ĆWICZENIE 6

Kataliza enzymatyczna. Chemiczny i biochemiczny rozkład polisacharydów

Oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wohlgemuta

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest porównanie skuteczności i warunków procesu rozkładu skrobi. Porównanie polega na obserwacji procesów: chemicznego (pod wpływem ogrzewania w środowisku silnie kwaśnym) i enzymatycznego(w obecności amylazy zawartej w ślinie)

Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wohlgemuta

Zasada:

Za jednostkę wzorcową aktywności przyjmuje się w tej metodzie taką ilość enzymu, która w czasie 30 min. rozkłada do stadium achrodekstryn 1 mg skrobi. Wynik podaje się w mililitrach roztworu 0,1 % skrobi rozłożone w czasie 30 min przez 1 ml śliny.

UWAGA: Rozpad cząsteczek skrobi przebiega przez trzy stadia pośrednie:

1. stadium dekstryn, wśród których tworzą się kolejno:

• amylodekstryny - barwią się z jodem na niebiesko-fiołkowo

• erytrodekstryny - barwią się z jodem na czerwono

• achrodekstryny - nie barwią się z jodem

2. stadium maltozy

3. stadium glukozy.

Ostatecznym produktem rozkładu skrobi jest glukoza.

Wykonanie:

1. Do 1 ml śliny dodać 4 ml buforu cytrynowo-fosforanowego i wymieszać.

2. W statywie przygotować 10 probówek

3. Do pierwszej z nich odmierzyć 4 ml sporządzonego uprzednio roztworu śliny a do następnych po 2 ml buforu cytrynowo-fosforanowego

4. Z pierwszej probówki pobrać 2 ml roztworu i przenieść do probówki drugiej. Wymieszać!

5. Z drugiej probówki pobrać 2 ml r-ru i przenieść do trzeciej. Wymieszać! itd. ...

6. Z 10 probówki pobrać 2 ml i odrzucić.

7. Otrzymuje się w ten sposób następujące rozcieńczenia śliny:

8. 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560, co odpowiada następującym ilościom śliny w probówkach: 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 0_,0125; 0,006 ml.

9. Do każdej probówki dodać po 2ml 0,2 % roztworu skrobi w 0,9 % NaCl (jony chlorkowe są aktywatorami amylazy)

10. Zawartość wszystkich probówek dokładnie wymieszać i pozostawić na 5 min.

11. Po upływie 5 min do każdej probówki dodać po 3 krople jodu w jodku potasu, zaczynając dodawanie od probówki zawierającej ślinę najbardziej rozcieńczoną (ostatniej w szeregu) i pozostawić na 30 min.

12. Zaobserwować, w której probówce reakcja z jodem będzie ujemna (stadium achrodekstryn)

13. Obliczyć aktywność amylazy śliny wyrażając ją liczbą równą ilości ml 0,2 % roztworu skrobi rozłożonego w czasie 30 min.

Przykład obliczeń:

Przypuśćmy, że stadium achrodekstryn wystąpiło w probówce 4. Ilość skrobi w tej probówce równa jest 2 ml. Czyli w probówce 4 nastąpił rozkład 2 ml roztworu skrobi po czasie 30 min.

Ponieważ próba ta zawierała 0,05 ml pierwotnej śliny otrzymujemy proporcję:

0,05 ml śliny rozkłada - 2 ml roztworu 0,2 % skrobi

1,0 ml śliny rozkłada - x ml skrobi

x = 2 : 0,05 = 40

Czyli 1 ml śliny rozłoży 40 ml roztworu skrobi. Aktywność amylazy wynosi więc 40 jednostek.

3. Kwasowa hydroliza skrobi:

Wykonanie:

1. Przygotować 20 probówek ustawiając je w dwóch szeregach. Do pierwszego szeregu wprowadzić po jednej kropli rozcieńczonego roztworu jodu w jodku potasu.

2. W zlewce przygotować roztwór: 45 ml kleiku skrobiowego + 18 ml 2n kwasu siarkowego. Dobrze wymieszać.

3. Do pierwszych 2 probówek stojących naprzeciw siebie wprowadzić po 1 ml uprzednio przygotowanego roztworu kleiku skrobiowego z kwasem.

4. Pozostałą zawartość zlewki ogrzewać do wrzenia i co 90 sek. pobierać po 2 ml płynu i rozlać jak poprzednio do 2 probówek. Pobieranie prowadzić do momentu zaniku barwy z jodem.

5. W probówkach zawierających jod wyróżnić kolejne stadia hydrolizy skrobi.

6. Poprosić prowadzącego o wytypowanie probówek z produktami hydrolizy skrobi dla których wykonana zostanie reakcja Fehlinga.

7. Zawartość wytypowanych probówek zobojętnić NaOH (papierek wskaźnikowy) i wykonać reakcję Fehlinga, uchwycić moment kiedy reakcja ta wypada dodatnio i zaobserwować wzrastającą wydajność tej reakcji w trakcie przebiegu hydrolizy.

Wykonanie reakcji Fehlinga: W probówce (czystej) zmieszać 1 ml roztworu Fehlinga I i 1ml roztworu Fehlinga II. Przygotować cztery probówki z mieszaniną roztworów Fehlinga. Zawartość probówek (z roztworami Fehlinga i zobojętnionym roztworem kleiku skrobiowego) ogrzać do wrzenia. Obydwa roztwory zlać razem. Zaobserwować występujące zabarwienie.

W sprawozdaniu opisać i porównać obydwa procesy, zanotować obserwacje i wyciągnąć wnioski (kolory i produkty rozkładu).