MIKROBIOLOGIA

ĆWICZENIE 1.

1.1. Kolumna Winogradzkiego czyli biosfera w butelce

Doświadczenie ma na celu obserwacje bakterii żyjących w glebie. Bakterie fotosyntetyzujące wykorzystują bakteriochlorofile w celu wygenerowania elektronów do syntezy ATP i używają siarki oraz związków zawierających siarkę, wodoru lub związków organicznych jako donorów elektronów. Bakteriochlorofil nadaje bakteriom zielonym charakterystyczną zieloną barwę. Na skutek obecności barwników karotenoidowych w komórce, bakterie te mogą przyjąć barwę brunatną. Bakterie purpurowe zabarwione są na czerwono lub purpurowo na skutek dużej ilości karotenoidów. Bakterie te również posiadają bakteriochlorofile. Ze względu na posiadane barwniki są one w stanie wykorzystywać różne barwy światła. Niektóre bakterie fotosyntetyzujące magazynują ziarenka siarki wewnątrz lub na zewnątrz komórek. Zmagazynowana siarka może zostać wykorzystana jako donor elektronów w czasie fotosyntezy na skutek czego tworzą się siarczany. W naturze, dwutlenek siarki tworzy się na skutek redukcji siarczanów, w procesie oddychania beztlenowego i na skutek degradacji aminokwasów zawierających siarkę. Siarczany mogą być redukowane do dwutlenku siarki u pięciu rodzajów bakterii redukujących siarkę (najbardziej znanym jest rodzaj Desulfovibrio). Dwutlenek siarki wykorzystywany przez bakterie fotosyntetyzujące powstaje podczas fermentacji węglowodanów w środowisku beztlenowym.

Różne bakterie potrzebują również odmiennej ilości tlenu. Powierzchniowe warstwy mułu jeziornego lub gleby cechuje duża dostępność tlenu. W niższych warstwach ta dostępność się zmniejsza. Bakterie którym do życia niezbędny jest tlen nazywamy aerobowymi (tlenowymi). Żyją one na powierzchni gleby albo blisko niej. Z kolei bakterie anaerobowe (beztlenowe) nie tolerują tlenu cząsteczkowego w otoczeniu i żyją w głębszych warstwach gleby.

Na ćwiczeniach prezentowana będzie kolumna Winogradzkiego - technika pozwalająca na obserwację mikroorganizmów tlenowych i beztlenowych . W kolumnie widoczne są strefy zasiedlone przez organizmy o zróżnicowanej tolerancji na obecność tlenu i siarkowodoru.

MATERIAŁY

• szeroki słoik z pokrywką albo 4 czyste plastikowe butelki po napojach z usuniętymi etykietami ( jeżeli używasz butelek musisz uciąć górną część butelki, ta część może w dalszej części ćwiczenia zostać użyta jako lejek. Do zamknięcia butelki będzie potrzebna czysta, wytrzymała folia do żywności i gumka.

• marker

• taśma

• wiaderko

• lejek

• miarka

• szklane mieszadło

• małe wiaderko gleby albo błota oraz małe wiaderko wody pobranej z tego samego miejsca (w przypadku gleby pobranej z suchego terenu użyć wody destylowanej). Na ćwiczeniach poszczególne grupy będą używać gleby pobranej z różnych miejsc (np. staw, strumień, las)

• 1 kartka z gazety

• 1/2 kubka sproszkowanej kredy

• Źródło światła (żarówka 20 lub 40 Wat)

PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA

1. Przed rozpoczęciem doświadczenia należy umyć ręce.

2. Potargać kartkę papieru gazetowego na drobne kawałki.

3. Do wiaderka wsypać 5-6 kubków gleby zebranej w danym miejscu. Usuń z niej patyki, liście i kamyki. Mieszając dodawaj powoli wody do czasu aż mieszanina nabierze konsystencji kremu. Ilość wody jaką potrzebujesz zależy od tego jak była wilgotna gleba na początku. Dodaj kawałki papieru i 2 łyżki sproszkowanej kredy. Wymieszaj delikatnie. Upewnij się, że mieszanina jest wystarczająco wilgotna aby przelać ją do butelki przez lejek.

4. Używając taśmy, przygotuj etykiety na słoiki lub butelki ( z informacją o miejscu pobrania). Za pomocą lejka napełnij słoik lub butelkę do wysokości ok. 2 cm od dna. Następnie należy ubić mieszaninę i usunąć pęcherze powietrza poprzez delikatne uderzanie butelką o stół. Napełniaj butelkę co jakiś czas ubijając zawartość. Pozostaw około 2 cm wolnego miejsca i zakręć słoik. Jeżeli użyłeś butelki zamknij ją szczelnie folią i gumką.

