G- stosuje się podłoże ukierunkowane na kilka ich rodzajów - CPE (rodzaj podłoża) - w zależności od koloru, możemy stwierdzić czy dana bakteria to E.coli (barwi na różowo) czy też Klebsiella pneumoniae (barwi podłoże na zielono).

- Dla grzybów stosuje się podłoże chrom-agar - drożdżopodobne rosną podobnie jak bakterie, natomiast Candida albicans rośnie na zielono.

2.SZEREGI BIOCHEMICZNE:

- Obejmują od 20 do 35 reakcji, przy czym jest podział na reakcje fermentacji, syntezy i rozkładu tlenowego (np. hydroliza).

- Uwzględnia się cechy fizjologiczne, jak np. zdolność bakterii do ruchu.

- Kolory: G+ barwią, natomiast ujemne pozostają bezbarwne.

3. AUXOGRAMY:

- Testy asymilacyjne /asymilacja - wykorzystanie jednego związku organicznego jako jedynego źródła węgla/,

- Do probówek dodany jest jeden związek organiczny, na którym odbywa się wzrost bakterii (podczas wzrostu probówka jest zmętniała, natomiast gdy nie rośnie - probówka pozostaje bezbarwna),

- Są to 32 testy (w naszym przypadku ID32GE).

- Testy te wykonuje się dla pałeczek G- i dla grzybów, nie ma natomiast dla pałeczek G+.

Główne metody oznaczania lekowrażliwości:

1. METOSY JAKOŚCIOWE:

a) dyfuzyjno - krążkowa

• Wykorzystuje się standardowe podłoże MH, stałą gęstość bakterii (5⋅10⁵/ml) oraz stałą temperaturę 35°C.

• Nakładamy krążki z antybiotykami oraz inkubujemy od 16 do 24h.

• Wynik: jeśli bakteria jest wrażliwa - pusta strefa wokół szczepu bakterii.

• Oznaczenia: Bakteria oporna - R, Wrażliwa - S, Średnio wrażliwa - I.

b) metoda ATB:

• Stosuje się 2 stężenia antybiotyku, mniejsze i większe; (gdy bakterie nie rosną na żadnej z próbek - bakteria jest wrażliwa; gdy na jednej z próbek obserwujemy wzrost - bakteria jest średnio wrażliwa; gdy na obu próbkach rośnie - bakteria jest oporna).

• Do odczytu wyników służy odpowiednie oprogramowanie komputerowe.

2. METODY ILOŚCIOWE (określa się MIC w mg/l - minimalne stężenie hamujące - w porównaniu do odpowiednich norm):

a) E - testy

• Są najczęściej używane,

• Określa się MIC dla antybiotyku.

b) metoda rozcieńczeń antybiotyku:

• Do uprzednio przygotowanych próbek z bakteriami dodajemy różne stężenia antybiotyku, przy czym każdy kolejny antybiotyk ma stężenie 2-krotnie od poprzedniego.

• Pierwsze stężenie, na którym bakterie nie rosną to MIC.

3. TESTY SPECJALNE i oznaczanie szczepów alarmowych:

a) dla pałeczek G+ metodą oznaczania są E- testy:

- Szczepy alarmowe można określić na podstawie nazwy, np. Salmonella

czy prątek gruźlicy,

- Bakteriami o zmienionej oporności na antybiotyki są:

• Gronkowiec złocisty: MRSA - medycylino - oporny,

VISA - wankomycyno - średnio wrażliwy,

VRSA - wankomycyno - oporny.

• Paciorkowiec kałowy VRE - wankomycyno - oporny Enterococcus,

• Dwoinka zapalenia płuc PRSP (penicylino - oporny).

b) dla pałeczek G- (wraz z MRSA) stosuje się testy specjalne, głównie testy dyfuzyjno - krążkowe:

• ESBL+: oporność na penicyliny i cefalosporyny,

• MBL+: oporność na karbopenemę.

DIAGNOSTYKA MIKROBIOLOGICZNA:

1) I gr. - metody posiewowe: pobranie materiału i hodowla drobnoustroju, np. na hodowlach tkankowych czy komórkowych:

• materiał od pacjenta na podłożu płynnym lub płytkowym,

• bulion,

• zestalenie bulionu - związane z agarem (większość na krwawym; ogólnie jest agar krwawym namnażający i zwykły)

• podłoża wybiórczo namnażające - hamują wzrost zbędnych bakterii, możliwość odróżnienia bakterii;

• Chapmana - czynnik hamujący, zwykła sól kuchenna w st.7,5% (wybiórczo różnicujace).

Schemat metody posiewowej:

• materiał od pacjenta

• preparat,

• posiew na podłożu

• uzyskanie poj. Kolonii (na podstawie wyglądu),

• kolejny preparat (testy do różnicowania),

• izolacja - uzyskanie pojedynczych kolonii (tylko na p.stałym),

• identyfikacja - szeregi biochemiczne, metody antybiogramu,

• oznaczanie wrażliwości na antybiotyki (antybiogram).

