Oznaczenie białek metodą Bradforda

Oznaczenie opiera się na wiązaniu barwnika Coomassie Brilliant Blue 250 do białek.

Barwnik ten, zależnie od pH roztworu, występuje w trzech formach: kationowej (czerwonej), obojętnej (zielonej) i anionowej (niebieskiej).

W warunkach kwaśnych barwnik występuje w formie kationowej, podwójnie protonowanej (A_max = 470 nm). Po związaniu z białkiem (głównie z aminokwasami zasadowymi i aromatycznymi), przechodzi w stabilną formę niebieską (A_max = 595 nm). Dlatego też stężenie białka oznaczane jest przy długości fali 595 nm.

Oznaczenie:

Roztwór białka rozcieńczyć do objętości 800 l (ekstrakty wymagają
nie więcej niż 2 l białka, bardziej rozcieńczone preparaty należy użyć
w większych objętościach: 5-20 l)

Dodać 200 l gotowego odczynnika Bradforda.

Próba ślepa: 800 l H₂O + 200 l odczynnika Bradforda

Z pomiaru absorpcji przy 595 nm należy obliczyć stężenie białka:

C [μg/μl] = A₅₉₅ x b : c

Gdzie:

C - stężenie białka w μg/μl

b - współczynnik wyznaczony z krzywej wzorcowej (tu: 16,2)

c - ilość l białka użyta do oznaczenia

---