METODA SANGERA-Reakcja sekwencjonowania DNA

Polega na enzymatycznej replikacji materiału DNA w obecności deoksyrybonukleotydów(dd NTP)

Matryca Dna jest jednoniciowa

-fragm. unikalnego genomowego DNA

-homogenny produkt PCR

-Pojedynczy klon DNA

Etapy:

1.synteza drugiej nici DNA

do 4 probówek oznaczonych A,C,G,T wprowadzamy:

-matrycę

-jeden starter

-mieszaninę 4 dd NTP

-odpowiedni bufor

-polimerazę DNA

-jeden z dd NTP (A,G,C,T)

Polimerazy DNA są wybiórcze wobec dd NTP;

Jego stężenie musi być odpowiednio wysokie

Wbudowanie dd NTP do nowopowstałego łańcucha DNA kończy replikację

2.denaturacja produktów syntezy

3.Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym na kliszy RTG

Do reakcji 1 wprowadza się jeden nukleotyd d NTP lub starter wyznakowany radioizotopem 32P lub 21S.Po autoradiografii na kliszy RTG uwidocznione są prążki .

---