8. HYBRYDOCYTOCHEMIA (HYBRYDYZACJA IN SITU)
Jednym z najbardziej swoistych wiązań, występujących pomiędzy makrocząsteczkami żywego organizmu jest wzajemne wiązanie komplementarnych łańcuchów kwasów nukleinowych, oparte na wybiórczym tworzeniu par przez zasady purynowe i pirymidynowe: cytozynę i guaninę oraz adeninę i tyminę (a w RNA uracyl). Swoistość ta leży u podstwy funkcjonowania całego aparatu genetycznego. Do pojedynczych łańcuchów nukleotydowych rozspiralizowanego DNA lub RNA w komórce mogą się przyłączać fragmenty łańcuchów kwasów nukleinowych pochodzące z innych źródeł (np. będące wynikiem preparatyki biochemicznej lub sztucznej syntezy) pod warunkiem, że ich sekwencja nukleotydów będzie komplementarna ("dopasowana"), a zatem doprowadzi do powiązania ze sobą odpowiednich par zasad i odtworzenia struktury dwułańcuchowej. Proces ten nosi nazwę hybrydyzacji; może on zachodzić pomiędzy wszystkimi rodzajami kwasów nukleinowych (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA). W technikach mikroskopowych hybrydyzacja została wykorzystana do precyzyjnej lokalizacji określonych sekwencji nukleotydów w obrębie komórek (in situ, czyli w miejscu ich naturalnego występowania). Całą procedurę określa się mianem hybrydocytochemii lub hybrydyzacji in situ (ISH - ang. in situ hybridization).
Sekwencje nukleotydów będące przedmiotem badań wykrywa się za pomocą specjalnie przygotowanych odcinków DNA lub RNA, w których układ nukleotydów jest komplementarny w stosunku do badanej sekwencji. Taki fragment DNA lub RNA, noszący nazwę sondy, jest dodatkowo znakowany, aby miejsce jego związania można było dostrzec pod mikroskopem (ryc. 8.1).
Hybrydyzacja in situ umożliwia:
• lokalizację konkretnych genów lub ich fragmentów w obrębie poszczególnych chromosomów (tworzenie map genowych, diagnostyka chorób dziedzicznych, wykrywanie genów związanych z nowotworami),
• wykrywanie obcego materiału genetycznego w komórce (np. przy zakażeniach wirusowych),
• ocenę ekspresji określonych genów w komórkach, poprzez wykrywanie w nich mRNA o odpowiedniej sekwencji nukleotydów.
8.1. Wytwarzanie i rodzaje sond
Niezbędnym warunkiem do wytworzenia swoistej sondy, jest uprzednie wyizolowanie na drodze biochemicznej odcinka DNA lub RNA, który sonda ma identyfikować. Odcinek ten jest wzorcem, na którym powstaje komplementarna sonda. Izolacja odcinka wzorcowego oraz wytworzenie sondy wymaga zastosowania zaawansowanych technik genetyki molekularnej, z użyciem enzymów rozcinających i powielających kwasy nukleinowe (endonukleaz i polimeraz), a także aparatu genetycznego bakteriofagów i bakterii. Z tego względu niezbędna jest współpraca ze specjalistycznym laboratorium stosującym te techniki. Z drugiej strony, coraz więcej sond dostępnych jest w komercyjnej ofercie firm produkujących odczynniki do badań molekularnych i mikroskopowych.
Aktualnie stosuje się cztery podstawowe rodzaje sond:
• dwuniciowe (dwułańcuchowe) sondy DNA,
• jednoniciowe sondy DNA,
• jednoniciowe sondy oligonukleotydowe, o długości 25-50 nukleotydów, wytworzone na drodze syntezy chemicznej,
• jednoniciowe sondy RNA.
