Aleksander, L. Sieroń
Rekombinacja
Rekombinacja oznacza wymianę odcinków nici kwasu nukleinowego między dwiema jego cząsteczkami. Wymiana polega na rozerwaniu ciągłości cząsteczki DNA w dwóch miejscach i zamianie lub wstawieniu odcinka DNA o innej kolejności zasad. Rekombinacja DNA może być homologiczna lub niehomologiczna.
Rekombinacja homologiczna zwana również uprawnioną zachodzi między dwiema cząsteczkami DNA w miejscu ich całkowitej lub częściowej komplementarności. W warunkach naturalnych u organizmów diploidalnych zachodzi ona podczas crossing-over i przy naprawie odcinków DNA uszkodzonego przez czynniki zarówno fizyczne jak i chemiczne lub biologiczne. Podobna wymiana ma miejsce również w organizmach prokariotycznych. U bakterii rekombinacja homologiczna zachodzi między DNA genoforu i plazmidu, jeżeli w obu występują odpowiednio długie komplementarne odcinki DNA. Rekombinacja homologiczna nie jest zjawiskiem spontanicznym. Wymaga ona udziału licznych enzymów zdolnych do hydrolizy, które współdziałają w formie kompleksu. Najlepiej poznano jego działanie u bakterii Escherichia coli (E. coli), w którym dochodzi do rozcięcia pary homologicznych nici przez odpowiednią nukleazę, związaną z kompleksem białkowym RecBCD przy sekwencji GCTGGTGG występującej, co około 4 kpz. Jednoniciowy DNA (ssDNA) z wolnym końcem 5' opłaszcza białko RecA tworząc połączenie RecA-ssDNA. Dwuniciowe cząsteczki DNA wymieniają się miejscami (crossing-over) jeśli mają odcinki komplementarne w sąsiadującym dwuniciowym DNA.
Możliwa jest również rekombinacja niehomologicznych cząsteczek DNA, jeżeli zawierają one charakterystyczne sekwencje rozpoznawane przez czynniki kompleksu rekombinacyjnego. Taką rekombinację nazywamy zlokalizowaną. Na przykład w genoforze E. coli znajdują się krótkie 15 nukleotydowe odcinki do których komplementarne są odpowiednie odcinki w DNA faga . Syntetyzowana w bakterii na matrycy genu fagowego integraza rozcina te sekwencje tworząc 7 nukleotydowe wolne końce, które pozostają niesparowane i umożliwiają przyłączenie wolnych końców DNA fagowego, przy wykorzystaniu bakteryjnego czynnika integrującego IHF. Wbudowany do genomu bakterii DNA fagowy powiela się wraz z materiałem genetycznym gospodarza i jest przekazywany do komórek potomnych.
W organizmach eukariotycznych rekombinacja zlokalizowana umożliwia między innymi powstawanie kombinacji sekwencji kodujących obszar zmienny przeciwciał odpowiedzialny za ich swoistość wobec antygenów.
Kolejnym typem rekombinacji jest rekombinacja nieuprawniona, zwana inaczej transpozycją. Jest to rekombinacja dwuniciowych odcinków DNA między sekwencjami, w których nie ma żadnej homologii, a w których nie występują sekwencje specyficzne. Transpozycja zachodzi przy udziale tak zwanych transpozonów, takich jak na przykład element IS, a także w sekwencjach insercyjnych E. coli, które mają długość od 1 do 2 kpz. Składają się one z genu transpozazy, ograniczonego krótkimi, odwróconymi powtórzeniami końcowymi (sekwencje o przeciwnej orientacji). Transpozaza rozcina „na ukos” genoforowy DNA i wtedy kopia sekwencji insercyjnej wbudowuje się w to miejsce. Luki w sekwencji są uzupełniane przez polimerazę DNA, a ligaza DNA łączy nici, co kończy się duplikacją miejsca docelowego i utworzeniem nowej sekwencji, powtórzonej tandemowo. Gen, w którym doszło do insercji transpozonu zwykle ulega inaktywacji, a geny zawarte między dwoma kopiami transpozonu mogą ulec delecji na drodze rekombinacji z otaczającymi je transpozonami.
