Dzień 2 / wtorek / dr Anna Rokicka
Cytogenetyka klasyczna (powtórzenie wiadomości z I roku)
1. Techniki otrzymywania chromosomów metafazowych oraz o wysokiej rozdzielczości HRT
2. Podstawowe barwienie chromosomów (prążki Q, G, C, R AgNOR)
3. Rodzaje aberracji chromosomowych, przyczyny ich powstania
4. Zapis prawidłowego kariotypu i kariotypu z aberracjami chromosomowymi '
I. Zastosowanie analizy cytogenetycznej w diagnostyce chorób genetycznych uwarunkowanych aberracjami chromosomowymi
Diagnostyka cytogenetyczna obejmuje przede wszystkim choroby uwarunkowane genetycznie, które są wynikiem widocznych zmian ilościowych bądź strukturalnych chromosomów. Częstość występowania w populacji wynosi 0,6%. Badanie cytogenetyczne polega na określeniu kariotypu pacjenta.
Skutki kliniczne aberracji chromosomowych wynikają z braku równowagi genetycznej, której przyczyną jest zmiana ilości bądź struktury chromosomów, a co za tym idzie zmiana dawki genów i zaburzenia ich funkcji regulatorowych.. Niezrównoważone aberracje chromosomowe objawiają się zawsze zespołem cech klinicznych (wielowadzie) dotyczących wielu układów i narządów. Najczęściej występujące objawy to: upośledzenie umysłowe, cechy dysmorficzne, mnogie wady rozwojowe, opóźnienie rozwoju somatycznego. Większość aberracji jest letalna o czym świadczy ich obecność w około 60 % poronień samoistnych oraz u około 6-11% przypadków martwych urodzeń i zgonów okołourodzeniowych.
Najczęściej spotykanymi zaburzeniami chromosomowymi chromosomów noworodków są trisomie chromosomów autosomalnych 21, 18, 13, 8, 9 oraz chromosomów płciowych: 47, XXY; 47, XYY; 47,XXX; 45,X.
Zrównoważone aberracje chromosomowe nie mają zazwyczaj wpływu na fenotyp, mogą natomiast prowadzić do poronień samoistnych lub w skrajnych przypadkach do bezpłodności.
Podejrzenie lub rozpoznanie kliniczne aberracji chromosomowej wymaga zawsze potwierdzenia badaniem cytogenetycznym. Stwierdzenie natomiast strukturalnej aberracji chromosomowej u dziecka obliguje do oceny kariotypu u zdrowych rodziców co umożliwia identyfikację nosicieli zrównoważonych aberracji chromosomowych (rodzin ryzyka genetycznego)
Większe od populacyjnego , ryzyko urodzenia dziecka z aberracją chromosomową stanowi wskazanie do prenatalnej oceny kariotypu. Ryzyko takie to: wiek matki powyżej 35 lat, aneuploidia u dziecka z poprzedniej ciąży, nosicielstwo translokacji zrównoważonej przez jednego z rodziców. Materiałem do badań prenatalnych są amniocyty (komórki płynu owodniowego) pobrane drogą amniopunkcji (11-14 lub 16-17 tydzień ciąży) i komórki trofoblastu uzyskane przy pomocy aspiracji przez powłoki brzuszne lub przez szyjkę macicy (8-11 tydzień ciąży)
II Zastosowanie analizy cytogenetycznej w diagnostyce chorób nowotworowych.
Wiadomo, że podstawową przyczyną powstawania nowotworów jest uszkodzenie określonych genów (zwykle mutacje w tych genach kumulują się przez lata), które zaburzają prawidłowy przebieg wzrostu, różnicowania się i kontrolowanej śmierci komórki. Aktualne dane wskazują, ze około 1 na 4 zgony jest spowodowany chorobą nowotworową.
W nowotworach często stwierdza się obecność licznych aberracji chromosomowych zarówno liczbowych jak i strukturalnych. Niektóre z nich mogą być charakterystyczne dla określonego typu nowotworu , inne mogą występować w wielu różnych rodzajach nowotworów, inne mogą być mniej lub bardziej unikatowe.