Każdy z powyższych rodzajów sond ma swoje zalety i wady, które należy brać pod uwagę przy wyborze typu sondy do badań. Sondy dwuniciowe są łatwiejsze do uzyskania, ale w trakcie hybrydyzacji oba łańcuchy mogą ponownie łączyć się ze sobą, zamiast z wykrywanym odcinkiem kwasu nukleinowego, co obniża ich czułość. Sondy o znacznej długości charakteryzują się wyższą swoistością, ale trudniej penetrują do wnętrza komórki niż sondy oligonukleotydowe. Optymalna długość sondy wynosi 100-250 nukleotydów. Sondy RNA mają wysoką swoistość, ale mogą być unieczynniane przez rybonukleazy, powszechnie występujące w materiale biologicznym.
8.2. Znakowanie sond
Znakowanie sondy jest niezbędne do jej uwidocznienia w obrazie mikroskopowym. Stosowane są:
• znaczniki radioaktywne: w procesie tworzenia sondy, do jej łańcucha wbudowywane są nukleotydy zawierające izotopy promieniotwórcze: 3H, 32P, lub 35S;
• biotyna, która jest przyłączana do nukleotydów wchodzących w skład sondy;
• znaczniki antygenowe: są to grupy chemiczne, które po przyłączeniu do nukleotydów tworzą (same lub wraz z nimi) determinanty antygenowe, pobudzające układ immunologiczny do tworzenia przeciw nim swoistych przeciwciał. Do najczęściej stosowanych znaczników antygenowych należą: digoksygenina (związek sterydowy pochodzenia roślinnego), acetyloaminofluoren (AAF), oraz zmodyfikowane chemicznie nukleotydy: bromodezoksyurydyna i nukleotydy sulfonowane, a także przyłączane do nukleotydów enzymy: peroksydaza i fosfataza zasadowa.
8.3. Przygotowanie materiału do hybrydyzacji in situ
8.3.1. Utrwalanie
Utrwalanie musi gwarantować nie tylko wierne zachowanie struktury, ale przede wszystkim pozostawienie w materiale niezmienionych kwasów nukleinowych. Utrwalacze aldehydowe bardzo dobrze spełniają te warunki, ale wytworzone przez nie w tkance wiązania krzyżowe znacznie utrudniają penetrację sond, co stwarza konieczność dodatkowej permeabilizacji tkanki przed hybrydyzacją (p. dalej). Utrwalacze precypitujące (alkohole, aceton) ułatwiają wprawdzie penetrację sond, lecz mogą spowodować utratę z tkanki nawet do 75% kwasów nukleinowych, zwłaszcza RNA. W praktyce najchętniej stosuje się 4% paraformaldehyd przez 30-60 min.
8.3.2. Zatapianie
Hybrydyzację można przeprowadzać na skrawkach parafinowych, z żywic akrylowych, a także na skrawkach mrożeniowych. W tym ostatnim przypadku przy zamrażaniu materiału zalecana jest krioprotekcja przez przepojenie go 15% sacharozą. Z uwagi na wysoką temperaturę i dość agresywne chemicznie odczynniki towarzyszące hybrydyzacji in situ, warto naklejać skrawki na szkiełka pokryte poli-L-lizyną, która przeciwdziała ich odklejaniu się podczas dalszych etapów procedury. Skrawki przechowuje się w temp. -70°C, aby uniknąć nawet nieznacznych uszkodzeń kwasów nukleinowych przez przetrwałe w śladowych ilościach nukleazy, które mogą zaburzać sekwencje nukleotydów będące przedmiotem badań.
W przypadku skrawków parafinowych, przed hybrydyzacją należy usunąć środowisko zatapiające (p. rozdz. 3.10.1).
8.3.3. Permeabilizacja
Sondy są dużymi cząsteczkami, a zatem trudno przenikają do wnętrza materiału biologicznego (skrawka, ew. całych komórek w rozmazie). Penetrację sond może dodatkowo utrudniać sieć wiązań krzyżowych wytworzonych w materiale podczas utrwalania. Z tego powodu stosuje się procedury noszące nazwę permeabilizacji, zwiększające "porowatość" materiału i ułatwiające wnikanie cząsteczek sondy. Najczęściej używa się do tego celu:
• enzymów proteolitycznych (pepsyna, trypsyna, pronaza), które rozcinają wiązania krzyżowe, a także trawią białka związane z kwasami nukleinowymi i utrudniające dostęp sond,
• detergentów (Triton X-100), znacznie zwiększających przepuszczalność błon biologicznych.
