W 1988 roku Audrey rozpoczęła swoją misję jako Ambasador Dobrej Woli przy UNICEFie. Jednym z powodów tej decyzji były przeżycia wyniesione z czasów wojny, kiedy to także UNICEF świadczył pomoc dzieciom w zniszczonym Arnhem. W podróż wyruszyła razem ze swoimi przyjaciółmi - Robertem Woldersem i Christą Roth oraz fotografem - Johnem Isaaciem, a ich zadaniem było zwrócenie uwagi świata na pilność niesienia pomocy krajom postkolonialnym.
Przez pięć lat, aż do śmierci w 1993 roku, Audrey poświęcała cały swój czas pracy dla organizacji, która często wiązała się z wielkim obciążeniem zarówno natury fizycznej jak i emocjonalnej. Jako Ambasador uczestniczyła w ponad pięćdziesięciu wyprawach, między innymi do Sudanu, Salwadoru, Hondurasu, Meksyku, Wenezueli, Ekwadoru, Bangladeszu, Wietnamu, Tajlandii, Etiopii, Sudanu, Erytrei i Somalii. Podróże te uświadomiły Hepburn w jak nieludzkich warunkach zmuszone są żyć dzieci w krajach wyniszczonych przez wojny oraz nieustającą suszę. Spowodowało to, że aktorka wszystkimi siłami zbierała fundusze w celu pomocy oraz przekazywała swą wiedzę Specjalnemu Zgromadzeniu przy ONZ. Dzieliła się także szczegółami podróży z prasą, podnosząc w ten sposób ogólną świadomość ludzi na temat konieczności niesienia natychmiastowej pomocy dzieciom dotkniętych biedą.
Jej pierwszą misją była podróż do Etiopii (1988), podczas której odwiedziła sierociniec w Mek'ele. W budynku mieszkało 500 głodujących dzieci, a jej zadaniem było przysłanie przez UNICEF niezbędnego jedzienia. Po powrocie Hepburn mówiła: "mam złamane serce. Jestem załamana. Nie mogę znieść myśli, że dwa miliony ludzi jest nieustannie zagrożonych śmiercią głodową, w tym wiele dzieci, nie z powodu tego, że nie ma jedzenia. Bowiem nie może być ono rozprowadzane. Zeszłą wiosną pracownicy Czerwonego Krzyża i UNICEFu zmuszeni zostali do wycofania się z północnych prowincji, z powodu toczących się jednocześnie dwóch wojen domowych. Pojechałam tam i widziałam matki z dziećmi, które szły przez dziesięć dni, nawet trzy tygodnie, poszukując jedzenia. Mieszkały na pustyni w prowizorycznych obozach, gdzie mogły umrzeć. To dla mnie za wiele. Nie lubię określenia 'Trzeci Świat', ponieważ jesteśmy jednym światem, ale chcę pokazać ludziom, że największa część ludzkości cierpi".
W październiku 1988 roku Hepburn poleciała do Ameryki Południowej. O pobycie w Ekwadorze i Wenezueli mówiła następująco: "widziałam malutkie górskie społeczności, slumsy i zapuszczone miasteczka, gdzie została doprowadzona woda przez jakiś cud - tym cudem był UNICEF. Oglądałam chłopców budujących ich szkołę z cegieł i cementu dostarczonego przez UNICEF".
W lutym 1989 roku Audrey spotkała się z przywódcami Hondurasu, Salwadoru i Gwatemali. Dwa miesiące później odwiedziła Sudan w ramach misji o nazwie "Operacja Linia Życia", gdzie z powodu wojny domowej wstrzymano dostawy żywności. Misja polegała na przewiezieniu promem jedzenia do południowego Sudanu. Aktorka później mówiła: "dostrzegłam jedną rażącą prawdę - to nie są naturalne katastrofy, ale tragedie spowodowane przez człowieka, dla których drugi człowiek może mieć tylko jedno rozwiązanie - pokój". O podróży do Bangladeszu, John Isaac mówił później, że "dzieci często pokryte były w całości muchami, ale ona [Hepburn] po prostu do nich podchodziła i je przytulała. Nigdy czegoś takiego nie widziałem. Inni ludzie najpierw by się zawahali, ale ona po prostu się do nich garnęła".
W październiku 1990 roku, Hepburn poleciała do Wietnamu aby podjąć starania o współpracę z rządem nad nadzorowanym przez UNICEF międzynarodowym programie oczyszczania wody i szczepień.
We wrześniu 1992 roku, na cztery miesiące przed śmiercią, Audrey wyruszyła do Somalii. To, co zobaczyła, nazwała "apokaliptycznym" i stwierdziła - "przeżyłam koszmar. Widziałam głód w Etiopii i Bangladeszu, ale nie widziałam czegoś takiego jak tu. Czegoś takiego nie potrafiłam sobie nawet wyobrazić. Nie byłam na to przygotowana". Pomimo przeżytego szoku, Hepburn miała ciągle nadzieję, że możliwa jest zmiana tego stanu rzeczy - "opiekowanie się dziećmi nie ma żadnego związku z polityką. Być może z czasem, zamiast polityzacji ruchu humanitarnego, nastąpi humanizacja polityki".
Za swoją pracę dla organizacji w 1992 roku prezydent George Bush odznaczył aktorkę Prezydenckim Medalem Wolności.
W 1993 roku, synowie Audrey - Sean H. Ferrer i Luca Dotti, a także jej przyjaciel Robert Wolders stworzyli fundację imienia aktorki (The Audrey Hepburn Memorial Fund) w Stanach Zjednoczonych. Upamiętnia ona zaangażowanie Audrey na rzecz dzieci jako Ambasadora Dobrej Woli.
Do dnia dzisiejszego fundacja, działając przy UNICEFie, zebrała ponad milion dolarów na rzecz programów edukacyjnych w Erytrei, Etiopii, Rwandzie, Sudanie i Somalii.
Obecnie Ambasadorami Dobrej Woli są Sir Richard Attenborough, Emmanuelle Beart, David Beckham, Jackie Chan, Mia Farrow, Roger Federer, Whoopi Goldberg, Ricky Martin, Sir Roger Moore, Vanessa Redgrave, Jessica Lange, Susan Sarandon i Shakira.