Wykazano, że zdecydowana większość komórek nowotworowych układu krwiotwórczego oraz niektórych chłoniaków złośliwych charakteryzuje się obecnością aberracji chromosomowych wysoce swoistych i dlatego analiza kariotypu w tego typu nowotworowych jest ważnym czynnikiem diagnostycznym, wspomagającym diagnostykę różnicową. Identyfikacja punktów złamań i charakterystyka chromosomów zaangażowanych w te aberracje stały się ważną wskazówką dla badań molekularnych genów zlokalizowanych w miejscach rearanżacji fragmentów chromosomowych. Poznano niektóre produkty białkowe tzw. genów fuzyjnych powstałych w wyniku translokacji chromosomowych.
Znanych jest szereg przykładów swoistych aberracji chromosomowych oraz genów zlokalizowanych w miejscach ich pęknięć:
a/. translokacja między chromosomami 9 i 22 zapisana jako: t(9;22)(q34;q11) występuje w większości przypadków przewlekłej białaczki szpikowej (CML). Chromosom 22 w wyniku tej translokacji jest nieco mniejszy, łatwy do identyfikacji i nazywany często chromosomem Filadelfia. Translokacja ta przenosi fragment protoonkogenu c-abl z chromosomu 9 w region chromosomu 22 określany jako bcr. Powstaje gen fuzyjny bcr-abl, który zaczyna produkować nieprawidłowe białko bcr-abl o masie czasteczkowej 210 kDa. Białko to ma silne właściwości transformacyjne.. Ta sama translokacja t(9;22) ale z innymi punktami złamań wykrywana jest również w przebiegu ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL). Powstaje także gen fuzyjny, który koduje białko o masie 190 kDa. Wykrycie tych translokacji i określenie masy białka bcr-abl mają znaczenie diagnostyczne i rokownicze.
b/ w ostrej białaczce promielocytowej występuje translokacja t(15;17)(q22;q11) w wyniku której dochodzi do uszkodzenia genu kodującego kwas retinowy w chromosomie 17 odpowiedzialnego za dojrzewanie promielocytów.
c/. w większości przypadków chłoniaka Burkitta występuje translokacja między chromosomem 8 i 14 zapisana jako; t(8;14)(q24;q32). Fragment chromosomu 8 zawierający onkogen c-myc jest przeniesiony w rejon promotora genu kodującego IGH co powoduje nadekspresję onkogenu
W porównaniu do analizy cytogenetycznej nowotworów układu krwiotwórczego badania cytogenetyczne guzów litych czy innych typów nowotworów są mniej zaawansowane i mają mniejsze znaczenie diagnostyczne. Niemniej jednak w wielu przypadkach e aberrac je chromosomowe np.:
a/ guz Ewinga charakteryzuje się translokacją t(11;22)(q24;q12), która prowadzi do powstania genu fuzyjnego, którego produkt ma właściwości transformacyjne. Występuje również trisomia chromosomu 8 jako aberracja tzw. wtórna, która wiąże się z progresja guza nowotworowego
b/. siatkówczak (retinoblastoma) rozwija się niemal u wszystkich dzieci na skutek delecji prążka q14.1 w chromosomie 13. W tym rejonie zlokalizowany jest gen supresorowy
Rb.
c/. guz Wilmsa (nephroblastoma) występuje na skutek delecji prążka p13 w chromosomie 11
III. Zastosowanie analizy cytogenetycznej w diagnostyce chorób z niestabilnością chromosomów
Zespoły o genetycznie uwarunkowanej niestabilności chromosomów należą do chorób monogenowych , rzadko występujących, które dziedziczą się w sposób autosomalny recesywny. Choroby te poza charakterystycznymi dla danego zespołu objawami klinicznymi posiadają cechy wspólne takie jak: opóźnienie rozwoju, defekty układu immunologicznego oraz zwiększoną predyspozycję do rozwoju nowotworów. Kariotypy pacjentów są prawidłowe, ale przy zastosowaniu odpowiedniej analizy cytogenetycznej można wykryć obecność specyficznych dla choroby markerów w postaci występowania spontanicznych lub indukowanych pęknięć chromosomów i specyficznych dla zespołu aberracji chromosomowych. Zwykle występują zaburzenia systemu naprawy DNA. Przykłady:
a/ Ataxia teleangiectasia (cechy kliniczne; postępująca niezborność móżdżkowa, teleangiektazje czyli rozszerzenia naczyń spojówek i skóry twarzy , nawracające zakażenia dróg oddechowych, nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące, skłonności do występowania chłoniakow) charakteryzuje się obecnością różnego typu aberracji chromosomowych głównie translokacji i inwersji w chromosomach 7 i 14 pary. Ponadto komórki pacjentów wykazują zwiększoną wrażliwość na promieniowanie rentgenowskie, objawiającą się znacznym wzrostem częstości złamań chromosomów.
