12.05.2008r.
Mechanizm działania enzymów (przykłady)
Hydrolazy glikozydowe
α - amylaza: należy do podklasy 2 klasy hydrolaz (Hydrolazy glikozydowe) EC 3.2.1.1.,
4 - glukanohydrolaza - α - 1,4 - glukanu, tnie nie wszystkie wiązania wewnętrzne α - 1,4 - glikozydowe w amylozie i amylopektynie, amyloza (liniowy komponent skrobi) wykazuje strukturę 2 - go rzędową helikalną
wiele α - amylaz tnie wiązania co 6 jednostek
końcowe produkty degradacji amylazy i amylopektyny zależą od pochodzenia enzymu,
od jego specyficzności: mieszanina maltooligosacharydów (maltorioza, maltoza i inne), zdarza się że są pewne ilości glukozy (jeżeli enzym działa wystarczająco długo na substrat), w przypadku działania na amylopektynę powstaje izomaltoza
α - amylazy najbardziej rozpowszechnione w przyrodzie: bakterie, grzyby strzępkowe, drożdże amylolityczne, rośliny, zwierzęta
skrobia jeden z najłatwiej przyswajalnych węglowodanów i dla większości organizmów stanowi dobrze przyswajalne źródło węgla
znana jest struktura molekularna licznych α - amylaz
domena β - α - 8 - beczułki (2 warstwy)
zewnętrzna: 8 odcinków helikalnych,
wewnętrzna: 8 odcinków o strukturze β - fałdowej
α - amylaza należy do enzymów o strukturze α/ β (przemieszane są te odcinki)
rozciągnięta struktura β - α - 8 - beczułki (poddomena D)
w obszarze wiążącym substrat w α - amylazach występują liczne podmiejsca wiążące są dopasowane do glukozy, szczególnie ważne podmiejsca 6,7 - są tam zlokalizowane aminokwasy katalityczne
obecność podmiejscy wiążących: wiążą takie same reszty glukopiranozy stanowiące część łańcucha skrobi
do proteinaz: określając specyficzność substratową, reszty nie są jednakowe, podmiejsca wiążące określają nie tylko przy jakim aminokwasie następuje cięcie wiązania peptydowego ale również określa się rodzaje preferowanych reszt aminokwasów zarówno w stronę C - końca jak i N - końca
(odpowiednie podmiejsca wiążące)
↓ - wiązanie peptydowe jest rozkładane
okazuje się, że te aminokwasy poprzedzające reszty aminokwasów aromatycznych jak i następujące po tych aminokwasach po rozkładanym wiązaniu peptydowych też są rozpoznawane przez enzym i określając specyficzność substratową korzystamy z odpowiednich kinetycznych substratów różniących się resztami przed resztą przy której jest rozkładane wiązanie peptydowe i za tą resztą, określenie tych reszt preferowanych przez dany enzym rozszerza informacje o jego specyficzności substratowej (bo te reszty nie są obojętne na działanie enzymu)
enzym preferuje pewne reszty przed i za aminokwasem przy którym jest rozkładane wiązanie peptydowe
Mechanizm działania α - amylazy
W 1994r. Mazur i inni zaproponowali mechanizm hydrolizy enzymatycznej wiązania α - 1,4 - glikozydowego w skrobi przez α - amylazę, obecnie uznawany za najbardziej prawdopodobny.
W reakcji uczestniczą 2 reszty Asp (Asp197, Asp300) i 1 reszta Gln (Gln233) oraz sprzężony z Asp197 łańcuch przeniesienia protonu, obejmujący w α - amylazie trzustki wieprzowej Tyr62…Asp96 i Arg195, z której proton jest przekazywany na katalityczny Asp197. W Taka-amylazie A. oryzae obejmuje on His296…Tyr82…Asp117 i Asp204 → Asp206 (kat.).
Reakcja amylolizy składa się z kilku etapów:
przyłączenie cząsteczki H2O do katalitycznego Gln233
nukleofilowy atak tlenu z H2O na C1 rozszczepianego wiązania glikozydowego
protonacja cyklicznego atomu w reszcie glukopiranozy z C1 rozszczepianego wiązania proton (dostarcza w/w łańcuch przeniesienia, kończący się zawsze Asp), zdarzenie (2) i (3) daje w efekcie otwarcie pierścienia glukopiranozy (pęknięcie wiązania hemiacetalowego), przy czym do C1 przyłącza się -OH z cząsteczki H2O; H z cząsteczki H2O protonuje -COO- w Gln233, a H z Arg tlen rozszczepionego wiązania hemiacetalowego
rotacja wokół wiązań C1 - O (glikozydowe) i O - C4 prowadzi do zmiany położenia grupy -OH przy C1, tak że może ona utworzyć mostek wodorowy z Asp300
w wyniku (4) następuje rozszczepienie wiązania glikozydowego C1 - O, a powstały koniec jednego z produktów tworzy nadal mostek wodorowy z Gln233; przy C1 drugiego produktu jest grupa karbonylowa C1 = O
grupy - C1 = O atakuje nukleofilowo tlen przy C5 tej samej reszty, co prowadzi do zaniknięcia pierścienia glukopiranozy i oddanie protonu z C5 - OH na -COO-Asp197, towarzyszy temu uwolnienie obu produktów.
