Metoda izolacji limfocytów z krwi obwodowej w gradientach gęstości

Ogólne zasady izolacji komórek immunologicznie czynnych

Komórki immunologicznie czynne otrzymywane z płynów ustrojowych i tkanek litych są podstawowym materiałem do szeroko prowadzonych w warunkach in vitro badań przy użyciu technik immunologii komórkowej. Techniki immunologii komórkowej pozwalają scharakteryzować poszczególne populacje komórek oraz określić ich stan czynnościowy. Ze względu na duże rozprzestrzenienie się komórek immunologicznie czynnych w organizmie źródłem ich może być wiele narządów i tkanek. Najczęściej jednak uzyskuje się je z krwi obwodowej oraz z litych skupisk komórek limfoidalnych, jak węzły chłonne czy migdałki. Do badań najczęściej izoluje się limfocyty T, limfocyty B, monocyty, granulocyty i komórki NK. Wstępnym etapem otrzymywania komórek immunologicznie czynnych jest zawsze otrzymanie z danej tkanki zawiesiny komórkowej zawierającej różne populacje komórek. Następnym etapem jest wyizolowanie z otrzymanej zawiesiny komórkowej określonej populacji komórek.

Komórki immunologicznie czynne można uzyskać bezpośrednio z układu limfatycznego prowadząc kilkunastogodzinny drenaż przewodu piersiowego. Cewnik umieszczony operacyjnie w przewodzie piersiowym wyprowadza chłonkę do naczynia z lodem. Większość zawiesiny komórek stanowią tu limfocyty. Komórki otrzymywać można z tkanek litych, pobrane narządy kroi się na fragmenty i rozdrabnia mechanicznie przez rozczesywanie igłami, przeciskanie przez sito nylonowe, lub delikatne rozdrabnianie w homogenizatorze.

Wstępny etap otrzymywania zawiesiny komórkowej z płynów ustrojowych jest względnie łatwy. Najczęściej płynem biologicznym, z którego izoluje się komórki, jest krew obwodowa. Krew obwodową pobiera się na heparynę, cytrynian sodu lub EDTA (wersenian sodu) w celu zopobieżenia krzepnięciu i poddaje procesowi sedymentacji przez 1-2 godziny w temperaturze 37°C. Po sedymentacji erytrocytów uzyskany nadsącz zawiera limfocyty, monocyty i granulocyty (czasem niewielką domieszkę erytrocytów). Z krwi limfocyty można izolować przyspieszając samoistną sedymentację erytrocytów dodając do krwi płynną żelatynę lub wielkocząsteczkowe substancje np. dekstran, lub metylocelulozę do końcowego stężenia 0,1-1,5%. Po sedymentacji erytrocytów osocze oprócz limfocytów zawiera także monocyty i granulocyty. Monocyty i neutrofile można usunąć z zawiesiny wykorzystując ich zdolność do fagocytozy żelaza. Po inkubacji w 37^oC, komórki zawierające pochłonięte żelazo usuwa się za pomocą silnego magnesu.

Izolacja komórek immunologicznie czynnych z tkanek litych jest trudniej­sza. W pierwszym etapie bowiem należy je uwolnić ze zrębu łącznotkankowego. W tym celu tkankę rozdrabnia się mechanicznie na małe fragmenty, a następnie skrawki tkanki trawi się za pomocą enzymów (w zależności od rodzaju tkanki stosuje się różne enzymy - kolagenazę, pronazę, DNA-zę, trypsyna, elastaza - w różnych stężeniach). Po trawieniu zawiesinę komórek oddziela się od fragmentów tkanki przesiewając przez odpowiednie sita lub filtry. Źródłem komórek limfoidalnych są węzły chłonne, śledziona, grasica, migdałki, a także płyn jamy otrzewnej i opłucnej oraz krew zwierzęcia, lub człowieka.

Izolację wstępną komórek należy zawsze prowadzić w starannie dobranych warunkach, zależnych od rodzaju tkanki. Skład jonowy środowiska, pH środowiska, obecność substancji stabilizujących błonę komórkową to czynniki krytyczne dla końcowego wyniku. Wpływ na przebieg izolacji mają także temperatura i czas trwania izolacji.

Po zakończeniu etapu wstępnego izolacji komórek należy ocenić otrzyma­ną zawiesinę komórkową, tzn.:

- obejrzeć otrzymane komórki pod mikroskopem i określić rodzaj otrzy­manych komórek oraz udział procentowy każdej z populacji (po wybawieniu barwnikiem May-Grunwald Giemza);

- ocenić żywotność komórek po wybarwieniu barwnikiem przyżyciowym (błękit trypanu, eozyna, zieleń lizaminowa); komórki żywe nie chłoną barw­nika, komórki martwe wybarwiają się.

