Aminokwasy i białka. Białka są zbud z 20 aminokwasów. Najprostszy glicyna nie zawiera asymetrycznego atomu węgla, jest więc związkiem achiralnym. Poszczególne aminokwasy różnią się od siebie grupą R i na podstawie jej właściwości można je podzielić na aminokw z gr:
-niepolarną: alanina, walina, fenyloalanina, pralina
-polarną: seryna, cysterna, tyrozyna
-o ład ujemnym: kw asparaginowy, kw glutaminowy
-o ład dodatnim: lizyna, arginina, histydyna.
Odróżnienie aminokw od innych związków organ. Obecność w roztworze wolnych aminokwasów można wykryć za pomocą reakcji ninhydrynowej. W reakcji tej biorą udział grupy: 2-karboksylowa i 2-aminowa. W obecności wolnego aminokwasu i ninhydryny po podgrzaniu powstaje niebiesko-fioletowy produkt kondensacji (niektóre aminokwasy dają produkt o zabarwieniu żółtym).
Obecność wiązania peptydowego w białku można wykryć za pomoca reakcji biuretowej Piotrowskiego, która polega na zdolności tworzenia przez jony miedziowe w środowisku zasadowym fioletowego kompleksu a tym wiązaniem.
Obecność aminokwasów zawierających grupę aromatyczną wykrywa się za pomocą reakcji ksantoproteinowej, która polega na powstawaniu pod wpływem kwasu azotowego nitrowych pochodnych pierścieni aromatycznych, mających w środowisku zasadowym zabarwienie pomarańczowe.
Aminokwasy zawierające w swym składzie grupy hydrosulfidowe można wykryć traktując ich roztwory wodorotlenkiem sodowym, co w podwyższonych temperaturach powoduje wydzielanie się gazowego siarkowodoru. Z solami ołowiawymi wytwarzają one czarny nierozpuszczalny siarczek ołowiawy.
Denaturacja to nieodwracalne zmiany w strukturze białek i utrata właściw biologicznych
Denaturacja białka powstała pod wpływem kwasu, a więc pod wpływem zmiany stężenia jonów wodorowych
Wysalanie. Brak osadu w roztworze świadczy o usunięciu białek. Wysalanie ma charakter odwracalny i wiąże się ze zmniejszeniem stopnia uwodnienia zdysocjowanych grup aminokwasowych R występujących na powierzchni cząsteczki białka.
Metody oznaczania zaw białka oparte są na cechach jego budowy: obecność azotu w składzie pierwiastkowym, obecność reszt aminokwasów aromatycznych, występ wiązań peptydowych, występ wolnych grup aminowych.
Fotometryczne oznacz zaw białka. W metodach fotometrycznych wykorzystuje się zjawisko pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego.
Do oznaczania wykorzystuje się widmo określonych związków lub barwnych produktów powstałych w wyniku reakcji chemicznych, które można mierzyć metodami spektrofotometrycznymi i kolrymetrycznymi. Do pomiarów fotometrycznych służą fotometry lub spektrofotometry wyposażone w tzw. fotoogniwa lub fotokomórki, które służą do pomiarów natężenia światła przechodzącego przez roztwór pochłaniający (badany) oraz przez próbę odniesienia (najczęściej czysty rozpuszczalnik). Pomiar próby odniesienia służy zwykle do wyzerowania przyrządu, gdyż nastawia się go według tej próby na 100% transmisji lub 0 w wypadku pomiaru absorbancji.
Na ćwiczeniach była wykorzystana metoda Lowry'ego i współpracowników. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz dwóch aminokwasów aromatycznych- tyrozyny i tryptofanu oraz jednego siarkowego- cysteiny. Reakcja biuretowa jest wzmacniana w tej metodzie inną reakcją z odczynnikiem Folina i Ciocalteu, w której kwas fosforomolibdenowy i fosforowolframowy ulega redukcji do błękitu fosforomolibdenowego z udziałem tyrozyny, tryptofanu i cysteiny. Podobnie jak w innych metodach kolorometrycznych stężenie białka odczytuje się z krzywej wzorcowej.
Zaletą tej metody jest znaczna jej czułość, można bowiem oznaczyć ilość białka już od 1 μg w próbie.
Wadą metody jest błąd oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w stosunku do białka oznaczanego. Inną wadą jest zawyżanie wyników oznaczenia w wyciągach nie dializowanych z powodu redukcji odczynnika Folina przez wolne aminokwasy i niewielkie peptydy.