5. Umieść słoiki/butelki w dobrze oświetlonym miejscu, ale nie bezpośrednio na słońcu, w temperaturze pokojowej.

6. Kolumnę obserwuje się w tygodniowych odstępach obserwując i notując pojawianie się barwnych odcinków.

PYTANIA

1. Jakie są różnice w kolorze zawartości słoików/butelek?

2. Co wywołuje czerwoną, pomarańczową, zieloną, białą i czarną barwę?

3. Dlaczego pewne barwy pojawiają się w danym miejscu, a nie ma ich w innych?

4. Co się stanie jeżeli będziesz trzymać słoiki/butelki w ciemnym miejscu?

5. Co się stanie jeżeli wystawisz słoiki/butelki na działanie silnego światła?

6. Co się stanie jeżeli nakryjesz słoiki/butelki kolorową folią?

1.3. Znaczenie mikroorganizmów w hodowli roślin - inokulacja grzybami mikoryzowymi oraz bakteriami brodawkowymi

Grzyby z gromady Glomeromycota wchodzą w związki symbiotyczne tworząc tzw. mikoryzę arbuskularną (jeden z typów endomikoryzy) z 85% gatunków roślin naczyniowych. W endomikoryzie grzyb wytwarza grzybnię, rosnącą po powierzchni korzenia; grzybnia wykształca system strzępek absorpcyjnych, pobierających sole mineralne i wodę z podłoża oraz nadaje glebie właściwą strukturę (dzięki łączeniu jej w grudki za pomocą substancji śluzowych). Grzybnia będąca w kontakcie z korzeniem wykształca apresoria (przylgowate rozszerzenia strzępek), wnika do wnętrza korzenia, gdzie strzępki tworzą grzybnię międzykomórkową i wewnątrzkomórkową. Ta ostatnia tworzy zwoje (peletony), drzewkowate arbuskule, służące wymianie substancji pomiędzy symbiontami oraz pęcherzyki pełniące funkcje magazynujące. Glomus jest jednym z najczęściej spotykanych rodzajów grzybów tworzących endomikoryzę. Przyczynia się do podniesienia wydajności upraw poprzez wzrost ilości pobieranych substancji pokarmowych, zwiększenie odporności na suszę i zasolenie, wzrost tolerancji na patogeny.

Bakterie brodawkowe to symbiotyczni partnerzy roślin motylkowych (Fabaceae). Tworzą one na korzeniach roślin narośla, zwane brodawkami, gdzie w warunkach beztlenowych przeprowadzają proces wiązania azotu atmosferycznego. Kluczową rolę w asymilacji azotu odgrywa enzym nitrogenaza, która katalizuję rekację:

N₂ + 6 H + energia → 2 NH₃

Energię potrzebną do przeprowadzenia tego procesu dostarcza partner roślinny, otrzymując w zamian produkty asymilacji azotu. Bakterie brodawkowe odgrywają ważną rolę w funkcjonowania środowiska glebowego, biorąc udział w obiegu azotu.

Rośliny motylkowe tworzą więc tzw podwójną symbiozę - z arbuskularnymi grzybami mikoryzowymi oraz bakteriami brodawkowymi. Dzięki temu w istotny sposób poprawia się ich zaopatrzenie w fosfor i azot - pierwiastków, których dostępność w wielu glebach jest ograniczona.

MATERIAŁY:

• Inokulum arbuskularnego grzyba mikoryzowego

• 2 doniczki

• sterylne podłoże (piasek + glinka wulkaniczna + mączka fosforytowa)

• nasiona Medicago sativa

• system korzeniowy M. sativa z brodawkami korzeniowymi

• 5% H₂O₂

PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA:

1. Odkażanie doniczek. Używając 75% alkoholu przetrzyj dokładnie doniczki w środku. Opisz doniczki numerem grupy i, podaj datę i nazwę wysiewanej rośliny (Medicago sativa), oraz odpowiednio jedną doniczkę oznacz jako `Kontrola', drugą `Mikoryza + bakterie brodawkowe'.

2. Napełnij doniczki podłożem do wysokości 2 cm od górnej krawędzi. Zwilż podłoże wodą dejonizowaną z tryskawki.

3. Do odpowiednich doniczek dodaj ok. 1 małej łyżeczki inokulum grzyba mikoryzowego Glomus sp. Doniczka oznaczona `Kontrola' pozostawiona będzie bez inokulum grzybowego.

4. Dopełnij doniczki podłożem i wysiej ok. 10 nasion do każdej z nich.

5. Przy pomocy wody dejonizowanej zwilż powierzchnię podłoża z wysianymi nasionami. Należy również dolewać wodę na podstawki doniczek, dopóki podłoże nie osiągnie 100% wilgotności.

6. Przy użyciu skalpela odetnij dwie brodawki korzeniowe i umieść je na 5 minut w 5% roztworze H₂O₂. Po upływie tego czasu, rozgnieć je na czystym szkiełku zegarkowym i zawieś w 3 ml sterylnej wody. Uzyskaną zawiesinę wprowadź do podłoża w doniczce `Mikoryza + bakterie brodawkowe' przy użyciu zakraplacza.

Dalsza część doświadczenia, wykonywana po ok. 3 miesiącach od założenia hodowli:

7. Obserwacja pod mikroskopem struktur charakterystycznych dla mikoryzy arbuskularnej (arbuskule, pęcherzyki, strzępki) oraz bodawek korzeniowych. Wykonaj preparaty z rozgniecionych brodawek korzeniowych; zastosuj barwienie proste pozytywne oraz barwienie Grama.

8. Zważ i porównanie biomasy roślin inokulowanych mikroorganizmami i roślin kontrolnych.

Strona 3 z 3

---