Oceniając otrzymaną zawiesinę komórkową należy pamiętać, że nastąpiła w niej zmiana proporcji poszczególnych populacji komórkowych w stosunku do proporcji wyjściowej. Zakres zmian jest różny i wynika przede wszystkim z zastosowanej techniki izolacji; zależy również od warunków jej wykonania. Dalsze etapy izolacji i oczyszczania danej populacji komórek można prowadzić różnymi metodami. Dobór metody zależy przede wszystkim od tego. jaką populację komórek chcemy wyizolować. Poniżej przedstawiono niektóre z tych technik, najczęściej stosowane w praktyce.

Wirowanie w gradientach gęstości: zasadę rozdziału komórek na gradientach gęstości są różnice pomiędzy gęstością względną użytego gradientu, a wielkością i masą izolowanych komórek. Gradienty gęstości powinny charakteryzować się niską lepkością, być izoosmotyczne w stosunku do płynów ustrojowych, nietoksyczne, niezdolne do penetracji przez błony biologiczne łatwe do wypłukania z oczyszczonej zawiesiny komórkowej. Najczęściej stosowanym gradientem jest mieszanina Ficoll-Uropilina (Ficoll-hydrofilny, polimer cukrozy, Uropilina- rozpuszczalnik dla Ficollu). Gradient ten na zastosowanie np. do izolacji limfocytów z krwi obwodowej i z innych płynów ustrojowych oraz do rozdziału komórek nowotworowych i limfoidalnych. Innym często stosowanym gradientem gęstości jest gradient Percollu wielostopniowy (Percoll- koloidalna krzemionka pokryta poliwinylowym pyrolidonem). Do rozcieńczenia Percollu stosuje się 0,15 molowy roztwór NaCl. Gradient ten ma zastosowanie np. do rozdziału limfocytów T od B, izolacji komórek NK, izolacji monocytów i granulocytów krwi. Jako gradient gęstości można stosować także roztwór surowicy cielęcej (fetal calf serum- FCS). W gradiencie surowicy cielęcej można rozdzielać np. komórki nowotworowe od limfoidalnych. W celu izolacji komórek w gradiencie gęstości na przygotowany odpowiednio gradient nawarstwia się ostrożnie zawiesinę komórkową i wiruje (warunki zależą od rodzaju oczyszczanej zawiesiny komórkowej). Po odwirowaniu poszczególne populacje komórkowe są rozdzielone wzdłuż gradientu. Daną populację komórek ostrożnie się zabiera i dokładnie odpłukuje.

Izolacja limfocytów w gradiencie Ficoll-Uropilina (Gradisol L); Percoll (Gradisol G)- Warunkiem uzyskania dobrego rozdziału elementów morfotycznych krwi jest stosownie roztworu fikolu z uropiliną o gęstości odpowiedniej dla każdego gatunku, np. 1.077 dla człowieka, 1,091 dla myszy. Zasada rozdziału- różnica pomiędzy gęstością względną gradientu, a masą komórek. Do probówki wirowniczej dodaje się 2 ml gradientu Ficoll - Uropilina i ostrożnie nawarstwia heparynizowaną krew w objętości 1-3 razy większej niż objętość gradientu. Można także nawarstwić pełną krew dwukrotnie rozcień­czoną płynem Hanksa. Probówkę wiruje się przez 20 minut przy 400 g w temperaturze pokojowej. Krew nawarstwia się na gradient. Krwi (4 ml krwi rozcieńczonej 2 krotnie rozcieńczona PBS, lub płynem Hanksa), 3 ml mieszaniny Ficoll-Uropilina. Obie fazy nie mogą się zmieszać. W zastosowanych warunkach większość komórek nielimfoidalnych osiada na dnie probówki, natomiast limfocyty znajdują się na granicy gradientu i osocza (interfaza). Komórki znajdujące się na granicy gradientu i płynu nawarstwionego zbiera się bardzo ostrożnie i prze­płukuje odpowiednim płynem odżywczym. Tak otrzymana frakcja komór­kowa zawiera głównie limfocyty oraz do 15% monocytów, do 5% granulocytów i ewentualnie śladowe ilości erytrocytów. Czystość uzyskanej frakcji limfocytów wynosi 80-85%. Wirowanie w gradisolu G to metoda jednostopniowa a jej dodatkową zaletą jest równoczesne uzyskiwanie czystej frakcji limfocytów, nie tylko granulocytów- błonka.