Częstość występowania zespołu: 1/40 tys. - 1/100 tys.
b/ zespół Blooma . (cechy kliniczne: mała masa urodzeniowa, niskorosłość, wysypka na twarzy jako efekt nadwrażliwości na promieniowanie słoneczne, predyspozycje do białaczek i nowotworów różnych narządów) charakteryzuje się cytogenetycznie wzrostem częstości wymian siostrzanych chromatyd (SCE - Sister Chromatid Exchange) w stosunku do wymian występujących spontanicznie u osób zdrowych. U chorych stwierdza się 60-100 SCE/komórkę, podczas gdy u osób zdrowych nie więcej niż 10 SCE/komórkę.
Częstość występowania zespołu; 1/40 tys.- 1/55 tys.
c/ zespół Fanconiego (cechy kliniczne: niskorosłość, anemia, predyspozycja do ostrej białaczki limfatycznej, hyperpigmentacja skóry, wady rozwojowe układu kostnego) charakteryzuje się cytogenetycznie zwiększoną częstością występujących spontanicznie różnego typu aberracji chromatydowych i chromosomowych. Testem diagnostycznym jest badanie częstości złamań chromatydowych występujacych po indukcji mitomycyną C. Stwierdzenie 2-5 złamań /komórkę potwierdza rozpoznanie choroby.
U zdrowych osób częstość ta nie przekracza 0,3/komórkę. Anemia Fanconiego jest chorobą poligenową. Spośród genów kandydatów zlokalizowano trzy: w chromosomie 16, 9 i 3. Uważa się, że ponad 60% przypadków spowodowanych jest mutacjami genu FAA w chromosomie 16, który zaangażowany jest w system reperacji DNA.
Częstość występowania; 1/360 tys.
d/ Xeroderma pigmentosum (cechy kliniczne: mnogie guzy skórne, nadwrażliwość na światło słoneczne, zaćma , bliznowacenie rogówki). . Cytogenetycznie stwierdza się zwiększoną częstość złamań chromosomowych.
Częstość występowania; 1/250 tys.
e/ zespół Nijmegen (cechy kliniczne; małogłowie z prawidłowym rozwojem umysłowym, zaburzenia odporności, predyspozycja do rozwoju chłoniaka). Badanie cytogenetyczne wykazuje translokacje miedzy chromosomami pary 7 i 14 oraz inwersje w chromosomie 7 w około 35% limfocytów.
Częstość występowania zespołu podawana jest jako rzadka ale w ostatnich latach w Polsce opisano 68 przypadków a w Czechach 25.
Cytogenetyka molekularna
Opracowane w latach 80-tych metody cytogenetyki molekularnej oparte są na osiągnięciach biologii molekularnej i cytogenetyki klasycznej. Główną zaleta tych metod jest możliwość lokalizacji fragmentów DNA lub RNA bezpośrednio w materiale biologicznym (bez izolowania DNA) w preparatach chromosomowych, komórkach interfazowych, w skrawkach utrwalonych tkanek, w rozmazach komórkowych - na wszystkich etapach kondensacji chromosomu, a więc zarówno w jądrach komórek interfazowych, jak i podczas podziału komórkowego.
