cwiczenie 6bioch, RÓŻNE, Wiedza, BIOCHEMIA


ĆWICZENIE 6

Kataliza enzymatyczna. Chemiczny i biochemiczny rozkład polisacharydów

Oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wohlgemuta

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest porównanie skuteczności i warunków procesu rozkładu skrobi. Porównanie polega na obserwacji procesów: chemicznego (pod wpływem ogrzewania w środowisku silnie kwaśnym) i enzymatycznego(w obecności amylazy zawartej w ślinie)

Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wohlgemuta

Zasada:

Za jednostkę wzorcową aktywności przyjmuje się w tej metodzie taką ilość enzymu, która w czasie 30 min. rozkłada do stadium achrodekstryn 1 mg skrobi. Wynik podaje się w mililitrach roztworu 0,1 % skrobi rozłożone w czasie 30 min przez 1 ml śliny.

UWAGA: Rozpad cząsteczek skrobi przebiega przez trzy stadia pośrednie:

1. stadium dekstryn, wśród których tworzą się kolejno:

2. stadium maltozy

3. stadium glukozy.

Ostatecznym produktem rozkładu skrobi jest glukoza.

Wykonanie:

  1. Do 1 ml śliny dodać 4 ml buforu cytrynowo-fosforanowego i wymieszać.

  2. W statywie przygotować 10 probówek

  3. Do pierwszej z nich odmierzyć 4 ml sporządzonego uprzednio roztworu śliny a do następnych po 2 ml buforu cytrynowo-fosforanowego

  4. Z pierwszej probówki pobrać 2 ml roztworu i przenieść do probówki drugiej. Wymieszać!

  5. Z drugiej probówki pobrać 2 ml r-ru i przenieść do trzeciej. Wymieszać! itd. ...

  6. Z 10 probówki pobrać 2 ml i odrzucić.

  7. Otrzymuje się w ten sposób następujące rozcieńczenia śliny:

  8. 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560, co odpowiada następującym ilościom śliny w probówkach: 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 0,0125; 0,006 ml.

  9. Do każdej probówki dodać po 2ml 0,2 % roztworu skrobi w 0,9 % NaCl (jony chlorkowe są aktywatorami amylazy)

  10. Zawartość wszystkich probówek dokładnie wymieszać i pozostawić na 5 min.

  11. Po upływie 5 min do każdej probówki dodać po 3 krople jodu w jodku potasu, zaczynając dodawanie od probówki zawierającej ślinę najbardziej rozcieńczoną (ostatniej w szeregu) i pozostawić na 30 min.

  12. Zaobserwować, w której probówce reakcja z jodem będzie ujemna (stadium achrodekstryn)

  13. Obliczyć aktywność amylazy śliny wyrażając ją liczbą równą ilości ml 0,2 % roztworu skrobi rozłożonego w czasie 30 min.

Przykład obliczeń:

Przypuśćmy, że stadium achrodekstryn wystąpiło w probówce 4. Ilość skrobi w tej probówce równa jest 2 ml. Czyli w probówce 4 nastąpił rozkład 2 ml roztworu skrobi po czasie 30 min.

Ponieważ próba ta zawierała 0,05 ml pierwotnej śliny otrzymujemy proporcję:

0,05 ml śliny rozkłada - 2 ml roztworu 0,2 % skrobi

1,0 ml śliny rozkłada - x ml skrobi

x = 2 : 0,05 = 40

Czyli 1 ml śliny rozłoży 40 ml roztworu skrobi. Aktywność amylazy wynosi więc 40 jednostek.

3. Kwasowa hydroliza skrobi:

Wykonanie:

  1. Przygotować 20 probówek ustawiając je w dwóch szeregach. Do pierwszego szeregu wprowadzić po jednej kropli rozcieńczonego roztworu jodu w jodku potasu.

  2. W zlewce przygotować roztwór: 45 ml kleiku skrobiowego + 18 ml 2n kwasu siarkowego. Dobrze wymieszać.

  3. Do pierwszych 2 probówek stojących naprzeciw siebie wprowadzić po 1 ml uprzednio przygotowanego roztworu kleiku skrobiowego z kwasem.

  4. Pozostałą zawartość zlewki ogrzewać do wrzenia i co 90 sek. pobierać po 2 ml płynu i rozlać jak poprzednio do 2 probówek. Pobieranie prowadzić do momentu zaniku barwy z jodem.

  5. W probówkach zawierających jod wyróżnić kolejne stadia hydrolizy skrobi.

  6. Poprosić prowadzącego o wytypowanie probówek z produktami hydrolizy skrobi dla których wykonana zostanie reakcja Fehlinga.

  7. Zawartość wytypowanych probówek zobojętnić NaOH (papierek wskaźnikowy) i wykonać reakcję Fehlinga, uchwycić moment kiedy reakcja ta wypada dodatnio i zaobserwować wzrastającą wydajność tej reakcji w trakcie przebiegu hydrolizy.

Wykonanie reakcji Fehlinga: W probówce (czystej) zmieszać 1 ml roztworu Fehlinga I i 1ml roztworu Fehlinga II. Przygotować cztery probówki z mieszaniną roztworów Fehlinga. Zawartość probówek (z roztworami Fehlinga i zobojętnionym roztworem kleiku skrobiowego) ogrzać do wrzenia. Obydwa roztwory zlać razem. Zaobserwować występujące zabarwienie.

W sprawozdaniu opisać i porównać obydwa procesy, zanotować obserwacje i wyciągnąć wnioski (kolory i produkty rozkładu).



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
cwiczenie 5bioch, RÓŻNE, Wiedza, BIOCHEMIA
cwiczenie 2bioch, RÓŻNE, Wiedza, BIOCHEMIA
cwiczenie 1bioch, RÓŻNE, Wiedza, BIOCHEMIA
cwiczenie 3bioch, RÓŻNE, Wiedza, BIOCHEMIA
tluszcze, RÓŻNE, Wiedza, BIOCHEMIA
zagadnienia do kolokwium, RÓŻNE, Wiedza, BIOCHEMIA
tluszcze, RÓŻNE, Wiedza, BIOCHEMIA
cwiczenia kury, rózne tematy, zwierzęta
Podzial metod analiza instrumentalna, RÓŻNE, Wiedza, CHEMIA
ćwiczenia gimnastyczne różne, ćwiczenia i zabawy gimnastyczne
Ćwiczenie 5 sem 2 na stronę, Biochemia
ĆWICZENIA USPRAWNIAJĄCE FUNKCJE MOTORYCZNE, GOTOWOŚĆ SZKOLNA, DOKSZTAŁCANIE, GRAFOMOTORYKA, ĆWICZENI
Cwiczenie7, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
obowi zek szkole w zakresie bhp, RÓŻNE, Wiedza, BHP
ćwiczenia w opisie, rózne tematy, pięć zmysłów
karta-szkolenia-wstpnego, RÓŻNE, Wiedza, BHP
Kinezjologia edukacyjna- ćwiczenia, dokumenty różne

więcej podobnych podstron