Metody adherencyjne: metody te oparte są na zdolności przylegania niektórych komórek, zwłaszcza szeregu monocytów (ale także granulocytów i niektórych limfocytów B) do szkła lub plastiku. Oczyszczanie danej populacji komórek z wykorzystaniem zjawiska adherencji prowadzi się w kolumnach wypełnionych watą nylonową, watą szklaną, cząsteczkami wielocukru (np. Sephadexem G-100) lub poliakrylamidu (np. Bio-Gelem) bądź na polistyrenowych płytkach Petriego. Zawiesinę komórek inkubuje się na płytkach lub w kolumnie (30-60 minut w temperaturze 37^oC) i następnie przepłukuje podłoże odpowiednim środowiskiem. Komórki nie przylegające do danego podłoża są wypłukiwane. Aby uzyskać zawiesinę komórek zaadsorbowanych do podłoża, należy następnie wypłukać podłoże 50% roztworem FCS.

Eliminacja komórek na drodze szoku osmotycznego ma na celu usunięcie z danej zawiesiny komórkowej erytrocytów. Do zawiesiny komórek dodaje się albo wodę destylowaną (1 część środowiska + 2 części wody, pH 4,65), albo roztwór chlorku amonu buforowany Trisem (pH 7,4).

Metody z zastosowaniem immunoadsorbentów: Immunoadsorbenty (nośniki), są to kulki szklane kulki plastikowe, cząsteczki agarozy, cząsteczki sepharozy, cząstki poliakrylamidu opłaszczone przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym danej populacji komórek. Immunoadsorbenty umieszcza się w szklanej kolumnie. Mogą one też mieć postać polistyrenowych płytek Petriego opłaszczonych swoistymi przeciwciałami. Podczas inkubacji zawiesiny komórkowej z immunoadsorbentem następuje wiązanie się do opłaszczonych cząsteczek nośnika jedynie tych komórek, które reagują swoiście z danymi przeciwciałami. Aby odzyskać komórki przepłukuje się kolumnę (lub płytkę) dużą ilością odpowiedniego środowiska. Metoda oczyszczania komórek z zastosowaniem immunoadsorbentów jest powszechnie stosowana do izolacji poszczególnych subpopulacji limfocytów.

Rozdział limfocytów T i B na kolumnach z perełkami szklanymi lub watą nylonową, wykorzystując adherencję limfocytów B do perełek szklanych lub waty nylonowej otrzymuje się populację limfocytów T nieznacznie zanieczyszczoną limfocytami B (ok. 2%). Zatrzymane na kolumnie limfocyty B można odzyskać przez wymywanie ich zimną surowicą płodową cieląt. Np. związanie nośnika z przeciwciałami skierowanymi przeciwko immunoglobulinom powoduje ich zatrzymanie w kolumnach limfocytów B mających Ig powierzchniowe. Technika negatywnej selekcji, polega na zastosowaniu cytotoksycznej surowicy odpornościowej, swoistej dla danego typu komórek, oraz dopełniacza, co powoduje lizę komórek. Np. zastosowanie swoistych przeciwciał (najczęściej monoklonalnych) skierowanych przeciw Ag Thy1, markerowi powierzchniowemu mysich limfocytów T oraz dopełniacza, powoduje lizę limfocytów T. W zawiesinie pozostaje więc wzbogacona populacja limfocytów B, oraz martwe limfocyty T.

Izolacja magnetyczna: Nieco inną metodą oczyszczania danej populacji komórek jest metoda izolacji magnetycznej z zastosowaniem paramagnetycznych cząstek polistyrenowych (Dynabeads). Cząstki te o średnicy kilku mikrometrów są opłaszczone przeciwciałami. Następnie miesza się je z zawiesiną komórek i inkubuje. W trakcie inkubacji następuje wiązanie miedzy przeciwciałami opłaszczonymi na nośniku, a komórkami mającymi na powierzchni odpowiedni antygen. Komórki związane z cząsteczkami nośnika usuwa się (wyciąga się) z zawiesiny za pomocą magnesu.

Zjawisko fagocytozy: Jedną z metod oczyszczania zawiesiny komórkowej jest także metoda z wykorzystaniem zjawiska fagocytozy. Do zawiesiny komórkowej dodaje się karbonylek żelaza i inkubuje przez 30-60 minut w temperaturze 37^oC. W trakcie inkubacji komórki fagocytujące, fagocytują drobiny karbonylku żelaza. Po inkubacji z zawiesiny komórkowej usuwa się fagocyty z pochłoniętymi cząsteczkami żelaza oraz nadmiar karbonylku żelaza za pomocą silnego magnesu.