8.3.4. Zapobieganie reakcjom nieswoistym
Wstępne przygotowanie materiału do hybrydyzacji obejmuje również postępowanie mające na celu zapobieganie nieswoistym reakcjom, które w ostatecznym efekcie mogłyby dawać fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne wyniki.
• sondy mogą ulegać nieswoistemu wiązaniu przez struktury tkankowe posiadające znaczną ilość ładunków dodatnich. Zapobiega temu inkubacja materiału w 0,1 M trójetanoloaminie, do której dodaje się 0,25% bezwodnika kwasu octowego;
• niespecyficzne przyleganie sond do białek zasadowych eliminuje denaturacja białek w 0.2 M HCl, przeprowadzana równolegle z proteolizą;
• sondy DNA mające wykrywać sekwencje DNA mogą wiązać się również z łańcuchami RNA. Aby tego uniknąć, należy zastosować wstępne trawienie materiału RNAzą;
• odmienne niebezpieczeństwo istnieje, jeżeli celem hybrydyzacji jest lokalizacja określonych sekwencji RNA: RNAzy, enzymy rozkładające RNA są obecne powszechnie w tkankach, a ich śladowe ilości mogą się znaleźć również w odczynnikach stosowanych w całej procedurze, a nawet na skórze eksperymentatora. RNAzy tkankowe unieczynnia możliwie najszybsze utrwalenie materiału (najwyżej 30 min od jego pobrania), natomiast zewnątrzpochodnych zanieczyszczeń RNAzą unikamy stosując przy pracy roztwory robocze przygotowane ze sterylnej, podwójnie destylowanej wody, szkło laboratoryjne poddawane temperaturze 250°C przez co najmmniej 4 godz. oraz sterylne gumowe rękawiczki;
• jeżeli końcowym elementem systemu znakującego sondę jest enzym, należy przeprowadzić wstępnie inaktywację tego enzymu w tkance (p. rozdz. 7.5), gdyż analizując wynik hybrydyzacji nie moglibyśmy odróżnić enzymu endogennego (tkankowego) od enzymu związanego z sondą.
Jak widać z powyższego zestawienia, wybór procedur wstępnych przeprowadzanych przed hybrydyzacją jest dość skomplikowany i zależy od wielu czynników.
8.4. Hybrydyzacja
8.4.1. Denaturacja kwasów nukleinowych
Jeżeli wykrywamy sekwencje w DNA, lub używamy dwuniciowych sond DNA, to w normalnych warunkach hybrydyzacja nie jest możliwa, bowiem układy dwuniciowe są stabilne dzięki łączącym je wiązaniom wodorowym. Hybrydyzacja DNA z komplementarną sondą nastąpi dopiero wówczas, gdy zarówno DNA jak i sonda uzyskają formę jednoniciową (ryc. 8.1). Proces rozplatania dwuniciowych cząsteczek kwasów nukleinowych następuje pod wpływem podwyższonej temperatury i określamy go mianem denaturacji. Denaturacja kwasów nukleinowych jest zatem niezbędnym etapem wstępnym w większości procedur hybrydyzacyjnych. Polega ona na podgrzaniu preparatu inkubowanego w roztworze zawierającym sondę do ok. 90°C i utrzymywaniu tej temperatury przez ok. 10 min. Powoduje to rozłączenie się łańcuchów dwuniciowych kwasów nukleinowych i umożliwia następowe wiązanie się sondy z wykrywanymi odcinkami tych kwasów. Przy oziębianiu środowiska reakcji część kwasów nukleinowych odtwarza co prawda swą pierwotną, dwuniciową strukturę, jednak proces ten nie jest kompletny i przynajmniej część wykrywanych sekwencji pozostaje "odsłonięta" i może połączyć się z sondą.