Mechanizm dość skomplikowany! (reszty katalityczne, opis w punktach kolejnych etapów reakcji, łańcuch przeniesienia protonów, udział wody na początku reakcji)
β - galaktozydaza: stosunkowo rozpowszechniona w przyrodzie, rozkłada cukier mleczny - laktozę, ale nie tylko, rozkładają też różne oligosacharydy w skład, których wchodzą reszty β - galaktozy połączone między sobą wiązaniami β - 1,4 - glikozydowymi, enzym wytwarzany przez śluzówkę jelita cienkiego (z wiekiem coraz bardziej jest upośledzona biosynteza enzymu - pojawia się nietolerancja laktozy; wzdęcia, biegunki, gazy, obecność laktozy w treści pokarmowej powoduje kłopoty z wchłanianiem wody)
(mleko bezlaktozowe)
enzym produkowany przez liczne drobnoustroje, występuje również u roślin
enzym in vitro - do usuwania laktozy z produktów mlecznych; w pewnych warunkach może syntetyzować wiązania β - 1,4 - glikozydowe, wykorzystywany do syntezy galaktozydów (probiotyki - stymulują rozwój korzystnej mikroflory bakteryjnej w przewodzie pokarmowym człowieka)
u drobnoustrojów morskich (tłuszcze stanowią głowne źródło węgla, mleko nie zawiera laktozy), ale wykorzystywany do trawienia laktozy (wyspecjalizowane w trwieniu pewnych frakcji węglowodanów występujących w glonach morskich)
najwcześniej została rozwiązana struktura β - galaktozydazy u drobnoustrojów E. coli (domena α - β - 8 - beczułki), homotetramer - 4 identyczne podjednostki (po 1023 aminokwasy)
(do ewentualnego dopracowania fragment) ↓
2 modele mechanizmu hydrolizy laktozy przez β - galaktozydazę
Mechanizm działania β - galaktozydazy wg Espinozy i innych (ksero)
Właściwym substratem dla β - galaktozydazy jest allolaktoza (wiązanie β - 1,6).
1. transglikozylacja z utworzeniem allolaktozy
2. wchodzi do reakcji cząsteczka wody, następuje hydroliza wiązania glikozydowego
odszczepia się cząsteczka glukozy
Model wg Chen'y i innych
Zakłada szczególną rolę Gln i reszty Tyr
Pękniecie wiązania glikozydowego i odszczepienie reszty glukozy
Powstaje galaktalyzowany enzym
Wchodzi do reakcji cząsteczka wody
W mechanizmie reakcji z udziałem β - galaktozydazy woda wchodzi do reakcji w drugim etapie, natomiast w działaniu α - amylazy woda na początku jest niezbędna dla zajścia reakcji.
Enzymy drobnoustrojów ekstremofilnych
Ekstremofile:
- ze względu na temperaturę:
psychrofilne: właściwe (temp. wzrostu poniżej 15°C), psychrotrofy (wyższe temp. wzrostu ok. 20°C) - te które wg definicji tworzą makroskopową kolonię w 0°C w czasie do 2 tygodni; pierwszy psychrofilny drobnoustrój wyizolowany z ryby
mezofilne
termofilne
granice: -40°C - 140°C
najniższa temp. dla psychrofili -20°C (np. soczewkowate twory znajdujące się w wodzie morskiej [woda morska - duże stężenia soli])
wieczne zmarzliny w tundrze syberyjskiej aktywność metaboliczna przejawiana w temp. -39°C (-40°C)
najwyższa temp. 121°C, w 130°C przeżywalność jeszcze przez 2h
górna granica dla istnienia życia 140°C
niestabilność koenzymów (główna bariera)
hipertermofile optymalna temp. wzrostu 90°C (archeon - „ognisty ziarniak”)
narzędzia dane człowiekowi przez drobnoustroje hipertermofilne do biologii molekularnej - polimeraza DNA Taq
- ze względu na warunki środowiska:
halofile (produkują substancje, które zatrzymują wodę w cytozolu) - optymalny rozwój przy 19% stężeniu NaCl (przy 30% NaCl - możliwe przetrwanie)
kserofile - odporne na wysuszenie (aktywność wody poniżej 0,8)
osmofile - środowisko o dużym stężeniu cukrów [miód, marcepan]
acidofile - w niskim pH, tzn. poniżej 3 (np. archeon o optymalnym pH 0,7 [przy pH 0 też się rozwija]
alkalofile - pH powyżej 10 (górna granica 13)
endolity - zasiedlają pęknięcia skał („żywią się skałami”) np. na głębokości 3km pod powierzchnią Ziemi (są termofilami - wysoka temp.)
121°C
3-4km pod powierzchnią Ziemi
ok.. 7km pod powierzchnią dna oceanów
hipolity - na skałach, zarówno w wysokich jak i niskich temp., głównie cyjanobakterie
(w skałach dużo kwarcu), te drobnoustroje posiadają filtry UV
piezofile (dawne barofile) - do 1200 atmosfer, w Rowie Mariańskim
oligofile - przy niskim stężeniu substancji odżywczych, poniżej 1 ppm, np. w tzw. clean rooms, w większości oceanów
radiofile - odporne na promieniowanie γ
kaptofile - rozwijają się przy wysokich stężeniach CO2