Bakteriofag lambda
Pochodne faga lambda są zdecydowanie najczęściej stosowanymi wektorami fagowymi. W porównaniu z wektorami plazmidowymi pozwalają one na znacząco prostsze klonowanie większych fragmentów DNA, co więcej wydajność infekcji komórek bakteryjnych fagiem jest wyższa niż wydajność transformacji. Genom bakteriofaga lambda to dwuniciowa cząsteczka DNA (dsDNA) od długości 48502 bp, niosąca około 40 genów. Ważny z punktu widzenia inżynierii genetycznej jest fakt, że dojrzałe cząstki fagowe zawierają liniową cząsteczkę DNA, która jest zakończona tzw. odcinkami cos (cohesive ends)'Cos są ponadto niezbędne podczas umieszczania wirusowego genomu w białkowym kapsydzie. Ciekawy i nie mniej istotny w praktyce jest sposób namnażania wirusowego DNA w bakterii. Z wykorzystaniem enzymów gospodarza powstaje długa cząsteczka liniowego DNA nazywana konkaktomerem, składa się ona ze zwielokrotnionych genomów faga oddzielonych sekwencjami cos, właśnie w miejscu tych elementów, tuż przed "zapakowaniem" genomu do otoczki, białka NU1 i A przecinają konkaktomer, "pakowaniu" ulegają więc już tylko pojedyncze kopie genomów. Warto w tym miejscu zaznaczyć, że obcy DNA wklonowany do genomu faga jest powielany i pakowany (pod warunkiem, że całkowita długość DNA nie przekroczy 50 kb) w identyczny sposób.
Po infekcji komórki bakteryjnej fagiem lambda mogą zachodzić dwa modele wydarzeń. Cykl lityczny, prowadzący do lizy bakterii i uwolnienia namnożonych cząstek wirusowych, bądź cykl lizogenny, podczas którego materiał genetyczny faga wbudowuje się do genomu gospodarza, zakażenie wirusem przebiega więc niejako poprzez fazę utajenia. Przełączenie cyklu lizogennego w lityczny może nastąpić w każdym momencie pod wpływem różnych czynników, jak choćby zmiana temperatury czy składu pożywki w warunkach in vivo.
Jako wektor stosowany jest zmodyfikowany fag lambda, w którym do minimum ograniczono liczbę miejsc trawienia enzymami restrykcyjnymi. Wektory fagowe również zawierają polilinkery, geny markerowe, a niekiedy specyficzne silne promotory, ich pojemność wynosi ok. 20 kb.
Plazmidy
Plazmidy - dwuniciowe, koliste, pozachromosomowe cząsteczki DNA. Termin plazmid wprowadził Joshua Lederberg w roku 1952. Obecnie dla określenia plazmidu używa się także pojęcia „episom”, który oznacza ruchome elementy genetyczne, zdolne do integracji z gnomem gospodarza.
Plazmidy są pozachromosomowymi cząsteczkami DNA występującymi w komórkach wielu gatunków bakterii. Plazmidy występują w formie superhelikalnej a ich rozmiary mieszczą się w zakresie do 200 tys. par zasad. Dziedziczenie plazmidów następuje niezależnie od genomu bakteryjnego. Ich replikacja i transkrypcja w pewnym stopniu są zależne od aparatu białkowego gospodarza.
Plazmidy posiadają różnorodne mechanizmy pozwalające między innymi na utrzymanie stałej liczby kopii w komórce gospodarza oraz mechanizmy pozwalające na równomierne rozdzielenie cząsteczek do komórek potomnych.
Plazmidy i determinacja cech fenotypowych
Na plazmidach znajdują się geny odpowiedzialne za bardzo wiele cech bakterii.
Plazmidy są to dodatkowe elementy genetyczne, niezależne od "chromosomu bakteryjnego" - mogą się niezależnie replikować. Najczęściej są koliste, występują w różnej ilości kopiach - w zależności do szczepu bakterii, nie są one konieczne do życia, ale mogą na nich być zawarte geny warunkujące ważne cechy - np. oporności na antybiotyki, które w drodze koniugacji mogą być przekazywane pomiędzy bakteriami.
W biotechnologii używane są jako wektory do transformacji komórek oraz do klonowania DNA.
Cechy przenoszone przez plazmidy:
- oporność na antybiotyki (penicylinę, streptomycynę, tetracyklinę)
- oporność na jony metali ciężkich (rtęć, kadm, cynk, kobalt, arsen)
- produkcje antybiotyków i bakteriocyn (kolicyna, megacyna, kloacyna)
- katabolizm toksycznych związków (toluen)
- chorobotwórczość bakterii (produkcja hemolizyn, czynniki wirulencji)
- interakcje z roślinami (wiązanie azotu, kędzierzawość korzeni, tworzenie brodawek korzeniowych)
- zdolność do koniugacji
- fermentacje laktozy,
- wykorzystywanie sacharozy.
