Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie nr 7

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA TŁUSZCZÓW

Magdalena Dudek

Paulina Ziółczyk

Wydział: Biotechnologii i Nauk o Żywności

Kierunek: Biotechnologia

Rok: III

gr. V

1. Wprowadzenie

Tłuszcze naturalne są mieszaniną różnych lipidów. Podstawowym składnikiem tłuszczy są triacyloglicerole, decydujące o wartości żywieniowej
i przydatności surowca w przemyśle. W organizmach żywych tłuszcze ulegają najpierw hydrolizie do podstawowych czynników, którymi dla triacylogliceroli są glicerol i wolne kwasy tłuszczowe.

Produktami hydrolizy mogą być: diacyloglicerole, monoacyloglicerole, kwasy tłuszczowe i glicerol.

Hydroliza triacylogliceroli zachodzi z udziałem lipaz EC 3.1.1.3- enzymów należących do hydrolaz (acylohydrolazy triacylogliceroli). Lipazy występują powszechnie
w tkankach zwierzęcych (wątroba i trzustka), roślinnych oraz
w drobnoustrojach.

Enzymatyczna hydroliza tłuszczy przebiega najszybciej po zhomogenizowaniu mieszaniny tłuszczu i lipaz. Jest to spowodowane zwiększeniem powierzchni granicy faz czyli powierzchni na której zachodzi hydroliza.

Lipazy wykorzystuje się w wielu gałęziach przemysłu, głównie jako środek usuwający tłuszcz np. w przemysłach: skórzanym, jedwabniczym, wełnianym, w proszkach do prania, środkach oczyszczania ścieków oraz
w przemyśle mleczarskim do poprawiania smaku i aromatu końcowych produktów.

Lipazy mają również działania niepożądane, mogą powodować jełczenie produktów zbożowych i tłuszczowych. Proces jełczenia jest wynikiem działania lipaz i lipooksygenaz katalizujących utlenianie uwolnionych przez lipazy kwasów tłuszczowych.

2. Wykonanie ćwiczenia

1. Przygotowanie preparatu lipazy z trzustki:

Do przygotowania preparatu lipazy rozpuściłyśmy tabletkę zawierającą lipazy
w 20 cm3 0,1M buforu fosforanowego o pH 7.

2. Przygotowanie emulsji oleju:

30 cm³ 2%-owego wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego zmieszałyśmy
z 20 cm³ oleju i homogenizowaliśmy 5 minut. Uzyskaną emulsję używałyśmy do dalszych reakcji.

3. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i przeprowadzenie reakcji:

W erlenmayerkach o pojemności 100cm3 przygotowałyśmy następujące próby
z zachowaniem kolejności dodawania substratów:

1. 2 próby właściwe:

5 cm³ emulsji oleju

4 cm³ buforu

1 cm³ preparatu lipaz

Po 30 minutach (pierwsza próba) i po 60 minutach (druga próba) inkubacji
w temperaturze 37^oC dodaliśmy po 10 cm³ etanolu

2. Próbę kontrolną:

5 cm³ emulsji oleju

4 cm³ buforu

10 cm³ etanolu

1 cm³ preparatu lipaz

Tak przygotowane mieszaniny miareczkowałyśmy 0,05 M NaOH wobec fenoloftaleiny do różowego zabarwienia.

3. Wyniki

Substrat	Próba kontrolna [ml]	V30' [ml]	V60' [ml]	ΔV30' [ml]	ΔV60' [ml]	AL 30' [U/ml]	AL 60' [U/ml]
olej rzepakowy	5,5	10,2	13	4,7	7,5	7,83	6,25
olej kukurydziany	5,5 // 6,2	7,6 // 8,0	8,4 // 8,9	1,95	2,8	3,25	2.33
olej ryżowy	3,3 // 3,4	7,2	9,0	3,85	5,65	6,42	4,71
olej sojowy	4,5	6,5 // 6,6	7,5 // 7,6	2,05	3,05	3,42	2,54





Olej sojowy

A_L30 = ((6,55-4,5)*50)/30=3,42

A_L30 = ((7,55-4,5)*50)/60=2,54

Wnioski:

Aktywność lipazy zmniejsza się wraz z przebiegiem reakcji. Jest to wynikiem zwiększania się stężenia wolnych kwasów, a co za tym idzie zmniejsza się pH, co wpływa na zmniejszenie aktywności lipazy.

4. Oznaczenie zawartości α-amylaz w przygotowanym preparacie

1. Wykonanie oznaczenia:

Do dwóch probówek wprowadziliśmy po 5 ml 1% skrobi, następnie do pierwszej probówki wprowadziliśmy 3 krople preparatu enzymatycznego, do drugiej probówki wprowadziłyśmy 3 krople wody. Próby pozostawiłyśmy w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po tym czasie do obu probówek dodałyśmy kilka kropel roztworu J₂ w KJ.

2. Obserwacje:

Roztwór w pierwszej probówce po dodaniu roztworu jodu pozostaje bezbarwny, a druga próba po dodaniu roztworu jodu zabarwia się na granatowo.

Wnioski:

W pierwszej próbie α-amylazy zawarte w preparacie enzymatycznym rozłożyły skrobię, czego dowodzi brak granatowego zabarwienia po dodaniu roztworu jodu. Natomiast w próbie kontrolnej skrobia nie została rozłożona i z jodem dała wynik pozytywny. Zatem badany preparat enzymatyczny zawierał α-amylazy.

5. Oznaczenie zawartości proteinaz w przygotowanym preparacie

1. Wykonanie oznaczenia:

Do dwóch probówek wprowadziłyśmy po 2 ml 2% kazeiny, następnie do pierwszej probówki wprowadziłyśmy 1 ml preparatu enzymatycznego, do drugiej dodałyśmy 1 ml wody. Próby pozostawiliśmy w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po tym czasie do obu probówek dodałyśmy po 4 ml 5% TCA.

2. Obserwacje:

Po dodaniu do próby zawierającej preparat enzymatyczny TCA w probówce znajdował się biały, drobny i pylisty osad. W próbie kontrolnej biały osad również się pojawił ale był gęsty
i serowaty.

Wnioski:

W probówce zawierającym preparat enzymatyczny nastąpiło niemal całkowite rozłożenie kazeiny, czego dowodem jest brak serowatego osadu po dodaniu TCA. Zatem badany preparat enzymatyczny zawierał proteinazy.

6. Wnioski

Lipaza jest enzymem rozkładającym tłuszcze, którego aktywność maleje wraz z przebiegiem reakcji i zmniejszaniem się pH. Oprócz lipazy badana tabletka zawierała α-amylazy rozkładające skrobię oraz proteinazy hydrolizujące wiązania peptydowe.

---