Zestaw II

1. Metabolizm pirogronianu

2. Struktura I-rzędowa białek - metody badania.

Struktura I rzędowa - zwana również strukturą pierwotną, jest określona przez sekwencję (kolejność) aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi w łańcuchu polipeptydowym. W strukturze tej zawarte jest także położenie wszystkich innych wiązań kowalencyjnych (są to głównie wiązania disiarczkowe między resztami cysteiny, sąsiadującymi ze sobą w przestrzeni, ale nie w sekwencji liniowej aminokwasów). Sekwencja pierwszorzędowa determinuje wyższe struktury.

Określenie struktury I rzędowej białka

a) Jeśli białko jest heteropolimeryczne, tzn. zawiera więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy, to łańcuchy należy rozdzielić i oczyścić.

Aby ustalić sekwencję białka zbudowanego z wielu podjednostek, należy najpierw doprowadzić do dysocjacji poszczególnych łańcuchów polipeptydowych. W tym celu stosuje się odpowiednie odczynniki denaturujące:

- wiązania wodorowe - 8M mocznik

6M chlorowodorek guanidyny

- diS - utlenianie kwasem nadmrówkowym do SO32-

- redukcja za pomocą β - merkaptoetanolu do -SH a następnie należy podziałać kwasem jodooctowym lub akrylonitrylem, aby zablokować grupę -SH i zapobiec powstawaniu nowych wiązań diS

- hydrofobowe - detergenty

- jonowe - kwasy, zasady

Rozdział heteropolimerów przeprowadzamy:

- biorąc pod uwagę wielkość (rozmiar) cząsteczek:

• Elektroforeza żelowa (na żelu poliakryloamidowym) w obecności SDS - rozdział białek odbywa się na podstawie masy cząsteczkowej białka.

• Chromatografia żelowa - filtracja żelowa (sączenie molekularne). Fazą nieruchomą jest żel polisacharydowy, który działa jak sito molekularne. Jego cząstki zawierają wypełnione wodą puste przestrzenie - kanaliki - do których przenikają małe i średnie cząsteczki. Duże cząsteczki pozostają na zewnątrz. Odpowiedni rozpuszczalnik wymywa je.

• Ultrafiltracja

• Ultrawirowanie - wirowanie w gradiencie gęstości.

W tym celu nawarstwia się roztwory sacharozy o różnej gęstości. Podczas wirowania białka wędrują tak długo, aż własna gęstość białka zrówna się z gęstością rozpuszczalnika.

Po odwirowaniu rozdzielamy warstwy przez kolejne zlewanie każdej z nich z osobna.

- biorąc pod uwagę ładunek elektryczny:

• Chromatografia jonowymienna

• Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym

Przy odpowiednim pH, które ustala się przez zastosowanie buforu, różne białka wędrują w polu elektrycznym zgodnie ze swoim ładunkiem elektrycznym. Cząsteczki białka o wypadkowym cząstkowym ładunku ujemnym wędrują w kierunku Anody, białka posiadające ładunek dodatni - w kierunku Katody. Prędkość wędrówki zależy od sumy ładunków, wielkości i kształtu cząsteczki. (Elektroforeza dyskowa, Immunoelektroforeza)

• Elektroforeza w gradiencie pH - ogniskowanie izoelektryczne

Białko będzie wędrowalo do momentu osiągnięcia pozycji, w której pH żelu zrówna się z pH białka

• HPLC

- biorąc pod uwagę wielkość cząsteczki i ładunek elektryczny

• Rozdzielanie na podstawie rozpuszczalności.

Polega na wysalaniu z roztworu wodnego solami obojętnymi np.: (NH4)2SO4 lub MgSO4

Do roztworu białek dodaje się wzrastającą ilość soli każdorazowo odwirowując wytrącone białko. Przez zmianę pH metodę można udoskonalić. Metoda ta stosowana jest tylko do oczyszczania wstępnego.

b) Określenie reszty aminokwasowej na N i C - końcukażdego z rozdzielonych łańcuchów.

N - koniec

A) z odczynnikiem Sangera (1 - fluoro - 2,4 - dinitrobenzen) FDNB

w środowisku alkalicznym -> HF + dinitrofenyl - peptyd -> kwaśna hydroliza -> rozrywa łańcuch polipeptydowy -> aan + dinitrofenyl - aa (N - końcowy aminokwas połączony przez grupę -NH2 z dinitrobenzenem). Jest to żółta pochodna dinitrofenylowa, nie ulegająca rozkładowi w czasie hydrolizy.