Polimerazy DNA bakteryjne
Enzym monomeryczny (zbudowany z pojedynczego łańcucha polipeptydowego), masa ok. 109 kDa, odkryty przez Artura Kornberga, czasami więc nazywany enzymem Kornberga. Posiada trzy aktywności enzymatyczne, co jest nietypowe dla monomeru:
polimerazowa
Jednorazowo polimeraza DNA I sytetyzuje do 20 wiązań fosfodiestrowych. Syntezuje ok. 10 wiązań na sekundę tj. ok 100 razy wolniej od polimerazy DNA III. Występuje w liczbie ok. 400 cząsteczek na jedną komórkę.
Aktywność egzonukleazy 5'->3' daje się stosunkowo łatwo oddzielić od pozostałych funkcji enzymu (każdą z nich katalizuje inny odcinek polipeptydowego łańcucha). Białko pozbawione aktywności 5'->3' egzonukleazy nazywamy fragmentem Klenowa.
Enzym monomeryczny, masa ok. 90 kDa, posiadający dwie aktywności:
polimerazowa
egzonukleazowa 3'—>5'
Polimeraza ta nie uczestniczy w procesie replikacji DNA, jej funkcja polega na naprawianiu uszkodzeń DNA.
Enzym heteromultimeryczny (złożony z kilku niejednakowych łańcuchów polipeptydowych), masa ok. 900 kDa, będący głównym inicjatorem replikacji DNA. Syntetyzuje z prędkością ok. 1000 wiązań na sekundę główną masę nowopowstałej, komplementarnej do matrycowej nici DNA.
W odróżnieniu od polimerazy DNA I działa w sposób ciągły, to znaczy oddysocjowuje od matrycy dopiero po zakończeniu replikacji. Łączy się tylko z jednoniciowym DNA, do którego przyłączony jest starter, wytwarzany przez enzym prymazę, wchodzący w skład prymosomu. Przyłączając się do prymosomu polimeraza III przekształca go w replisom. Aktywności enzymatyczne:
polimerazowa
egonukleazowa 3'->5'
Występuje w liczbie 10-20 cząsteczek na jedną komórkę.
Polimerazy DNA eukariota
Polimerazy DNA zależne od DNA
Polimerazy obecne w jądrze komórki
Polimeraza DNA α
Enzym zwany inaczej wysokocząsteczkową polimerazą jest najważniejszą polimerazą eukariotyczną. Wchodzi w skład kompleksu enzymatycznego wraz z polimerazami: δ i ε. Z polimerazą δ odpowiada za syntezę głównej masy DNA. Syntetyzuje nić opóźnioną i jest przyrównywana do bakteryjnej polimerazy DNA III. Jest główną z polimeraz aktywnych w trakcie fazy S cyklu komórkowego.
Polimeraza DNA β
Enzym zajmujący się (wraz z polimerazą ε) naprawą uszkodzeń DNA. W związku z tym jej aktywność przejawia się, jeśli wystąpi konieczność naprawy uszkodzeń tj. głównie poza fazą S cyklu komórkowego kiedy to jest najaktywniejszą z polimeraz. Bywa przyrównywana per analogiam do bakteryjnej polimerazy DNA II.
Patologia - uwarunkowana genetycznie obniżona aktywność tego enzymu występuje w przypadku skóry pergaminowej. U osób dotkniętych schorzeniem dimery tymidynowe powstające w skórze pod wpływem promieniowania UV nie są usuwane. W efekcie dochodzi do wieloogniskowych nowotworów skóry w miejscach, które sa narażone na działanie słońca. Osoby te umierają stosunkowo młodo.
Polimeraza DNA δ
Trimer antygenu jądrowego proliferującej komórki (ang. Proliferating Cell Nuclear Antigen - PCNA) jest ślzgającym się zaciskiem DNA i jako białko pomocnicze polimerazy δ zwiększaja jej wydajność ok. 1 000 razy zapobiegając oddzieleniu polimerazy od DNA.
Polimeraza DNA ε
Enzym działający wraz z polimerazami DNA: α i δ, zajmujący się podobnie jak polimeraza DNA δ syntezą nici wiodącej. Razem z polimerazą DNA δ ma aktywność egzonukleazową, dzięki której może naprawiać błędy powstałe w trakcie replikacji.
Polimeraza DNA γ Enzym zajmujący się syntezą mitochondrialnego, pozajądrowego materiału genetycznego. Jego działanie, jak i replikacja DNA mitochondrialnego jest odmienny od działania pozostałych polimeraz DNA. Jest aktywna cały czas, ponieważ synteza mitochondrialnego DNA zachodzi stale.
Polimerazy DNA zależne od RNA
Odwrotna transkryptaza jest wytwarzana co prawda tylko przez RNA-wirusy, ale aktywność przejawia tylko w organizmie gospodarza.
Polimerazy DNA niezależne od matrycy
Terminalna deoksyrybonukleotydylotransferazax (TDT-aza) produkowana jest przez limfoblasty objęte nowotworem szczególnie w ostrej białaczce limfoblastycznej. Wbudowuje nukleotydy do nowo tworzonej nici DNA na chybił trafił. Jej aktywność pozwala monitorować białaczkę: w prawidłowych komórkach nie występuje.