Badanie i oznaczanie aktywn enzymów amylolitycznych. α-amylaza i β-amylaza należą do klasy hydrolaz. rozkładają one skrobię, glikogen oraz pokrewne oligo i polisacharydy. Amylazy są typowymi enzymami trawiennymi. W procesie kiełkowania α-amylaza jest syntetyzowana de novo, natomiast β-amylaza z formy nieaktywnej pod wpływem enzymów proteolitycznych przechodzi w formę aktywną.
α-amylaza katalizuje rozrywanie wyłącznie wiązań α-1,4-glikozydowych wewnątrz cząstki substratu, a produktami jej działania są początkowo dekstryny wysokocząsteczkowe, przechodzące w dekstryny o coraz krótszym łańcuchu. Produktami długotrwałej hydrolizy polisacharydów są głównie maltotrioza, izomaltoza, maltoza i glukoza. Uwalniane reszty glukozydowe mają konfigurację α stąd nazwa enzymu.
β-amylaza działa na substrat od strony nieredukującego końca łańcucha i nazwany jest dlat egzoamylazą. Hydrolizuje co drugie wiązanie α-1,4-glikozydowe, odrywając jednostki β-maltozy. Podczas hydrolizy występuje przegrupowanie Waldena i dlatego uwalniana maltoza jest w formie β. β-amylaza nie działa na wiązania α-1,6-glikozydowe. Produktami działania są: β-maltoza i wysokocząsteczkowa dekstryna graniczna.W mieszaninie reakcyjnej β-amylazy ze skorobią obserwuje się szybki przyrost dedukcyjności, natomiast nie występuje spadek lepkości i zmiany zabarwienia z jodem.
Glukoamylaza katalizuje hydrolizę wiązań α-1,4/1,6-glikozydowych, odrywając kolejno jednostki glukozy od nieredukującego końca cząsteczek wielocukru. Występuje też przegrupowanie Waldena. W początkowej fazie działania glukoamyl na skrobię obserwuje się szybki przyrost dedukcyjności oraz powolną zmianę barwy z jodem, a także powolny spadek lepkości. Końcowym produktem działania jest glukoza.
W budowie centrum aktywnego amylaz wyróżnia się region katalityczny i wiążący. Pierwszy bierze udział w rozrywaniu wiązania glikozydowego a drugi musi połączyć się z określoną liczbą reszt glukozy w łańcuchu substratu, aby centrum katalityczne mogło spełnić swą funkcję.
Badanie właściwości enzymów amylolitycznych:
-reakcja z jodem: cząsteczki skrobi zależnie od ilości zawartej w nich amylazy i amylopektyny dają z jodem zabarwienie niebieskie lub fioletowe. Natomiast produkty częściowej degradacji skrobi dają barwę fioletową (dekstryny wysokocząsteczkowe), czerwone (dekstryny o średni masie cząsteczkowej) lub nie dają zabarwienia (Dekstryny niskocząsteczkowe).
-reakcja z odczynnikiem Benedicta: sacharydy w środow zasadowym redukują jony miedziowe do jonów miedziawych. Efektem jest ceglastoczerwony osad tlenku miedziawego.
-reakcja z odczynnikiem Barfoeda: odróżnia monosacharydy od disacharydów redukujących. W określonym czasie tylko monosacharydy dają reakcję z odczynn Barfoeda (redukcja jonów miedziowych). Tam gdzie glukoza pojawi się ceglastoczerwony osad.
Oznaczanie aktywności β-amylazy metodą Bernfelda. W metodzie Bernfelda wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku zasadowym redukują grupy nitrowe kwasu 3,5- dinitrosalicylowego do grup aminowych. Powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, której intensywność zależy od ilości w próbie cukrów redukujących uwalnianych podczas działania enzymu, dlatego reakcja ta może stanowić podstawę do ich oznaczania fotometrycznego.
Peptydazy (klasa hydroliz) zwierząt ze względu na lokalizację dzielimy na: pozakomórkowe i wewnątrzkomórkowe. Pozakomórkowe to enzymy trawienne tj: pepsyna, podpuszczka, trypsyna, chymotrypsyna, aminopeptydazy, karboksypeptydazy i elastaza. Wewnątrzkomórkowe to katepsyny, a ich rola polega na utrzymywaniu równowagi między poziomem białek i produktów ich hydrolizy wewnątrz komórki. Peptydazy dzielimy na: mendo i egzopeptydazy.
Trypsyna należy do endopeptydaz. Jest wydzielana przez trzustkę w formie nieaktywnego zymogenu- trypsynogenu. Proenzym w jelicie cienkim przekształcony jest w formę aktywną. Trypsynogen składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego zawierającego 249 reszt aminokwasowych. Aktywacja trypsynogenu polega na rozerwaniu wiązania peptydowego i odłączeniu niewielkiego peptydu, który blokuje centrum aktywne enzymu. Trypsyna stanowi pojedynczy łańcuch polipeptydowy. W centrum aktywnym występują 2 reszty seryny i histydyna jako aminokwasy kontaktowe. Katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, peptydowych, których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizany. Efektem działania trypsyny na białko są peptydy o różnej długości łańcucha.
