Budzyńska Małgorzata Symbol podgrupy: 1B

Kosmowski Łukasz 27.11 - 4.12.2007

Osoba prowadząca ćwiczenia: dr Magdalena Polak-Berecka

Temat i numer ćwiczenia:

Produkcja i charakterystyka glukoamylazy. (ćwiczenie nr 4)

1. Cel ćwiczenia

Wyprodukowanie enzymu: glukoamylazy na drodze biosyntezy przy użyciu szczepu grzyba Aspergillus niger C oraz zbadanie wpływu temperatury i pH na aktywność amylolityczną otrzymanego enzymu.

2. Zadania do realizacji

a) Przygotowanie podłoża do biosyntezy glukoamylazy

2. Zaszczepienie podłoża

3. Hodowla Aspergillus niger (30°C bez wstrząsania)

4. Przygotowanie krzywej wzorcowej dla glukozy

5. Przygotowanie roztworów skrobi rozpuszczalnej

6. Uzyskanie płynu pohodowlanego poprzez dodanie do hodowli odpowiedniego buforu, następnie filtracja, a dalej wirowanie.

7. Przygotowanie roztworów skrobi rozpuszczalnej

8. Przygotowanie prób do reakcji enzymatycznych

9. Oznaczenie ekstynkcji otrzymanych roztworów

3. Wprowadzone zmiany w metodykach

Wykonanie podłoża hodowlanego według nowego przepisu podanego przez prowadzącego, hodowla bez wstrząsania oraz uzyskanie płynu pohodowlanego poprzez dodanie buforu do hodowli.

4. Spostrzeżenia i obliczenia

ad. d) Przygotowanie krzywej wzorcowej:

Ekstynkcja otrzymanych roztworów glukozy przy długości fali 550nm wobec próby odczynnikowej:

1. r-r o stężeniu 1mg/ml = 1,110

2. r-r o stężeniu 0,5mg/ml = 0,523

3. r-r o stężeniu 0,25mg/ml = 0,205

4. r-r o stężeniu 0,1mg/ml = 0,051

Wykres str. 3

ad. i) Oznaczenie ekstynkcji otrzymanych roztworów: (λ=550nm, oznaczenie wobec próby odczynnikowej)

	Temperatura
		pokojowa	50^oC	80^oC
Próba właściwa (pH=3)	0,940	2,308	1,096
Próba właściwa (pH=4,5)	0,430	1,791	1,040
Próba właściwa (pH=7,0)	0,192	0,527	0,252
Próba zerowa 1 (pH=3)	0,096	0,095	0,167
Próba zerowa 1 (pH=4,5)	0,105	0,079	0,125
Próba zerowa 1 (pH	0,195	0,103	0,106
Próba zerowa 2 (pH=3)	0,042	0,033	0,027
Próba zerowa 2 (pH=4,5)	0,037	0,024	0,710
Próba zerowa 2 (pH=7,0)	0,042	0,015	0,070

Obliczenie aktywność glukoamylazy:

A - aktywność glukoamylazy w μmolach glukozy ml/min^-1

S - ilość glukozy odczytana z krzywej wzorcowej wyrażona w mg

R - rozcieńczenie enzymu = 5

S - ilość glukozy odczytana z krzywej wzorcowej dla poszczególnych prób:

	Temperatura
		pokojowa	50^oC	80^oC
Próba właściwa (pH=3)	0,80	1,74	0,88
Próba właściwa (pH=4,5)	0,38	1,38	0,86
Próba właściwa (pH=7,0)	0,20	0,48	0,20
Próba zerowa 1 (pH=3)	0,08	0,8	0,18
Próba zerowa 1 (pH=4,5)	0,08	0,07	0,12
Próba zerowa 1 (pH	0,20	0,08	0,08
Próba zerowa 2 (pH=3)	0,06	0,04	0,03
Próba zerowa 2 (pH=4,5)	0,04	0,03	0,07
Próba zerowa 2 (pH=7,0)	0,06	0,02	0,07

A - aktywność glukoamylazy w μmolach glukozy ml/min^-1 dla poszczególnych prób:

	Temperatura
		pokojowa	50^oC	80^oC
Próba właściwa (pH=3)	0,741	1,611	0,815
Próba właściwa (pH=4,5)	0,238	1,278	0,796
Próba właściwa (pH=7,0)	0,185	0,445	0,185
Próba zerowa 1 (pH=3)	0,074	0,074	0,167
Próba zerowa 1 (pH=4,5)	0,074	0,065	0,111
Próba zerowa 1 (pH	0,185	0,074	0,074
Próba zerowa 2 (pH=3)	0,056	0,037	0,028
Próba zerowa 2 (pH=4,5)	0,037	0,028	0,065
Próba zerowa 2 (pH=7,0)	0,056	0,018	0,065

5. Wnioski

Z przeprowadzonych analiz wynika, że największą aktywność amylolityczną glukoamylaza z Aspergillus niger wykazuje w temperaturze 50^oC i zakresie pH 3 - 4,5.

1

---