Z odczynnikiem może również kondensować grupa -SH Cysteiny, -OH Tyrozyny, dodatkowe grupy -NH2 aminokwasów zasadowych, pierścień imidazolowy Histydyny.

Dinitrofenylowe pochodne można rozdzielić chromatograficznie (bibułowa, cienkowarstwowa, kolumnowa)

B) z chlorkiem dansylu (HCl 1-dimetyloaminonaftyleno-5-sulfonylu) -> HCl + dansyl - peptyd -> kwaśna hydroliza -> dansyl - aa + aan

Identyfikację aminokwasu z aminowego końca można uzyskać, przeprowadzając reakcje białka ze zwiazkiem tworzącym stabilne wiązania kowalencyjne, zanim białko to zostanie poddane hydrolizie. Wyznakowany aminokwas z N-końca można zidentyfikować przez porównanie jego właściwości chromatograficznych z wzorcowymi pochodnymi aminokwasów. Związkami powszechnie stosowanymi w celu analizy N-końca są dinitrofluorobenzen i chlorek dansylu.

Reakcja ta jest ok.100 razy czulsza niż z odczynnikiem Sangera

C) DEGRADACJA EDMANA z fenyloizotiocyjanianem (odczynnikiem Edmana)

Degradacja Edmana pozwala na kolejne odszczepienie reszt aminokwasowych z konca N białka lub peptydu i kolejną ich identyfikację. Pozbawiona ładunku reszta aminokwasu na końcu białka reaguje z fenyloizotiocyjaniane, tworząc fenylotiokarbamoilową pochodną uwalnianą z białka w środowisku lekko kwaśnym w postaci fenylotiohydantoinowej (PTH) pochodnej aminokwasu. Skrócone o jedną resztę aminokwasową białko można poddać kolejnemu cyklowi znakowania i odszczepiania. Uwolnione PTH-aminokwasy można zidentyfikowac za pomocą HPLC.

środowisko alkaliczne pH=8 - 9 -> fenylotiokarbamoilowe pochodne -> słaby kwas trifluorooctowy -> fenylotiohydantoinowa pochodna z N - końca + peptyd

Analiza ciągła np. przez zastosowanie metod chromatograficznych.

C - koniec

A) Hydrazynoliza - reakcja Akabori

polipeptyd + bezwodna hydrazyna NH2-NH2 w 100°C 5 godzin -> hydrazydy + wolny C-terminalny aminokwas. Identyfikacja chromatograficzna. Potwierdzenie - reakcja barwna.

B) Redukcja C - końcowego aminokwasu za pomocą LiAlH4 (wodoroglinian litu)

wolna grupa -COOH -> redukcja do -CH2-OH (alkoholu) -> kwaśna hydroliza -> aminoalkohol z C-końcowego aminokwasu (oznaczany chromatograficznie) + aan

C) Karboksypeptydaza - odcina C - końcowy aminokwas (z wolną grupą -COOH)

- karboksypeptydaza A - odcina C - końcowy aminokwas oprócz Pro, Arg, Lys

- karboksypeptydaza B - efektywna, gdy C - końcowym aminokwasem jest Arg lub Lys

c) Fragmentacja łańcucha polipeptydowego

Analiza składu aminokwasowego pozwala na wyznaczenie liczby każdego rodzaju aminokwasu w białku. Oczyszczona próbkę poddaje się fragmentacji:

A) Enzymatyczna

- Trypsyna - tnie wiązania peptydowe po karboksylowej stronie reszt Arg i Lys

- Chymotrypsyna - po stronie karboksylowej reszt aminokwasów aromatycznych (Phe, Tyr, Trp)

- Klostrypaina - po stronie karboksylowej reszt Arg

- Proteaza ze Staphylococcus- po karboksylowej stronie reszt asparaginianowych i glutaminianowych (glutaminowych tylko w pewnych warunkach: w buforze wodorowęglanowym lub octanowym). Enzym bardzo wybiórcz.

B) Nieenzymatyczna fragmentacja

- Bromocyjan (CNBr) - po karboksylowej stronie reszt metioninowych

- O - jodobenzen - po karboksylowej stronie reszt tryptofanowych

- Hydroksylamina - wiązania Asn-Gly w pH=9,0 Asp-Pro w pH=2,5 w 40°C

- 2-Nitro-5-tiocyjanobenzen - po aminowej stronie reszt Cysteiny

Rozdzielenie fragmentów np. chromatograficznie i określenie ich sekwencji:

- degradacja Edmana

- spektroskopia masowa (dokładność i czułość)

3. Polimerazy DNA

Polimeraza DNA - enzym katalizujacy syntezę DNA. Synteza ta polega na polimeryzacji deoksyrybonukleotydów przez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych między nimi.

