Mikrobiologia przemysłowa 18.03.2010
wykład 4

Źródła zakażen w przemyśle

- Zakażenia pierwotne - spoza zakładu przemysłowego

1. surowe

2. woda

3. powietrze

-zakażenia wtórne - wewnątrzzakładowe:

1. sprzęt technologiczny, aparatura, materiały filtracyjne, węże, formy itp.

2. powietrze w pomieszczeniach produkcyjnych

3.odzieź i obuwie pracowników

4. Brudne ręce pracowników

5. Brak masek ochronnych i czepków

6. Nosicielstwo chorób itp

Analiza ilościowa mikroorganizmów

1. metody bezpośrednie - mikroskopowe

2. metody pośrednie - hodowlane, wagowe, optyczne

I. metody bezpośrednie - mikroskopowe

Opierają się na bezpośrednim liczeniu mikroorganizmów w preparacie mikroskopowym

Różnice pomiędzy metodami wynikają z różnic w przygotowaniu prób i metod przeliczania na jednostkę objętości materiału

1. liczenie przy użyciu komór - komory Thoma, Burkera, Howarda pozwalają na obserwacje tylko dużych komórek, takich jak drożdże, zarodniki grzybów i strzępki grzybki

1. hemocytometry czyli komory Thoma

rys 1

liczba drobnoustrojów 1 ml to:

L=4*10⁶*n*a

Gdzie n - rozcieńczenie zawiesiny drobnoustrojów

a - średnia zawartość komórek w polu

2. komory Burkera

liczba drobnoustrojów 1 ml to:

L=2,5*10⁵*n*a

Gdzie n - rozcieńczenie zawiesiny drobnoustrojów

a - średnia zawartość komórek w polu

2. liczenie drobnoustrojów w preparacie przyżyciowym (bezpośrednim)

L=(1000/πr²*h)*n*a

Gdzie

n - rozcieńczenie zawiesiny drobnoustrojów

a - średnia zawartość komórek w polu widzenia

r- promień pola widzenia [mm]

h - grubość warstwy cieczy miedzy szkiełkami [0,01mm]

liczenie przeprowadzić w 3 preparatach zliczając w każdym po 20 pól

3. liczenie metodą Breeda w preparacie barwionym - zasada tej metody polega na wykonaniu równomiernego rozmazu określonej objętości hodowli, pobranej kalibrowaną pipetą Breeda (0,01ml) na znanej powierzchni odtłuszczonego szkiełka podstawowego, wysuszeniu, utrwaleniu i wybarwieniu preparatu.

Liczba drobnoustrojów:

L=(A/πr²)*a*x

Gdzie A- pole rozmazu (100mm²)

a - średnia zawartość komórek w polu widzenia

x- 100. przelicznik dla pipety Breeda

r- promień pola widzenia wyznaczony mikrometrem obiektywowym

liczenie przeprowadzić w 3 preparatach zliczając w każdym po 20 pól

4. Metoda DEFT ( Direct Epifluorescent Filter Technique)

Metoda oparta o mikroskopie fluorescencyją. Pod mikroskopem liczone SA drobnoustroje osadzone na filtrze membranowym, o porach 0,45μm, po uprzednim ich wybarwieniu fluorochromami (np. oranż akrydyny). Metoda umożliwia odróżnienie komórek żywych od martwych: żywe fluoryzują na żółto lub pomarańczowo, martwe na zielono. Metoda stosowana do określania liczebności mikroorganizmów np. w produktach spożywczych, świeżych jak i przetworzonych w tym w mrożonkach

Zalety: szybko, dokładnie, tanio. Najlepsze wyniki uzyskuje się w zakresie 120⁴ do 10⁷ komórek drobnoustrojów w 1 ml.

II. Metody hodowlane

oparta na zdolności drobnoustrojów do wzrostu i rozmnażania, dzięki czemu oznacza się tylko żywe komórki zdolne do wzrostu na pożywkach płynnych (metoda rozcieńczeń) lub pożywkach stałych (metoda płytkowa i jej modyfikacje)

Posiew - podstawowa metoda diagnostyki mikrobiologicznej polegająca na przeniesieniu pobranego materiału biologicznego (ze środowiska, z hodowli, od pacjenta itd.) na odpowiednie podłoże mikrobiologiczne, umożliwiające wzrost drobnoustrojów w taki sposób, żeby ostatecznie uzyskać pojedyncze, odizolowane kolonie bakterii, czy grzybów.

