1. SKRÓTY-omówienie:

TLC - cienkowarstwowa chromatografia cieczowa (Thin Layer Chromatography)

Jest to technika analityczna służąca do identyfikacji oraz oczyszczania mieszanin związków chemicznych. Umożliwia także badanie zanieczyszczeń występujących w próbce oraz oznaczeń ilościowych substancji (można zastosować TLC do wyodrębniania pojedynczego składnika mieszaniny i uzyskania go w ilości pozwalającej na wykonanie badań analitycznych).

Podstawy TLC:

W chromatografii cienkowarstwowej mieszanina substancji jest rozdzielana na poszczególne składniki ze względu na różnice w szybkości ich przemieszczania się na podłożu wykonanym z aktywnego adsorbenta stanowiącego fazę nieruchomą.

Rozdzielenie przeprowadza się zwykle na szklanej płytce przykrytej cienką, przylegającą warstwą rozdrobnionych cząstek - jest to faza stacjonarna (najczęściej silikażel, tlenek glinu, także celuloza). Fazę ruchomą stanowią zazwyczaj rozpuszczalniki organiczne. Substancje rozdzielane nanosi się punktowo na dolną krawędź płytki, suszy się ją a następnie umieszcza się płytkę w komorze chromatograficznej zanurzonej w eluencie (rozpuszczalniku) na kilka milimetrów (bez zanurzania naniesionych substancji). Eluent przemieszcza się w górę płytki, co powoduje również przemieszczanie się rozdzielanych substancji ku górze. Prędkość ruchu poszczególnych składników jest zależna od oddziaływań międzycząsteczkowych między fazą stacjonarną i eluentem oraz związkami zawartymi w próbce (składniki o większym powinowactwie do fazy stacjonarnej poruszają się wolniej a składniki o większym powinowactwie do fazy ruchomej - szybciej). Proces jest zakończony, gdy czoło eluenta dotrze do górnej krawędzi płytki.

HPLC - wysokosprawna chromatografia cieczowa (High Performance Liquid Chromatography).

Podstawy HPLC:

to metoda analityczna a także preparatywna, służąca do oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych. Jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Oznacza to, że analizowana próbka, jest rozpuszczana w rozpuszczalniku transportującym (tzw. eluencie) i w tej formie jest kierowana na kolumny, które wypełnione są specjalnym złożem porowatym lub żelowym. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi tworzącymi analizowaną próbkę a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. Te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe powinowactwo do złoża) przepływają wolniej przez kolumnę, zaś związki chemiczne, które oddziałują słabiej przepływają szybciej. HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atm. W HPLC duże znaczenie dla rozdziału ma polarność faz.

2. Limit detekcji i liniowości w analizie chromatograficznej

Limit detekcji: najmniejsza mierzalna wartość, na podstawie której możliwe jest wnioskowanie o obecności analitu z rozsądną pewnością statystyczną. Limit detekcji powinien być podany w części dotyczącej zawartości, to jest wyrażony jako μg/kg lub mg/kg (analit/próbka), razem z wielkością próbki (wyrażoną w gramach) na ogół używaną w analizach. Limit detekcji jest liczbowo równy trzykrotnej wartości odchylenia standardowego średniej dla wyznaczonej dla ślepej próby (n <20). Ślepa próba jest definiowana jako pomiar prowadzony całkowicie zgodnie z procedurą analityczną, z pominięciem obecności próbki lub zastąpieniem jej równoważną ilością destylowanej wody.

Liniowość: zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego wprost proporcjonalnych do stężenia (zawartości) substancji oznaczanej w próbce, w określonym zakresie - zgodnie z wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax+b Zależność między obu zmiennymi charakteryzuje współczynnik korelacji r. liniowość wykazuje się przez analizę próbek o stężeniach analitu, obejmujących deklarowany zakres stężeń metody.

4. omów rozdział chromatograficzny w normalnym i odwróconym układzie faz:

- w normalnym - stosuje się wypełnienia z polarnymi grupami co oznacza, że faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma. Np. układ: żel krzemionkowy - heksan. Najmniej polarny składnik jest wymywany jako pierwszy. Grupy: -NO₂, -N, -NH₂, -CH(OH)CH₂(OH).