1. Technika FISH
Podstawową metodą cytogenetyki molekularnej jest technika FISH (fluorescence in situ hybridization). W badaniu tą metodą sonda molekularna, którą jest specyficzny dla danego chromosomu fragment DNA, hybrydyzuje z komplementarnym do niej DNA chromosomowym na preparacie. Chromosomy mogą być w stadium metafazy, profazy lub interfazy. Sonda może być bezpośrednio znakowana fluorochromem lub pośrednio poprzez różnego rodzaju modyfikacje np. wbudowanie do niej biotyny lub digoksygeniny oraz zastosowania odpowiedniego systemu rozpoznawania znacznika. Dla biotyny jest to awidyna a dla digoksygeniny - antydigoksygenina. Sondy wyznakowane biotyną lub digoksygeniną wykrywane są w reakcji immunocytochemicznej z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem. Preparaty oglądane są w mikroskopie fluorescencyjnym. Fluorochrom znakujacy sondę lub przeciwciało pod wpływem promieniowania UV emituje światło widzialne, które po przejściu przez filtry daje obraz jasno świecącego punku w miejscu zhybrydyzowanej sondy. Analiza cytogenetyczna przy zastosowaniu metody FISH polega na stwierdzeniu obecności lub nieobecności sygnału fluorescencyjnego oraz określeniu jego wielkości, ilości oraz lokalizacji w chromosomie.
W metodzie FISH używane są różne sondy molekularne:
- sondy „rozpoznające” obszary centromerowe lub telomerowe stosowane do wykrywania poszczególnych chromosomów
- sondy komplementarne do unikalnych sekwencji DNA w obrębie ramion danego chromosomu stosowane np. do wykrywania tzw. mikrodelecji (ubytku) fragmentu DNA o wielkosci około 3mln pz, niewykrywalnych klasycznymi metodami prążkowania
- sondy złożone tzw. malujące, pokrywające całe chromosomy - komplementarne do DNA całego chromosomu. Jest to technika „malowania chromosomów”.
Zastosowanie FISH w cytogenetycznej diagnostyce klinicznej
a/. powszechni wykorzystuje się do określenia, czy dany fragment chromosomu ulega u pacjenta delecji. U osoby zdrowej sonda hybrydyzuje w dwóch miejscach co oznacza obecność dwóch kompletnych chromosomów homologicznych w jądrze komórki. Jeżeli sonda komplementarna do określonego fragmentu chromosomu hybrydyzuje tylko w jednym chromosomie, oznacza to, że u pacjenta w drugim chromosomie homologicznym występuje delecją. (diagnostyka zespołów chorobowych uwarunkowanych mikrodelecjami)(odnośnik)*
b/ wykrywanie aneuploidii i chromosomów markerowych nieznanego pochodzenia przy użyciu sondy malującej specyficznej dla określonego chromosomu (identyfikacja monosomii, trisomii, częściowej monosomii, częściowej trisomii)
c/ wykrywanie złożonych aberracji strukturalnych, które dotyczą dwóch lub kilku chromosomów na skutek złamań i translokacji między nimi. W badaniach tych stosuje się sondy malujące o innej barwie świecenia fluorochromu dla jednej, dwóch lub trzech par chromosomów
d/ szybka diagnostyka najczęściej występujących aneuploidii chromosomowych zarówno w komórkach interfazowych jak i w chromosomach metafazowych, co jest szczególnie ważne w badaniach prenatalnych ( szybkie wykrywanie trisomii 13, 18, 21 oraz X i Y). W badaniach stosowany jest zestaw sond o różnym wybarwieniu ,specyficznych dla tych pięciu chromosomów. Najczęściej używane są sondy komplementarne do regionów centromerowych tych chromosomów. Badanie polega na analizie liczby sygnałów hybrydyzocyjnych każdej sondy.
e/ /wykrywanie pojedynczych genów - możliwe jedynie w przypadkach dużych genów takich, jak np. gen dystrofiny - około 2,5 mln par zasad (możliwość diagnozowania dystrofii mięśniowej Duchenna oraz nosicielstwa zmutowanego genu, co jest wazne dla prognozowania genetycznego tej choroby w rodzinie)
f/ wykrywanie wirusów i pasożytów człowieka w diagnozowaniu chorób zakaźnych, przy użyciu sond specyficznych do DNA pasożyta
II. Modyfikacje techniki FISH
a/ Dalszy postęp doprowadził do opracowania techniki wielobarwnego kariotypowania FISH (M-FISH czyli multiplex FISH). W tej metodzie do chromosomów metafazowych hybrydyzowany jest zestaw specyficznych dla poszczególnych chromosomów sond, z których każda wyznakowana jest inną kombinacją wiążących się z DNA barwników fluorochromowych. Zwykle używa się do kombinacyjnego znakowania sond tylko 5 różnych fluorochromów w różnych stosunkach ilościowych, co w efekcie końcowym umożliwia uwidocznienie 24 chromosomów , każdego w innym kolorze. Obraz jest sztucznie uwidoczniony przez zastosowanie odpowiedniego oprogramowania komputerowego. Dla każdej pary chromosomów można również skonstruować specyficzny, wielobarwny wzór prążkowy z wykorzystaniem widmowej analizy chromosomowej.