8.4.2. Hybrydyzacja i wpływające na nią czynniki
Właściwa hybrydyzacja zachodzi podczas inkubacji w tzw. roztworze hybrydyzacyjnym, w którym oprócz sondy znajduje się szereg substancji ułatwiających lub przyspieszających hybrydyzację.
Najczęściej stosuje się:
• dodatek NaCl (stężenie końcowe 1,2-3,0 M) - który nadaje roztworowi optymalną dla hybrydyzacji siłę jonową,
• 50% formamid, utrzymujący kwasy nukleinowe w stanie zdenaturowanym,
• polimery anionowe (dekstran), zapobiegające niespecyficznemu wiązaniu sondy z grupami w tkance posiadającym ładunki dodatnie.
Optymalna temperatura hybrydyzacji wynosi ok. 40-50°C.
Po zakończonym procesie hybrydyzacji należy dokładnie wypłukać preparat, aby usunąć z niego nie związane cząsteczki sondy. Niekiedy (przy wykrywaniu RNA) stosuje się dodatkowe trawienie RNAzą A, która rozkłada RNA jednoniciowy, a nie działa na dwuniciowy - zachowuje zatem odcinki RNA związane z sondą, eliminując pozostałe, które mogłyby dawać nieswoiste reakcje.
8.5. Wykrywanie sond związanych z tkanką
Metoda ostatecznego uwidocznienia lokalizacji sondy związanej in situ ze swoistą sekwencją kwasu nukleinowego zależy przede wszystkim od sposobu znakowania sondy.
• w przypadku sond znakowanych izotopami promieniotwórczymi, ich lokalizację wykrywa się na drodze autoradiografii (p. rozdz. 9),
• w przypadku sond znakowanych biotyną stosuje się reakcję awidyna-biotyna (p. rozdz. 7.6.5),
• jeżeli znacznik sondy ma charakter antygenowy, wykonuje się reakcję immunohistochemiczną, przy czym mamy tu do wyboru pełny zakres metod immunohistochemicznych: immunofluorescencję (ta najpowszechniejsza obecnie odmiana procedury określana jest skrótem FISH - ang. fluorescence in situ hybridization), techniki immunoenzymatyczne, oraz immunocytochemię na poziomie mikroskopu elektronowego (p. rozdz 7.3). Antygenowe znakowanie sond stwarza również możliwość jednoczesnego wykrywania w tym samym preparacie kilku różnych sekwencji kwasów nukleinowych, poprzez wykorzystanie sond znakowanych odmiennymi antygenami i wykrywanych różnymi reakcjami barwnymi lub fluorescencyjnymi. Wyniki badań porównawczych wskazują, iż FISH ma 20-krotnie wyższą czułość niż hybrydocytochemia przy użyciu sond znakowanych izotopami.
8.6. Reakcje kontrolne
Reakcje kontrolne mają sprawdzać z jednej strony, czy uzyskany wynik hybrydyzacji nie jest fałszywie dodatni, co może wynikać z niespecyficznego wiązania uczestniczących w całym procesie składników (sondy, przeciwciał), z drugiej zaś czy nie jest fałszywie ujemny, np. z powodu błędów metodycznych.
Do najczęściej stosowanych reakcji kontrolnych należą (w nawiasach podano prawidłowy wynik reakcji):
• użycie niehomologicznej sondy zamiast sondy swoistej (-),
• trawienie badanej tkanki DNAzą lub RNAzą przed hybrydyzacją (-),
• przeprowadzenie hybrydyzacji na materiale nie zawierającym wykrywanych sekwencji (-),
• przeprowadzenie hybrydyzacji na materiale, w którym uprzednio wykazano obecność wykrywanych sekwencji (+),
• wykonanie hybrydyzacji z użyciem innej, sprawdzonej sondy, na materiale zawierającym wiążące ją sekwencje (+),
• ponadto, przy wykrywaniu autoradiograficznym lub immunocytochemicznym znakowanych sond można stosować reakcje kontrolne zalecane dla tych technik (p. rozdz. 7.7, 8.11).
