12.05.2008r.

Mechanizm działania enzymów (przykłady)

Hydrolazy glikozydowe

α - amylaza: należy do podklasy 2 klasy hydrolaz (Hydrolazy glikozydowe) EC 3.2.1.1.,
4 - glukanohydrolaza - α - 1,4 - glukanu, tnie nie wszystkie wiązania wewnętrzne α - 1,4 - glikozydowe w amylozie i amylopektynie, amyloza (liniowy komponent skrobi) wykazuje strukturę 2 - go rzędową helikalną

wiele α - amylaz tnie wiązania co 6 jednostek

końcowe produkty degradacji amylazy i amylopektyny zależą od pochodzenia enzymu,
od jego specyficzności: mieszanina maltooligosacharydów (maltorioza, maltoza i inne), zdarza się że są pewne ilości glukozy (jeżeli enzym działa wystarczająco długo na substrat), w przypadku działania na amylopektynę powstaje izomaltoza

α - amylazy najbardziej rozpowszechnione w przyrodzie: bakterie, grzyby strzępkowe, drożdże amylolityczne, rośliny, zwierzęta

skrobia jeden z najłatwiej przyswajalnych węglowodanów i dla większości organizmów stanowi dobrze przyswajalne źródło węgla

znana jest struktura molekularna licznych α - amylaz

domena β - α - 8 - beczułki (2 warstwy)

zewnętrzna: 8 odcinków helikalnych,

wewnętrzna: 8 odcinków o strukturze β - fałdowej

α - amylaza należy do enzymów o strukturze α/ β (przemieszane są te odcinki)

rozciągnięta struktura β - α - 8 - beczułki (poddomena D)

w obszarze wiążącym substrat w α - amylazach występują liczne podmiejsca wiążące są dopasowane do glukozy, szczególnie ważne podmiejsca 6,7 - są tam zlokalizowane aminokwasy katalityczne

obecność podmiejscy wiążących: wiążą takie same reszty glukopiranozy stanowiące część łańcucha skrobi

do proteinaz: określając specyficzność substratową, reszty nie są jednakowe, podmiejsca wiążące określają nie tylko przy jakim aminokwasie następuje cięcie wiązania peptydowego ale również określa się rodzaje preferowanych reszt aminokwasów zarówno w stronę C - końca jak i N - końca

(odpowiednie podmiejsca wiążące)

↓ - wiązanie peptydowe jest rozkładane

okazuje się, że te aminokwasy poprzedzające reszty aminokwasów aromatycznych jak i następujące po tych aminokwasach po rozkładanym wiązaniu peptydowych też są rozpoznawane przez enzym i określając specyficzność substratową korzystamy z odpowiednich kinetycznych substratów różniących się resztami przed resztą przy której jest rozkładane wiązanie peptydowe i za tą resztą, określenie tych reszt preferowanych przez dany enzym rozszerza informacje o jego specyficzności substratowej (bo te reszty nie są obojętne na działanie enzymu)

enzym preferuje pewne reszty przed i za aminokwasem przy którym jest rozkładane wiązanie peptydowe

Mechanizm działania α - amylazy

W 1994r. Mazur i inni zaproponowali mechanizm hydrolizy enzymatycznej wiązania α - 1,4 - glikozydowego w skrobi przez α - amylazę, obecnie uznawany za najbardziej prawdopodobny.

W reakcji uczestniczą 2 reszty Asp (Asp197, Asp300) i 1 reszta Gln (Gln233) oraz sprzężony z Asp197 łańcuch przeniesienia protonu, obejmujący w α - amylazie trzustki wieprzowej Tyr62…Asp96 i Arg195, z której proton jest przekazywany na katalityczny Asp197. W Taka-amylazie A. oryzae obejmuje on His296…Tyr82…Asp117 i Asp204 → Asp206 (kat.).

Reakcja amylolizy składa się z kilku etapów:

1. przyłączenie cząsteczki H₂O do katalitycznego Gln233

2. nukleofilowy atak tlenu z H₂O na C1 rozszczepianego wiązania glikozydowego

3. protonacja cyklicznego atomu w reszcie glukopiranozy z C1 rozszczepianego wiązania proton (dostarcza w/w łańcuch przeniesienia, kończący się zawsze Asp), zdarzenie (2) i (3) daje w efekcie otwarcie pierścienia glukopiranozy (pęknięcie wiązania hemiacetalowego), przy czym do C1 przyłącza się -OH z cząsteczki H₂O; H z cząsteczki H₂O protonuje -COO^- w Gln233, a H z Arg tlen rozszczepionego wiązania hemiacetalowego

4. rotacja wokół wiązań C1 - O (glikozydowe) i O - C4 prowadzi do zmiany położenia grupy -OH przy C1, tak że może ona utworzyć mostek wodorowy z Asp300

5. w wyniku (4) następuje rozszczepienie wiązania glikozydowego C1 - O, a powstały koniec jednego z produktów tworzy nadal mostek wodorowy z Gln233; przy C1 drugiego produktu jest grupa karbonylowa C₁ = O

6. grupy - C₁ = O atakuje nukleofilowo tlen przy C5 tej samej reszty, co prowadzi do zaniknięcia pierścienia glukopiranozy i oddanie protonu z C5 - OH na -COO^-Asp197, towarzyszy temu uwolnienie obu produktów.