Cechy wspólne polimeraz DNA:

- katalizują syntezę DNA z deoksyrybonukleotydów trifosforanowych,

- wykorzystują nić DNA jako matrycę,

- wymagają startera z wolną grupą 3'-OH,

- wydłużają łańcuch DNA w kierunku 5'-> 3', przyłączając kolejne deosksyrybonukleotydy do grupy -OH w pozycji 3',

- wykazują aktywność egzonukleazową 3'->5'

Polimerazy DNA bakteryjne

Zasadnicza część łańcucha jest syntetyzowana przez polimerazę III. Polimeraza I usuwa startery i uzupełnia niewypełnione przerwy. Polimeraz II bierze udział w naprawie uszkodzeń DNA.

a) Polimeraza DNA I

Enzym monomeryczny, usuwa startery i wypełnia przerwy między poszczególnymi fragmentami Okazaki. Działa 100 razy wolniej niż polimeraza III, Posiada trzy aktywności enzymatyczne, co jest nietypowe dla monomeru:

• polimerazowa

• egzonukleazowa 3'->5' usuwa pojedyncze nukleotydy

• egzonukleazowa 5'->3' - usuwa zarówno pojedyncze nukleotydy od końca 5' jak i oligonukleotydy od konca 5'. Ta ostatnia aktywność ma znaczenie przy usuwaniu startera.

Polimeraza I uczestniczyw naprawie błędów w replikacji, usuwa miejsca uszkodzenia, np. Dimery pirymidynowe powstałe pod działaniem promieniowania UV.

• b) Polimeraza DNA II

Enzym monomeryczny, posiadający dwie aktywności:

• polimerazowa

• egzonukleazowa 3'—>5'

Polimeraza ta nie uczestniczy w procesie replikacji DNA, jej funkcja polega na naprawianiu uszkodzeń DNA.

• c) Polimeraza DNA III

Enzym umiejscowiony w widełkach replikacyjnych, będący głównym inicjatorem replikacji DNA, wykorzystuje starter zsyntetyzowany przez prymazę.

Polimeraza DNA III występuje w postaci dimeru, w którym jedna jednostka syntetyzuje nić prowadzącą a druga opóźnioną.

Nic prowadząca jest syntetyzowana w sposób ciągły przez jedną cząsteczkę polimerazy III, która nie odłącza się od matrycy aż do zakończenia replikacji. Nić opóźniona jest syntetyzowana w fragmentach Okazaki.

Aktywności enzymatyczne:

• polimerazowa

• egonukleazowa 3'->5' - każdy wbudowany nukleotyd jest sprawdzany i w przypadku wbudowania niewłaściwego jest usuwany.

• Polimerazy DNA eukariota

• 1) Polimerazy obecne w jądrze komórki

W replikacji chromosomowego DNA uczestniczą polimerazy DNA α i δ. DNA β i ε są czynne w procesach naprawy DNA. Polimeraza DNA γ występuje w mitochondriach i replikuje mitochondrialny DNA.

• a) Polimeraza DNA α

Wchodzi w skład kompleksu enzymatycznego wraz z polimerazami: δ i ε. Z polimerazą δ odpowiada za syntezę DNA. Katalizuje syntezę nici opóźnionej przez fragmenty Okazaki oraz tworzy startery konieczne do inicjacji syntezy DNA (w skład polimerazy α wchodzi podjednostka o aktywności prymazy). Nie ma aktywności egzonukleazowej 3'-> 5'.

• b) Polimeraza DNA β

Enzym zajmujący się (wraz z polimerazą ε) naprawą uszkodzeń DNA.

Usuwa dimery tymidynowe leżące na tej samej nici, a które uniemożliwiają replikację.

c) Polimeraza DNA δ

Syntetzuje nić wiodącą. Ma aktywność egzonukleazową 3'-> 5' i dzięki temu może korygować ewentualne błędy w syntetyzowanym DNA.

• d) Polimeraza DNA ε

Razem z polimerazą DNA δ ma aktywność egzonukleazową, dzięki której może naprawiać błędy powstałe w trakcie replikacji.

• 2) Polimerazy obecne w mitochondrium

a) Polimeraza DNA γ Enzym zajmujący się syntezą mitochondrialnego, pozajądrowego materiału genetycznego. Jego działanie, jak i replikacja DNA mitochondrialnego jest odmienny od działania pozostałych polimeraz DNA. Jest aktywna cały czas, ponieważ synteza mitochondrialnego DNA zachodzi stale.

---