Ćwiczenia laboratoryjne z biochemii

Reakcje cukrów

Cel ćwiczenia:

Zapoznanie z budową i właściwościami sacharydów.

Sacharydy są podstawową i bardzo zróżnicowaną grupą związków naturalnych występujących we wszystkich organizmach żywych. Szczególnie zróżnicowane są pod względem budowy i funkcji u roślin.

Dzielimy je na:

Monosacharydy. Składają się z pojedynczej jednostki polihydroksy-aldehydowej lub -ketonowej (np. glukoza, fruktoza).

Oligosacharydy. Zawierają od 2 do 10 jednostek monosacharydowych połączonych wiązaniem glikozydowym (np. sacharoza, laktoza).

Polisacharydy. Zawierają bardzo długie łańcuchy zbudowane z jednostek monosacharydowych, które mogą być nierozgałęzione (np. celuloza) lub rozgałęzione (np. składnik skrobi - amylopektyna glikogen).

Właściwością sacharydów często wykorzystywaną w oznaczeniach jest ich zdolność do redukowania innych związków. Właściwość ta jest związana z występowaniem cząsteczki sacharydów w formie łańcuchowej zawierającej reaktywną grupę aldehydową lub ketonową. Wszystkie monosacharydy mają więc właściwości redukujące. Właściwości redukujących nie mają disacharydy, których wiązanie glikozydowe utworzone jest z udziałem obydwu węgli acetalowych, ponieważ w takiej cząsteczce nie może nastąpić w roztworze otwarcie pierścienia piranozowego lub furanozowego z odtworzeniem grup: aldehydowej bądź ketonowej.

W reakcji Benedicta w środowisku zasadowym następuje utlenienie sacharydów redukujących do odpowiednich hydroksykwasów, a obecne w odczynniku Benedicta jony Cu²⁺ redukują się do jonów Cu⁺ wypadających z roztworu w postaci nierozpuszczalnego tlenku Cu₂O.

W reakcji Barfoeda redukcja jonów miedziowych prowadzona jest w środowisku słabo kwaśnym, co obniża reaktywność sacharydów. W wykonywanym doświadczeniu tylko w roztworze monosacharydu pojawi się czerwony osad Cu₂O.

Pod wpływem wyższych stężeń jonów wodorowych i wyższej temp. disacharydy łatwo ulegają hydrolizie. Oznaczane właściwości redukcyjne roztworu po hydrolizie wynikają zatem z obecności produktów hydrolizy - monosacharydów.

Kwasy mineralne w wyższych stężeniach powodują również odwodnienie cząsteczek sacharydów z utworzeniem odpowiednich furfurali (aldehydowych pochodnych furanu). Produkty odwodnienia kondensując z fenolami dają połączenia o różnych zabarwieniach. Właściwości te wykorzystano w reakcjach Molischa, Biala i Seliwanowa.

W reakcji Biala tylko pentozy przekształcają się w furfural kondensujący z orcynolem, w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej. Odczynnik Seliwanowa zawiera natomiast rezorcynol, który z produktem odwodnienia ketoz - hydroksymetylofurfuralem daje barwę łososiową.

Stosowane sacharydy: Monosacharydy: glukoza, fruktoza, galaktoza, arabinoza (pentoza); Disacharydy: maltoza, laktoza, sacharoza; Polisacharydy: skrobia, celuloza (skrawki bibuły).

Szkło i sprzęt:

20 probówek, statyw do probówek, uchwyt do probówek, zlewka (400-600 ml), pipety (1 ml, 5 ml).

Wykonanie

Reakcje ogólne cukrów:

1. Reakcja Molischa.

Odmierzyć do dwóch probówek po 1 ml dowolnych roztworów sacharydów. Do obydwu probówek dodać po 2-3 krople α-naftolu, wymieszać i następnie po ściance pochylonej probówki wprowadzić powoli 3 ml stężonego kwasu siarkowego, aby spłynął na dno probówki. Nie mieszać. Wszystkie sacharydy po odwodnieniu kwasem siarkowym dają z α-naftolem fioletowo zabarwiony produkt kondensacji.