Mechanizm dość skomplikowany! (reszty katalityczne, opis w punktach kolejnych etapów reakcji, łańcuch przeniesienia protonów, udział wody na początku reakcji)

β - galaktozydaza: stosunkowo rozpowszechniona w przyrodzie, rozkłada cukier mleczny - laktozę, ale nie tylko, rozkładają też różne oligosacharydy w skład, których wchodzą reszty β - galaktozy połączone między sobą wiązaniami β - 1,4 - glikozydowymi, enzym wytwarzany przez śluzówkę jelita cienkiego (z wiekiem coraz bardziej jest upośledzona biosynteza enzymu - pojawia się nietolerancja laktozy; wzdęcia, biegunki, gazy, obecność laktozy w treści pokarmowej powoduje kłopoty z wchłanianiem wody)

(mleko bezlaktozowe)

enzym produkowany przez liczne drobnoustroje, występuje również u roślin

enzym in vitro - do usuwania laktozy z produktów mlecznych; w pewnych warunkach może syntetyzować wiązania β - 1,4 - glikozydowe, wykorzystywany do syntezy galaktozydów (probiotyki - stymulują rozwój korzystnej mikroflory bakteryjnej w przewodzie pokarmowym człowieka)

u drobnoustrojów morskich (tłuszcze stanowią głowne źródło węgla, mleko nie zawiera laktozy), ale wykorzystywany do trawienia laktozy (wyspecjalizowane w trwieniu pewnych frakcji węglowodanów występujących w glonach morskich)

najwcześniej została rozwiązana struktura β - galaktozydazy u drobnoustrojów E. coli (domena α - β - 8 - beczułki), homotetramer - 4 identyczne podjednostki (po 1023 aminokwasy)

(do ewentualnego dopracowania fragment) ↓

2 modele mechanizmu hydrolizy laktozy przez β - galaktozydazę

Mechanizm działania β - galaktozydazy wg Espinozy i innych (ksero)

Właściwym substratem dla β - galaktozydazy jest allolaktoza (wiązanie β - 1,6).

1. transglikozylacja z utworzeniem allolaktozy

2. wchodzi do reakcji cząsteczka wody, następuje hydroliza wiązania glikozydowego

odszczepia się cząsteczka glukozy

Model wg Chen'y i innych

Zakłada szczególną rolę Gln i reszty Tyr

Pękniecie wiązania glikozydowego i odszczepienie reszty glukozy

Powstaje galaktalyzowany enzym

Wchodzi do reakcji cząsteczka wody

W mechanizmie reakcji z udziałem β - galaktozydazy woda wchodzi do reakcji w drugim etapie, natomiast w działaniu α - amylazy woda na początku jest niezbędna dla zajścia reakcji.

Enzymy drobnoustrojów ekstremofilnych

Ekstremofile:

- ze względu na temperaturę:

psychrofilne: właściwe (temp. wzrostu poniżej 15°C), psychrotrofy (wyższe temp. wzrostu ok. 20°C) - te które wg definicji tworzą makroskopową kolonię w 0°C w czasie do 2 tygodni; pierwszy psychrofilny drobnoustrój wyizolowany z ryby

mezofilne

termofilne

granice: -40°C - 140°C

najniższa temp. dla psychrofili -20°C (np. soczewkowate twory znajdujące się w wodzie morskiej [woda morska - duże stężenia soli])

wieczne zmarzliny w tundrze syberyjskiej aktywność metaboliczna przejawiana w temp. -39°C (-40°C)

najwyższa temp. 121°C, w 130°C przeżywalność jeszcze przez 2h

górna granica dla istnienia życia 140°C

niestabilność koenzymów (główna bariera)

hipertermofile optymalna temp. wzrostu 90°C (archeon - „ognisty ziarniak”)

narzędzia dane człowiekowi przez drobnoustroje hipertermofilne do biologii molekularnej - polimeraza DNA Taq

- ze względu na warunki środowiska:

halofile (produkują substancje, które zatrzymują wodę w cytozolu) - optymalny rozwój przy 19% stężeniu NaCl (przy 30% NaCl - możliwe przetrwanie)

kserofile - odporne na wysuszenie (aktywność wody poniżej 0,8)

osmofile - środowisko o dużym stężeniu cukrów [miód, marcepan]

acidofile - w niskim pH, tzn. poniżej 3 (np. archeon o optymalnym pH 0,7 [przy pH 0 też się rozwija]

alkalofile - pH powyżej 10 (górna granica 13)

endolity - zasiedlają pęknięcia skał („żywią się skałami”) np. na głębokości 3km pod powierzchnią Ziemi (są termofilami - wysoka temp.)

121°C

• 3-4km pod powierzchnią Ziemi

• ok.. 7km pod powierzchnią dna oceanów

hipolity - na skałach, zarówno w wysokich jak i niskich temp., głównie cyjanobakterie
(w skałach dużo kwarcu), te drobnoustroje posiadają filtry UV

piezofile (dawne barofile) - do 1200 atmosfer, w Rowie Mariańskim

oligofile - przy niskim stężeniu substancji odżywczych, poniżej 1 ppm, np. w tzw. clean rooms, w większości oceanów

radiofile - odporne na promieniowanie γ

kaptofile - rozwijają się przy wysokich stężeniach CO₂