Rekombinowany DNA
Mechanizmy omówionych dotychczas typów rekombinacji są wykorzystywane w inżynierii genetycznej zajmującej się wprowadzaniem celowych zmian do sekwencji DNA, czyli mutagenezą. Najpowszechniej stosowaną rekombinacją w mutagenezie jest rekombinacja nieuprawniona. Wiele eukariotycznych transpozonów ma budowę podobną do genów retrowirusowych. Na przykład drożdżowy element Ty (6 kpz) kodujący białka podobne do retrowirusowych odwrotnych transkryptaz i integraz, otoczony jest długimi powtorzeniami końcowymi. Genetyczne elementy tego rodzaju zwane są retrotranspozonami i replikują się poprzez pośredniczący RNA. Klonowane geny można z łatwością mutować in vitro i badać efekt zmutowanego genu poddając go ekspresji in vitro/in vivo. Wprowadzając delecję w cDNA od końców rejonu kodującego koniec aminowy (N-) lub koniec karboksylowy (C-) można otrzymać krótsze białko, co ma zastosowanie w oznaczaniu właściwości części (domen) białka odpowiedzialnych za określone jego funkcje.
W klonach genomowego DNA badane są inne sekwencje, na przykład leżące przed miejscem startu transkrypcji, poprzez sukcesywne usuwanie nukleotydów celem wykrycia minimalnej długości sekwencji zawierającej promotor lub inne sekwencje regulatorowe. Ogólną metodą mutagenezy jest stosowanie jednokierunkowych delecji z udziałem egzonukleazy III, która usuwa kolejne nukleotydy w kierunku 3' --> 5' z nici, w której koniec 3' w 2-niciowym DNA jest cofnięty w stosunku do końca 5'. Sukcesywnie usuwana jest tylko dolna nić insertu, za pomocą nukleazy z fasoli złocistej lub nukleazy S1, które usuwają pojedyncze nukleotydy wystającej w nici z obu końców (powstają tak zwane tępe końce).
Mutageneza ukierunkowana polega na zmianie jednego lub kilku nukleotydów w określonym miejscu sekwencji. W tym celu używana jest matryca jednoniciowa i starter z odpowiednią mutacją. Starter hybrydyzuje z matrycą i jest początkiem wydłużania komplementarnej nici DNA przy pomocy polimerazy DNA. Otrzymany produkt jest wbudowywany do wektora dwuniciowego „niedopasowanego” DNA, a następnie transformowany do bakterii. Obecnie mutagenezę ukierunkowaną przeprowadza się często metodą PCR. W tym celu projektowane są pary starterów o sekwencji innej niż matryca poddawana mutacji, ale posiadające sekwencję komplementarną do matrycy na odcinku około 20 nukleotydów. Jeśli DNA, który poddany będzie mutacji zawarty jest w standardowym wektorze ze standardowymi miejscami dla starterów, to mogą być one wykorzystywane w kombinacji z mutagennymi starterami. Przeprowadza się wtedy 2 reakcje PCR z udziałem mutagennych starterów typu „wprost” i „odwrotnie”, z których każdy działa w parze z innym starterem i łączy się ze znaną sekwencją wektora. Produkty drugiej reakcji PCR miesza się i używa do następnych reakcji PCR z udziałem już tylko skrajnych starterów. Część powstałego produktu poddaje się subklonowaniu w celu zastąpienia w nim rejonu, który w wyjściowej cząsteczce powinien ulec mutacji.
Przy pomocy omówionych metod otrzymuje się rekombinowany DNA o licznych zastosowaniach, od badań właściwości kodowanych białek lub RNA, poprzez produkcję rekombinowanych leków o charakterze białkowym, do blokowania genów w zwierzętach transgenicznych i próby naprawy zmutowanych genów. Rekombinowany DNA w plazmidach i innych wektorach jest również wykorzystywany jako lek w niektórych schorzeniach o podłożu genetycznym. Szerzej o zastosowaniach rekombinowanych DNA będzie mowa na następnych zajęciach.