Posiew jest podstawą do identyfikacji drobnoustrojów, określenia (wykorzystując niektóre metody) ilości mikroorganizmów w wyjściowej zawiesinie, przechowywania szczepów oraz określenia ich oporności na czynniki środowiskowe, w tym lekooporności

Metod i sposobów posiewu jest wiele - lecz jedynie kilka jest powszechnie używanych

Do posiewów, aby uzyskać wiarygodne wyniki, używamy:

-jałowych podłoży hodowlanych (płynnych lub stałych)

-sterylnego sprzętu

a. ezy - posiew na skosy agarowe, podłoża płynne, izolacja czystych kultur

b. drucika - hodowle kłute na podłożach stałych

c. głaszczki - posiew na podłoża stałe

d. pipety - posiew na podłoża stałe i płynne

e. welwet w metodzie replik (podłoża stałe).

1. Metoda rozcieńczeń Listera RYSUNEK

Metoda rozcieńczeń stosowana jest głównie do:

- izolowania czystych kultur ze środowiska płynnego

-określania miana mikroorganizmów w danym środowisku

- określenia NPL (najbardziej prawdopodobnej liczby mikroorganizmów w 100 ml materiału wyjściowego) w oparciu o statystyczne opracowanie zawarte w tablicach McCrady`ego

2. metoda płytkowa (m. Roberta Kocha 1881)

-określenie liczby drobnoustrojów

-izolowanie czystych kultur

-obserwacje morfologiczne

- określenie właściwości biochemicznych drobnoustrojów

Wada metody - wyniki zawsze zaniżone w stosunku do rzeczywistości, co wynika z :

-braku uniwersalnego podłoża hodowlanego i warunków inkubacji,

-występowania niektórych bakterii w skupiskach i łańcuszkach (kolonie tych bakterii rozwijają się często nawet z kilkudziesięciu komórek )

W związku w powyższym liczebność bakterii w metodzie płytkowej podaje się jako JTK (jednostka tworzenia kolonii z ang- CFU - colony forming units)

1. rozcieńczenie materiału

2. posiewy na płytki Pietriego metoda wgłębna i powierzchniowa

3. inkubacja - czas i temperatura inkubacji jest determinowana rodzajem wysianych mikroorganizmów. Płytki agarowe inkubuje się zawsze odwrócone dnem do góry (aby zapobiec rozpraszaniu i rozmywaniu rosnących kolonii bakterii poprzez wodę kondensacyjną), płytki żelatynowe w pozycji normalnej

4. liczenie - po okresie inkubacji liczymy wyrośnięte kolonie, odrzucając płytki z liczbą kolonii powyżej 300, liczba poniżej 30 również jest wątpliwa, gdyż przypadkowe zakażenie może wpłynąć istotnie na wynik końcowy. Jeżeli na płytkach z powtórzeń różnica nie jest większa niż 10%, to wyniki ze wszystkich płytek uśredniamy. Wyniki skrajne odbiegające należy odrzucić

Wynik (L) podaje się w JTK w 1 ml lub gramie badanego materiału, korzystając ze wzoru:

L=a*b*c

Gdzie:

1. średnia liczba wyrosłych na płytkach kolonii

2. odwrotność rozcieńczenia z którego wykonano posiew

3. współczynnik, dla metody powierzchniowej, przyjmuje on wartość 10 co odpowiada 0,1 ml posiewanego materiału dla metody wgłębnej jest to analogicznie 1.

3. modyfikacje metody płytkowej Kocha

A. metoda filtrów membranowych - stosowana do określania ilości drobnoustrojów w środowiskach wodnych, w których ich ilość jest niewielka, poniżej 20-30 komórek w 1 ml, co wiąże się z koniecznością ich zagęszczenia w jednostce objętości, poprzez sączenie określonych objętości badanych płynów.

B. metoda posiewów spiralnych (ang. Spiral plate metod)

C. metoda kropelkowa

metoda całkowicie zautomatyzowana poprzez zastosowanie aparatu typu „Droplett” składającego się z mikropipety i licznika kolonii bakterii

D. metoda mikrohodoli Frosta- „wykorzystuje się mikrohodowle, na szkiełku zaznacza się określoną powierzchnie w której umieszcza się materiał badany i dociska szkiełkiem”

E. Metoda posiewu ezami „plate loop- „stosowana w przemyśle mleczarskim, bierze się pobiera oczko spreparowanej ezy, która jest połączona ze strzykawka i nakłada się na płytke petriego”

F. Metoda „roll tube-„ robi to aparat, aparat….

---