Metoda Ansona polega na pomiarze ilości tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w trakcie hydrolizy, które nie wytrącają się 3-proc kwasem trichlorooctowym. Oznaczenie zawartości tyrozyny wykonuje się w fotometrze przy użyciu odczynnika Folina. Końcowa barwa, której natężenia jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny w próbie, jest wynikiem redukcji odczynnika fosforomolibdenofosforowolframowego w środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego.
Kwasy nukleinowe to DNA i RNA. Są produktami kondensacji nukleotydów. W DNA i RNA najczęściej występującymi zasadami są: pochodne purynowe- adenina i guanina, oraz pochodna pirymidowa- cytozyna.
Nukleotydy są to estry fosforowe nukleozydów. W kw nukleinowych połączone są ze sobą wiązaniami diestrowymi między pozycjami 3 i 5 pentozowych.
Cząsteczka DNA zbudowana jest z 2 łańcuchów polinukleotydowych wijących się śrubowo i splecionych wzajemnie. Ponieważ oba łańcuchy ułożone są prawoskrętnie, sekwencje atomów i grup układają się w kierunku przeciwnym.
Rozróżniamy: mRNA (matrycowe), tRNA (transportowe) i rRNA (rybosomowe). Biorą one udział w translacji.
Denaturacja DNA. Cząsteczka DNA poddana działaniu podwyższonej temperatury ulega rozpadowi na 2 pojedyncze nici, następuje wówczas rozerwanie wiązań wodorowych. Zjawisku towarzyszy spadek lepkości roztworu. Denaturowanej cząsteczce DNA można przywrócić z powrotem aktywność biologiczną przez powolne obniżanie temperatury (denaturacja).
Reakcja na obecność fosforanów jest wspólna dla DNA i RNA. Polega na łączeniu się molibdenu amonowego z jonem fosforanowym, tworzy się wówczas kompleks soli amonowej heteropolikwasu tetratrimolibdenianofosforowego o barwie żółtej.
Reakcja na obecność tyminy, odróżnia oba typy kwasów, polega na wytworzeniu przez zasadę (skł DNA) z diazową pochodną kwasu sulfanilowego kompleksu o barwie czerwonobrunatnej.
Reakcja Biala- na wykrywanie pentoz.
Reakcja Dischego odróżniająca DNA od RNA na obecność-D-2-Deoksyrybozy.
Właściwości redukujące sacharydów. Właściwość ta jest związana z występowaniem cząsteczki sacharydów sacharydów formie łańcuchowej zawierającej reaktywną grupę aldehydową lub ketonową. Należą więc tu wszystkie monosacharydy. Nie należą do sach redukujących te disacharydy, których wiązanie glukozydowe utworzone jest z udziałem obydwu węgli acetalowych.
W reakcji Benedicta środowisku zasadowym następuje utlenianie sacharydów redukujących do odpowiednich hydroksykwasów, a obecne w odczynniku Benedicta jony Cu2+ redukują się do jonów Cu+ wypadających z roztworu w postaci nierozpuszczonego tlenku miedziowego.
W reakcji Barfoeda redukcja jonów miedziowych przeprowadzana jest w środowisku słabo kwaśnym, co powoduje znaczne obniżenie reaktywności sacharydów. W doświadczeniu tylko w roztworze monosacharydy pojawi się czerwony osad tlenku miedziawego.
Pod wpływem wyższych stężeń jonów wodorowych oraz wysokiej temperatury disacharydy ulegają łatwo hydrolizie. Oznaczone właściwości redukcyjne roztworu po hydrolizie wynikają z obecności w nim produktów hydrolizy- monosacharydów.
Kwasy mineralne w wyższych stężeniach powodują również odwodnienie cząsteczek sacharydów sacharydów utworzeniem odpowiednich stosunku do ich budowy furfurali( pochodne furanu). Produkty odwodnienia kondensując z fenolami dają połączenia o różnych zabarwieniach. Właściwości te wykorzystano w reakcjach Molischa, Biala i Seliwanowa.
W reakcji Molischa wszystkie sacharydy po odwodnieniu kwasem siarkowym dają z α-naftolem fioletowo zabarwiony produkt kondensacji.
W reakcji Biala tylko pentozy przekształcają się w furfural kondensujący z orcynolem, w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej.
Odczynnik Seliwanowa zawiera rezorcynol, który z produktem odwodnienia ketoz- hydroksymetylofurfuralem daje barwę łososiową.