2) II gr. - metody serologiczne:

W przypadku d-ustrojów, których nie da się wyhodować na podłożu, nazwę otrzymujemy podczas badania serologicznego. Klasyfikuje się wg IgG i IgM (IgM powstają tylko wtedy, gdy d-ustrój znajduje się w organizmie). Kryteria:

• dla IgM - wyszukanie p - ciał przeciwko konkretnej bakterii,

• dla IgG - 2 razy pobiera się surowicę (4-krotny wzrost miana p - ciał w odstępie 7/10 dni), którą bada się jednocześnie, przy czym przy 2.surowicy powinno być 4x więcej p - ciał,

np. badanie w kierunku kiły i HIV (najczęściej stosuje się odczyn tani; musi wyjść odczyn dodatni - 100% lub ujemny; w 2. turze powtarza się tylko wyniki dodatnie. Najprostszy odczyn - aglutacyjny - zlepianie się dużych cząstek - surowicę rozcieńcza się w soli fizjol., dodaje antygen, ogrzewa w cieplarce i obserwacje).

KIŁA - I ETAP:

- odczyn VDRL - subst. występująca w sercach wołowych (kardiolipina) ma 1 miejsce wiążące (determinanta) identyczne jak krętki kiły, tzw. antygen zastępczy.

- kardiolipina na szkiełku + surowica pacjenta = r-cja precypitacji (bakterie rozpuszczają się),

- VDRL+ : może być kiła lub ciąża, zapalenie płuc wywołane przez Mycoplasmę,

VDRL- : zdrowy pacjent.

II ETAP:

- choroby kolagenozy, cukrzyca - trzeba powtórzyć

- kardiolipina ma determinante antygenową jak krętek ale oprócz tego ma 10 innych, które mogą wchodzić w reakcje z innymi p - ciałami.

- odczyn potwierdzający FTA ABS - odczyn immunofluorescencji pośredniej(do szkiełka przykleja się zabite krętki, dalej nawarstwia się surowicę pacjenta; płuczemy; żeby określić czy p - ciała się przykleiły, korzysta się z ukł. wskaźnikowego - p - ciała przeciwko p - ciałom sprzężone z barwnikiem fluorescensyjnym; takie szkiełko pod mikroskop - jeśli są obecne krętki: świecące sprężynki).

HIV - I ETAP: odczyn immunoenzymatyczny ELISA

- do ścianki naczynia fabrycznie przyklejony jest wirus; na to surowica pacjenta; dalej surowica immunoglobulinowa (anty-);

- po wypłukaniu - wyznakowanie enzymem peroksydazą chrzanową. Aby przekonać się, że enzym się przyłączył, trzeba wywołać reakcję - dodać substrat, który po wejściu w reakcję zabarwia się.

- mierzy się stopień zabarwienia - ilość p - ciał -> metoda ilościowa!

II ETAP:

- HIV ma 9 determinant antygenowych (różnych), 6 z nich występuje na inncyh spokrewnionych wirusach

- powtórzenie badań z 9 determinantami stosując ten sam odczyn ELISA - western blotting (rozdzielenie),

- są określone 3 determinanty, które wywołują HIV; gdy reszta (6) jest określonych jako dodatnie to jest wirus, jeśli 3 są dodatnie - coś innego.

3) III gr. - metoda genetyczna:

nazwa d - ustrojów na podstawie fragmentu znanego genu z DNA;

1. METODA PCR:

każdy gen ma inna sekwencję genetyczną, szuka się kawałka DNA kodującego daną determinantę. Z 1 fragmentu można namnożyć milion tych samych. To, czego szukamy, musiało być wcześniej zsekwencjonowane. Należy pobrać materiał od pacjenta taki, gdzie jest podejrzenie o występowaniu odp.fragmentu.

W ten sposób diagnozuje się wzw typu B, gdzoe jest 100% zakaźność drogą płciową. Typ C - zakaźność jest mniejsza (1-2%) - na narzędziasz chirurgicznych, igłach itp.; stwarza niebezpieczeństwo.

2. ODCZYN IMMUNOENZYMATYCZNY ELISA

3. AMPLIFIKACJA - NAMNAŻANIE DNA:

- W obrębie genu - regiony konserwatywne są wybierane do tej metody.

- Potrzebne są fragmenty prątka i końca genu zsyntetyzowanego (para polimerów), wykorzystuje się odczynniki: mieszanina nukleotydów i polmeraza TAQ (umożliwia ona metodę PCR - enzym wytrzymuje do 90stC). Po podgrzaniu helisa Dna rozdziela się na pojedyncze nici, z których każdą ponownie ogrzewamy (powstają kolejno 2, 4, 8 itd. kopii).

- Sprawdzamy wielkość namnożonych cząstek (fragmentów DNA) - próbkę puszczamy na żelu agarozowym, nakłada się próbki, czekamy ok. 1h (rozdział pod napięciem), wyjmujemy i barwimy.

- DNA można z żelu wyizolować i zrobić wyznaczniki (fragment genów konserwatywnych dla sprawdzenia ojcostwa, co sprawdza się z DNA pacjenta).

2