8.7. Łańcuchowa reakcja polimerazy in situ (PCR in situ)
Istotnym rozszerzeniem możliwości hybrydocytochemii stało się w ostatnich latach przystosowanie łańcuchowej reakcji polimerazy do badań mikroskopowych.
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR - ang. polymerase chain reaction) to technika służąca do wielokrotnego powielania odcinków DNA, wykorzystująca enzym replikujący DNA, polimerazę. Polega na przeprowadzeniu wielu następujących po sobie cykli syntezy DNA identycznego z powielanym odcinkiem. Pojedynczy cykl składa się z trzech etapów: (1) denaturacji powielanego DNA, (2) przyłączenia do DNA tzw. starterów (ang. primer), czyli krótkich, jednoniciowych odcinków DNA stanowiących "miejsce startowe" dla polimerazy i (3) replikacja DNA przy udziale polimerazy. W wersji biochemicznej, wszystkie cykle reakcji wykonuje się w jednej probówce, w której liczba syntetyzowanych fragmentów DNA narasta wykładniczo (każdy cykl podwaja liczbę powielonych fragmentów DNA). Pozwala to na uzyskanie ze śladowo małych ilości DNA w pierwotnej próbce znacznych ilości DNA o takiej samej sekwencji nukleotydów.
Modyfikacją reakcji PCR służącą do wykrywania RNA jest reakcja RT-PCR. W pierwszym etapie stosuje się tu enzym syntetyzujący DNA na matrycy RNA: odwrotną transkryptazę (ang. reverse transcriptase, RT). Uzyskany w wyniku jej działania DNA zostaje następnie powielony przy pomocy reakcji PCR - ma on komplementarną w stosunku do wykrywanego RNA sekwencję zasad. Niezbędnym warunkiem gwarantującym swoistość tej reakcji jest wstępne usunięcie DNA z badanego materiału poprzez jego wytrawienie DNAzą. Tylko wówczas reakcja PCR powieli wyłącznie DNA powstały na matrycy wykrywanego RNA, co pozwoli na jego uwidocznienie i lokalizację.
Szczególną metodą, łączącą w sobie hybrydocytochemię i elementy reakcji PCR jest metoda PRINS (ang. primed in situ synthesis, synteza in situ przy udziale startera). Normalna reakcja PCR powiela jednocześnie różne odcinki DNA, dlatego odcinek wykrywany należy później wyodrębnić przy użyciu hybrydocytochemii. W metodzie PRINS ta kolejność jest odwrócona: najpierw doprowadza się do hybrydyzacji nie znakowanej sondy z wykrywanym odcinkiem kwasu nukleinowego, a następnie wprowadza do środowiska reakcji polimerazę DNA i znakowane nukleotydy. Sonda pełni rolę startera, inicjując powielanie wykrywanego fragmentu kwasu nukleinowego, a nowo powstałe cząsteczki kwasu są zbudowane ze znakowanych nukleotydów, mogą zatem być uwidocznione w obrazie mikroskopowym.
Wykonanie reakcji PCR, RT-PCR lub PRINS na preparacie mikroskopowym powoduje znaczne zwiększenie ilości wykrywanego kwasu nukleinowego, który w dwóch pierwszych technikach uwidacznia się przy pomocy metod hybrydocytochemicznych. Daje to w praktyce istotną (10-30-krotną) poprawę czułości metody: wzmocnienie sygnału (fluorescencji lub zabarwienia) w przypadkach, w których sama reakcja hybrydocytochemiczna była śladowa, a - co ważniejsze - pojawienie się sygnału w materiale, w którym metodami klasycznej hybrydocytochemii wykrywanych odcinków DNA lub RNA w ogóle nie można było uwidocznić.
Podpisy pod ilustracje:
Ryc. 8.1. Schemat hybrydyzacji in situ. A: sonda DNA ze znacznikiem (z) nie może się związać z dwuniciowym DNA w jądrze komórki. B: po denaturacji DNA przechodzi w formę jednoniciową. C: znakowana sonda wiąże się z odcinkiem DNA posiadającym komplementarną sekwencję nukleotydów
142