b/ Metoda analizy widmowej kariotypu (SKY) łączy spektroskopię, obrazowanie kamerą oraz mikroskopię optyczną. 24 wyznakowane metodą kombinacyjną sondy malujące chromosomy, hybrydyzowane są do do płytki metafazowej, a widmo emitowanego swiatła poszczególnych fluorochromów przkształcane jest w widmo różnie dających się odczytać kolorów w zakresie światła widzialnego i bliskiego podczerwieni. Każdej parze chromosomów nadany jest sztuczny kolor. W modyfikacjach metody FISH subiektywna ocena barwy światła przez oko ludzkie zastąpiona jest automatyczną, komputerową analizą widma emitowanego światła przez poszczególne chromosomy. Pozwala to na szybką identyfikację rearanżacji chromosomów. Metoda ta stosowana jest przede wszystkim w niezwykle trudnej diagnostyce cytogenetycznej chorób nowotworowych, które charakteryzują się zazwyczaj licznymi i złożonymi aberracjami chromosomowymi.
c/ Na początku lat 90-tych opracowano porównawcza hybrydyzacja genomowa
(comparative genomic hybridization) CGH. W metodzie tej sondę molekularną stanowi tzw. sonda genomowa, która jest mieszaniną w stosunku 1:1 wyizolowanego DNA pacjenta np. z komórek nowotworowych i DNA referencyjnego z komórek kontrolnych (prawidłowych). DNA z komórek nowotworowych wyznakowane jest fluorochromem na zielono, a DNA kontrolne na czerwono. Sondę genomową nakłada się na preparat mikroskopowy z chromosomami metafazowymi komórek prawidłowych. Zachodzi hybrydyzacja wzdłuż każdego chromosomu. Metoda ta pozwala na wykrycie duplikacji i delecji w komórkach nowotworowych. Jeżeli jakikolwiek region chromosomu komórki nowotworowej ulegnie duplikacji to odpowiadający mu region na preparacie z chromosomami prawidłowymi będzie hybrydyzował z nadmierną ilością DNA znakowanego na zielono . Inaczej będzie jeżeli jakiś region DNA komórki nowotworowej ulegnie delecji - w tym przypadku odpowiadajacy mu obszar chromosomu na preparacie będzie hybrydyzował z DNA referencyjnym, znakowanym na zielono. W miejscach chromosomów, w których sekwencje DNA z komórek nowotworowych i kontrolnych nie różnią się, z równą częstością hybrydyzuje DNA wyznakowany na zielono jak i na czerwono, dając w konsekwencji wypadkowy kolor żółty. Obraz rejestrowany jest przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i sprzężonego programu komputerowego oceniajacego wzór hybrydyzacyjny jako stosunek sygnałów zielonych (badanego DNA) do czerwonych (kontrolnego DNA). Jeśli stosunek ten jest >1 to występuje duplikacja, jeśli stosunek ten jest <1 to stwierdza się delecję, a jeśli stosunek ten = 1 to nie ma różnic w sekwencjach DNA w obu komórkach..