- w odwróconym - wypełnienie z niepolarnymi grupami - faza stacjonarna jest mniej polarnaniż faza ruchoma. Np. układ: żel krzemionkowy z modyfikowaną powierzchnią - mieszanina metanolu i wody. Takie układy mają bardziej trwałe wypełnienia. Najbardziej polarny składnik jest wymywany jako pierwszy. Grupy: -CH₃, -C₈H₁₇, -C₈H₃₇, benzen

(ja też nie wiem o co chodzi z tymi grupami)

5. Elucja izokratyczna i gradientowa:

Izokratyczna: skład fazy ruchomej jest stały - stosuje się do rozdzielania substancji o podobnej polarności

Gradientowa: stosowana gdy występuje ogólny problem elucji: przy silnie zróżnicowanych wartościach k dla różnych składników próbki, współczynniki retencji nie osiągają wartości optymalnych dla wszystkich rozdzielanych związków. Czyli składniki próbki różnią się właściwościami sorpcyjnymi a tym samym różnią się retencją. Wtedy faza ruchoma odpowiednia do rozdzielania składników o słabej retencji nie eluuje z kolumny składników o silnej retencji. Silny eluent rozdziela substancje silnie polarne a niepolarne pozostają nierozdzielne w pobliżu linii mety.

Technika elucji gradientowej polega na zastosowaniu dwóch rozpuszczalników: najpierw rozpuszczalnik 1 - słabo polarny, aby rozdzielić składniki słabo polarne. Dodanie rozpuszczalnika 2, polarnego, powoduje zmianę mocy elucyjnej fazy ruchomej, przy końcu analizy stężenie rozpuszczalnika 2 osiąga 100%. Musi on być na tyle silny aby rozdzielić substancje polarne.

6. Zjawiska zachodzące podczas rozdziału chromatograficznego:

• Zjawisko podziału: substancja, która znajdzie się w układzie dwóch nie mieszających się ze sobą rozpuszczalników, ulega podziałowi między te rozpuszczalniki. Po osiągnięciu stanu równowagi stosunek stężeń substancji w obu fazach będzie stały w określonej temperaturze

• Adsorpcja: Jeżeli roztwór lub gaz zawierają pewną substancję i graniczą z rozwiniętą powierzchnią ciała stałego, na granicy faz można stwierdzić podwyższone stężenie tej substancji w porównaniu z jej stężeniem w punktach oddalonych od granic faz. Wyróżniamy:

- adsorpcję fizyczną - spowodowana siłami przyciągania międzycząsteczkowego na granicy faz

- chemisorpcję - uzależnioną od sił natury chemicznej (wiązania chemiczne między substancją a powierzchnią ciała stałego)

• Desorpcja - zjawisko odwrotne do absorpcji występujące w przypadku zmiany warunków (temperatura, ciśnienie) albo zakłócenia równowagi przez zmianę stężenia w pobliżu granicy faz

• Dyfuzja - wzajemne przenikanie się substancji związane z ruchem cząsteczek lub jonów z większego stężenia do mniejszego. (prawo Ficka - szybkość przechodzenia substancji przez jednostkę powierzchni w jednostce czasu w określonym kierunku jest proporcjonalna do gradientu stężeniowego w tym kierunku)

8. Analiza ilościowa w TLC:

Do oznaczenia zawartości substancji, po rozdzieleniu na cienkiej warstwie należy zeskrobać z chromatografu tę część fazy nieruchomej, na której zlokalizowano substancję, wyeluować ją odpowiednim rozpuszczalnikiem i wykonać pomiary, np. spektrofotometrycznie, bezpośrednio po wykonaniu reakcji chemicznej.

Analizę można też przeprowadzać na płytce poprzez wizualne porównanie wielkości i intensywności plamki substancji analizowanej z wielkością i intensywnością plamek wzorcowych. (są to plamki tej samej substancji naniesionej na tę samą płytkę w znanych, ściśle odmierzonych, różnych ilościach). Znalezienie wśród plamek wzorcowych plamki o podobnej wielkości i intensywności zabarwienia, jak plamka subst. Badanej oznacza, że jej ilość w próbce jest zbliżona do ilości w plamce wzorcowej.

Densytometria - mierzenie intensywności zabarwienia i wielkości plamek za pomocą układu optyczno-elektronicznego otrzymując wykres w postaci sensytogramu.

12. Parametry kolumny w HPLC:

- wymiary

-średnica wypełnienia kolumny

-liniowa i objętościowa prędkość przepływu fazy ruchomej przez kolumnę

-średnia wielkość ziaren wypełnienia

-objętość martwa kolumny - zależy od wymiarów kolumny oraz od rodzaju i stopnia upakowania wypełnienia. Jest to suma objętości cieczy „uwięzionej” w porach i cieczy znajdującej się między ziarnami wypełnienia.

-czas martwy kolumny - czas od momentu wprowadzenia do kolumny substancji nie ulegającej sorpcji, jednak wnikającej do wszystkich porów wewnątrz ziaren wypełnienia, do chwili pojawienia się maksimum piku tej substancji na wylocie z kolumny. Czas martwy kolumny zależy od objętości martwej i od objętościowej prędkości przepływu fazy ruchomej.

---