2. Reakcja z tymolem.

Odmierzyć do dwóch probówek po 1 ml dowolnych roztworów cukrów, dodać kilka kropli r-ru tymolu, zamieszać. Następnie po ściance pochylonej probówki wprowadzić powoli pipetą 2 ml stężonego kwasu siarkowego, aby spłynął na dno probówki. W miejscu zetknięcia obu płynów powstaje różowy pierścień.

3. Reakcja z płynem Lugola. Wykrywanie polisacharydów (np. skrobi).

Odmierzyć 1 ml kleilu skrobiowego i dodać 1-2 krople płynu Lugola. Roztwór przyjmuje ciemnoniebieskie zabarwienie, które zanika po ogrzaniu w płomieniu palnika i powraca po oziębieniu.

Właściwości redukujące sacharydów:

4. Reakcja Benedicta.

Odmierzyć do trzech probówek po 1 ml glukozy, maltozy i sacharozy. Do każdej dodać 2,5 ml odczynnika Benedicta i ogrzewać przez kilka minut na łaźni wodnej. W środowisku zasadowym następuje utlenienie sacharydów redukujących do odpowiednich hydroksykwasów, a obecne w odczynniku Benedicta jony Cu²⁺ redukują się do jonów Cu⁺ wypadających z roztworu w postaci nierozpuszczalnego tlenku Cu₂O.

5. Próba Fhelinga.

Zmieszać w dwóch probówkach po 2 ml odczynnika Fehlinga I i II, następnie do każdej dodać wybranych roztworów cukrów, zamieszać i ogrzać we wrzącej łaźni wodnej. Z roztworów wypada nierozpuszczalny tlenek Cu₂O.

6. Próba Tollensa (lustro srebrne).

Do 2,5 ml roztworu azotanu srebra dodać NH₄OH, aż rozpuści się powstający osad AgOH. Do roztworu wprowadzić 1 ml cukru i ogrzewać na łaźni wodnej do wydzielenia się na ściankach probówki srebra w postaci „lustra”. Tworzący się w czasie reakcji nierozpuszczalny w wodzie AgOH przeprowadza się przy użyciu amoniaku w rozpuszczalny wodorotlenek diamoniakalno-srebrowy, który w podwyższonej temperaturze, w obecności cukru, redukuje się do metalicznego srebra powodując utlenienie cukru do odpowiedniego kwasu.

7. Próba Mohra

Do dwóch probówek dodać 1 ml 10% roztworu glukozy i sacharozy oraz 2 ml 30% NaOH. Ogrzewać co jakiś czas wstrząsając probówkę. Pierwotnie bezbarwny płyn przyjmie zabarwienie żółte, potem brunatne, przy czym wydziela się zapach przypalonego cukru (karmelu). Na działanie mocnych zasad są wrażliwe monosacharydy, które podczas ogrzewania z alkaliami rozkładają się na triozy itetrozy i inne produkty ich polimeryzacji. Dwucukry i polisacharydy nie zmieniają się w tych warunkach.

8. Reakcja Barfoeda.

Charakterystyczna dla monosacharydów redukujących. Odmierzyć do dwóch probówek po 1 ml glukozy i maltozy. Dodać po 2,5 ml odczynnika Barfoeda. Wymieszać i ogrzewać ok. 3 min. na wrzącej łaźni wodnej. Redukcja jonów miedziowych prowadzona jest w środowisku słabo kwaśnym, co obniża reaktywność sacharydów. W wykonywanym doświadczeniu tylko w roztworze monosacharydu pojawi się czerwony osad Cu₂O.

Reakcje pentoz:

9. Próba Biala.

Odmierzyć do dwóch probówek po 5 ml odczynnika Biala. Wymieszać i ogrzewać ok. 5 min. we wrzącej łaźni wodnej. Do jednej dodać 1 ml arabinozy, do drugiej glukozy i ogrzewać kolejne 5 min. W reakcji Biala tylko pentozy przekształcają się w furfural kondensujący z orcynolem, w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej.

Reakcje ketoz:

10. Próba Seliwanowa.

Odmierzyć do dwóch probówek po 1 ml fruktozy i glukozy. Dodać po 3 ml odczynnika Seliwanowa i ogrzewać przez 1 min. we wrzącej łaźni wodnej. Odczynnik Seliwanowa zawiera rezorcynol, który z produktem odwodnienia ketoz - hydroksymetylofurfuralem daje barwę łososiową.

---