Zaletą metody CGH jest możliwość analizy aberracji w obrębie wszystkich chromosomów wykonując pojedynczą hybrydyzację. Wadą jest z kolei ograniczenie się wyłącznie do aberracji niezrównoważonych czyli do delecji i duplikacji. Metoda ta pozwala na wykrycie delecji i duplikacji nie mniejszych niż 10 mln pz czyli rozdzielczość nie jest zbyt wysoka
d/ Modyfikacja CGH doprowadziła w ostatnich latach wprowadza mikromacierze (mikroczipy, microarray) do konwencjonalnej metody CGH (microarray CGH). W metodzie tej miejsce metafazowych chromosomów zajmują sklonowane na wektorach bakteryjnych (BACs) fragmenty DNA poszczególnych prawidłowych chromosomów lub cDNA, które unieruchomione są na płytce szklanej (microarray). Każdy chromosom zawarty jest w określonej liczbie klonów BACs i zajmuje określoną liczbę miejsc na mikromacierzy. Płytka może zawierać 2500 miejsc. Sondą molekularną jest sonda genomowa taka , jak w metodzie CGH, w której testowany DNA wyznakowany jest na zielono a kontrolny na czerwono. Każdy prawidłowy chromosom ma swój hybrydyzacyjny wzór opracowany na podstawie stosunku sygnałów zielonych i czerwonych, a odchylenia od tego wzoru po hybrydyzacji sondy genomowej pozwalają na ilościową interpretację różnic w liczbie kopii między genomem badanym a kontrolnym. Jeśli stosunek ten jest>.1 to stwierdza się duplikację z wyliczeniem liczby kopii, jeśli stosunek ten jest<1 to występuje delecja a jeśli stosunek ten = 1 to nie ma zmian ilościowych sekwencji między badanym a testowanym DNA. W metodzie tej rozdzielczość determinowana jest przez odległość między kolejnymi klonami oraz wielkością sklonowanego fragmentu DNA i mieści się w granicach 40 kpz. - 5mln pz.. Zaletą tej metody jest szybkie wykrywanie aberracji niezrównoważonych w pojedynczej analizie z wyższą rozdzielczością niż konwencjonalna CGH. Możliwe jest też wykrywanie translokacji fragmentów między chromosomami przy użyciu specjalnie konstruowanych mikromacierzy z uwzględnieniem punktów złamań chromosomów
Metoda ta jest ciągle na etapie testowania, modyfikowania i konstruowania mikromacierzy CGH dla całego genomu człowieka oraz mikromacierzy specyficznych dla każdego chromosomu. W najbliższej przyszłości przewiduje się kompletną charakterystykę 32 000 klonów na wektorach BACs obejmujących cały ludzki DNA.
e/ Kolejną odmianą metody FISH jest technika fiber FISH wykorzystująca chemiczne i fizyczne działania, które rozluźniają i prostują włókna chromatynynowe w chromosomach interfazowych tak, że obrazowane mogą być pojedyncze pętle DNA. Efekt prostowania włókna chromatynowego uzyskać można przez łagodną lizę komórek poddawanych działaniu wysokich stężeń soli, zasad lub detergentów. Uzyskuje się w ten sposób tzw, preparaty „halo”, w których widoczne są pętle DNA w postaci „halo” otaczającego matrix jądrowe . Podobny efekt otrzymuje się przez mechaniczne rozciąganie nici DNA znajdującej się początkowo w żelu agarozowym, a następnie uwolnionej z żelu promieniowaniem mikrofalowym. Techniką tą można odróżnić punkty hybrydyzacyjne dwóch sond leżących od siebie w odległości kilku kpz. Technika fiber FISH znajduje zastosowanie przede wszystkim do precyzyjnego fizycznego mapowania badanych sekwencji DNA lub loci znajdujących się blisko siebie. Oznacza to ustalenie wzajemnej lokalizacji i fizyczną ocenę odległości pomiędzy różnymi sekwencjami.