Tworzenie rozet : Ta metoda oparta jest na zjawisku spontanicznego wiązania się erytrocytów barana z limfocytami T człowieka (gdyż limfocyty T mają na swojej powierzchni receptor dla krwinek czerwonych barana- antygenCD2). Wiązanie to jest bardzo trwałe, szczególnie gdy erytrocyty barana zostaną uprzednio inkubowane z neuraminidazą. Utworzone rozetki można oddzielić od pozostałych komórek poprzez wirowanie w gradiencie Ficoll-Uropilina o odpowiedniej gęstości. Po odwirowaniu limfocyty rozetujące znajdują się w osadzie, a wolne w interfazie. Otrzymane rozety rozbija się przez ogrzewanie ich do temperatury 37^oC i wytrząsanie, a erytrocyty owcy usuwa się stosując lizę NH₄Cl buforowanym za pomocą Tris pH 7,2.

Po zakończeniu etapu wstępnego izolacji komórek należy ocenić otrzymaną zawiesinę komórkową tzn. :

- obejrzeć otrzymane komórki pod mikroskopem i określić rodzaj otrzymanych komórek oraz udział procentowy każdej populacji (po wybarwieniu barwnikiem May-Grünwald-Giemza),

- ocenić żywotność komórek po wybarwieniu barwnikiem przyżyciowym (błękit trypanu, eozyna, zieleń lizaminowa); komórki żywe nie chłoną barwnika, komórki martwe wybarwiają się,

Oceniając otrzymana zawiesinę komórkową należy pamiętać, że nastąpiła w niej zmiana proporcji poszczególnych populacji komórkowych w stosunku do proporcji wyjściowej. Zakres zmian jest różny i wynika przede wszystkim z zastosowania techniki izolacji, zależy również od warunków jej wykonania. Dalsze etapy izolacji i oczyszczania danej populacji komórek można prowadzić różnymi metodami. Dobór metody zależy przede wszystkim od tego, jaka populację komórek chcemy wyizolować. Najczęściej stosowane w praktyce techniki to:

* ocena otrzymanej zawiesiny komórkowej (preparat przyżyciowy z eozyną Y- ok. 80-90% komórek żywych- powinno ich tyle być, zieleń lizaminowa; preparat trwały- b.M-G-G).

Jedną z najłatwiejszych metod zagęszczania małych ilości leukocytów jest wirowanie krwi heparynowej w kapilarach w wirówć hematokrytowej. Na granicy miedzy osoczem, a erytrocytami oddziela się warstwa płytek i leukocytów, którą można odciągnąć wraz z fragmentami kapilary i przeznaczyć do badań, np. migracji leukocytów, wykonywania rozmazów.

Najlepszą obecnie techniką jest izolacja komórek na automatycznym saterze (FACS). Zawiesinę komórek miesza się ze znakowanym barwnikiem fluorescencyjnym przeciwciałem skierowanym przeciw określonemu antygenowi powierzchniowemu limfocytów. W świetle lasera intensywność świecenia komórek w mikrokropelkach jest rozpoznawana i komputer kieruje poszczególne krople do odpowiedniego naczynia. Jest to metoda wymagająca specjalistycznego i drogiego wyposażenia.

Do izolacji komórek immunologicznie czynnych oraz ich hodowli stosuje się specjalne podłoże, które zapewnia utrzymanie ich w stanie normalnej aktywności biologicznej. Podłoża te mają odpowiednie pH, sole, witaminy, aminokwasy, źródło energii i wzbogacone są dodatkiem bydlęcej surowicy płodowej w ilości 5-10%. Najczęściej stosowane są podłoża Eagle'a, Parkera 199 lub RPMI 1640.

Makrofagi np. można izolować z jamy otrzewnej zwierząt w kilka dni po dootrzewnowym wstrzyknięciu środków drażniących, takich jak bulion tioiglikolenowy, skrobia, glikogen. Po przepłukaniu jamy otrzewnej płynem hodowlanym otrzymuje się wysięk otrzewnowy zawierający makrofagi pobudzone do fagocytozy. Makrofagi z płuc uzyskuje się drogą perfuzji płuc (przez tchawicę) płynem zawierającym czynnik chelatujący (wersenian sodu) lub przez pocięcie tego narząd na fragmenty i energiczne przemywanie płynem hodowlanym zawierającym czynnik antykoagulacyjny. Do izolacji używa się naczyń szklanych silikonowanych w celu zabezpieczenia przed przywieraniem komórek do podłoża. Ponadto komórki szpiku kostnego zwierząt uzyskuje się przez wymywanie za pomocą igły i strzykawki komórek wypełniających wnętrze kości udowej obciętej z obu stron . Po sedymentacji fragmentów tkanki uzyskuje się zawiesinę komórek o różnym stopniu dojrzałości i kompetencji immunologicznej.

1

---