Podsumowując; wyżej opisane techniki cytogenetyki molekularnej rozwinęły się z cytogenetyki klasycznej przez włączenie nowoczesnych technik molekularnych i zastosowania barwników fluorescencyjnych. Wyróżnić można 3 główne modyfikacje fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w zależności od „podłoża” hybrydyzacyjnego:
metafazowe FISH
interfazowe FISH
porównawcza hybrydyzacja genomów CGH
Z analizy rozdzielczości uzyskanej w metodach cytogenetycznych klasycznych i molekularnych wynika:
- podstawowe barwienie chromosomów pozwala na rozpoznanie aberracji o wielkości około 10 mln pz
- metoda HRT daje wyższą rozdzielczość około 5 mln pz
- metoda FISH stosowana na chromosomach metafazowych daje rozdzielczość około 2 mln pz
- metoda FISH stosowana na komórkach interfazowych daje rozdzielczość między 1mln pz
- metoda fiber FISH na rozluźnionym włóknie chromatynowym zwiększa rozdzielczość w granicach 25 - 250 kpz
- rozdzielczość w metodzie CGH jest stosunkowo niska , pozwala bowiem na określenie np. delecji w granicach 10 mln pz,
- microarray CGH daje rozdzielczość 40kpz - 5 mln pz
III. Cytometria przepływowa
Analiza chromosomów w cytometrze przepływowym polega na ocenie zawartości DNA lub stosunku par zasad AT/GC w poszczególnych chromosomach. Oceny tej dokonuje się na podstawie pomiarów intensywnosci fluorecsencji chromosomów metafazowych zabarwionych fluorochromem. Chromosomy są sortowane, identyfikowane a następnie przepuszczane przez wiązkę laserową wzbudzającą fluorescencję. Sprzężenie cytometru z komputerem daje wydruk względnej fluorescencji na podstawie analizy kilkudziesięciu do kilkuset tysięcy chromosomów w ciągu 10-20 minut
Technika ta stosowana jest do wykrywania aberracji liczbowych i tych strukturalnych, które manifestują się zmiana ilościową zawartością DNA w chromosomach (np.delecji)
Możliwość sortowania i identyfikacji chromosomów w cytometrze przepływowym znajduje zastosowanie przede wszystkim do sporządzania bibliotek fragmentów DNA, specyficznych dla poszczególnych chromosomów.
Przykłady zespołów chorobowych uwarunkowanych mikrodelecjami.
Mikrodelecje to podtyp delecji chromosomów, które można zidentyfikować metodą FISH lub czasem metodą prążkową o wyższej rozdzielczości HRT. Ponieważ te nieprawidłowości obejmują delecje całej serii sąsiadujących genów, są nazywane również zespołami genów przyległych (sąsiadujących) np.:
Zespół Pradera-Willego uwarunkowany jest mikrodelecją w regionie q11-q13 chromosomu 15. Fragment DNA, który ulega delecji, czyli region krytyczny zawiera kilka genów aktywnych wyłącznie na chromosomie 15 odziedziczonym od ojca, natomiast homologiczne geny na chromosomie matczynym są nieaktywne. Zespół ten wystąpi więc wtedy, gdy potomek odziedziczy tą delecję od ojca, jak również wtedy, gdy obie kopie chromosomu 15 będą pochodziły od matki, ponieważ w rejonie krytycznym nie będzie aktywnych genów pochodzących od ojca, nie będzie produktów genowych i pojawi się choroba.
Objawy zespołu: łagodne upośledzenie umysłowe, niski wzrost, otyłość,
charakterystyczne rysy twarzy, migdałowate szpary powiekowe, wąskie skronia, jasna
karnacja, obniżone napięcie mięśni.
Zespół Angelmana uwarunkowany jest mikrodelecją tego samego regionu q11-q13 w chromosomie 15, jak w zespole Pradera-Willego. Zespół ten uwarunkowany jest jednym genem, który aktywny jest wyłącznie na chromosomie pochodzącym od matki. Objawy zespołu Angelmana wystąpią więc wtedy, gdy delecja dziedziczona będzie od matki, jak również wtedy, gdy obie kopie chromosomu 15 pochodzić będą od ojca, ponieważ w rejonie krytycznym nie będzie aktywnego genu zlokalizowane go w chromosomie matczynym.
Objawy choroby: poważne upośledzenie umysłowe, napady padaczkowe, napady śmiechu.
Omówione wyżej dwa zespoły są przykładem zjawiska, które określa się imprintingiem genomowym uwarunkowanym ekspresją niektórych genów w zależności od tego, czy są dziedziczone od matki czy od ojca.
Jakie jest odniesienie imprintingu genomowego do podstawowych praw Mendla?
Zespół Williamsa uwarunkowany jest mikrodelecją w rejonie q11.2 chromosomu 7. W regionie krytycznym zidentyfikowano kilkanaście genów odpowiedzialnych za chorobę , między innymi gen kodujący elastynę.
Objawy choroby: zaburzenia rozwojowe, wady serca, wydatne policzki i usta, twarz
elfa, upośledzenie umysłowe
Zespół di George uwarunkowany jest mikrodelecją rejonu q11.2 chromosomu 22.
Objawy choroby: wąska twarz, rozszczep podniebienia, anomalie serca
9