Biotechnologia.
1953 - poznanie struktury podwójnej helisy DNA, Watson, Crick
1966 - złamanie kodu genetycznego Khorana, Nierenberg
1973 - opracowanie technik rekombinacji DNA; 1960 - Amber: enzymy restrykcyjne; 1971 - Cohen: import plazmidów do E. coli
Klonowanie genu
1973 - kongres w New Hampshire poświecony kwasom nukleinowym
1974 - „moratorium”, apel o zaprzestanie badań, spowolnienie badań
1975 - sekwencjonowanie DNA, metoda Maama - Gilbetra (chemicznej degradacji DNA), metoda Sangera (didoeksy), nadal stosowana
ETAP I: 1953 - 1972: 3 tys. badaczy
ETAP II: 1073 - : 300 tys. badaczy
Biotechnologia zastosowanie technologiczne , które używa systemów biologicznych, organizmów żywych lub ich składników, żeby wytwarzac lub modyfikowac produkty lub procesy w określonym zastosowaniu.
Pierwszy produkt: INSULINA
Leczenie cukrzycy, wcześniej insulina świńska i bydlęca, problem z intronami (bakteria nie mają intronó, fragmentów niekodujących) chemiczna synteza sekwencji kodującej lub odwrotna transkrypcja:
Dojrzały mRNA insulina odrwotna transkrypcja, powstaje cDNA plazmid bakteria, transkrypcja, translacja insulina
Drugi produkt: LUDZKI HORMON WZROSTU Hgh
Leczenie karłowatości 1959, wcześniej pobierany od zmarłych, ale powodował chorobę Creutzfelda - Jacoba, więc zabroniono.
Rodzaje biotechnologii:
Zielona: rolnictwo, wykorzystanie spożywcze i niespożywcze, GMO
Czerwona: służba zdrowia
produkcja przemysłowa, ochrona środowiska
Fioletowa: zagadnienia społeczne i prawne
Niebieska: biotechnologia wód
Gmo, ORGANIZMY MODYFIKOWANE GENETYCZNIE
Organizm niosący obcy gen pochodzący od organizmu odległego filogenetycznie.
Metody:
Transfekcja z użyciem zrekombinowanych wektorów (rośliny)
Biolistyka (rośliny)
Mikroiniekcja do przedjądrza (zwierzęta)
Użycie pierwotnych komórek zarodkowych (zwierzęta)
Klonowanie somatyczne (zwierzęta)
Przykłady:
Odpornośc na szkodniki
Toksyna BT: zabija szkodniki, odkłada się w roślinie i w glebie, produkowane przez bakterie Bacillus thuringiensis. Owad ginie przez uszkodzenie jelita, na człowieka nie działa. Wklonowana w genom komórek roślinnych: kukurydza Bt (dopuszczona w UE), ziemniaki Bt, bawełna Bt… dobrze zabija omacnicę prosowiankę (os trinia nubilalis)
Poprawa cech jakościowych
Pomidor Flavr Savr 1994r. dobry pomidor, produkuje poligalakturonaza (PG), co sprawia, że jest miękki. Gen PG o odwrotnej orientacji powoduje opóźnienie dojrzewania.
Zatrzymanie psucia: hamowanie syntezy etylenu
Mała czarna bezkofeinowa: wyciszenie ekspresji synteza teobroninowej, do 70% mniej kofeiny w kawie
Złoty ryż (o złocistym kolorze): niedobór witaminy A u Azjatów, gen żonkila - beta-karoten
Odpornośc na herbicydy, rośliny „Roundup Ready” - odporne na glifosat
Gen EPSPS synteza enolopirogronianoszikiniano - 3 - fosforanu
Gen GAT N - acetylotransferaza glifosanu
Gen GOX oksydoreduktaza glifosatu
Szczepionki drogą pokarmową
Mobilizacja układu odpornościowego bez kontaktu z patogenem, 10 - 100 razy mniejszy koszt; w Poznaniu wyprodukowano sałatę szczepiącą na WZW B
Odpornośc na niekorzystne warunki środowiska , na: mróz, wysoką temperaturę, zasolenie, suszę, zanieczyszczenie środowiska (zwłaszcza metalami ciężkimi)
Zwierząta GMO
Modele chorób człowieka, modele do testowania nowych metod leczenia, zmiany jakościowe produktów spożywczych:
Wydajnośc i jakośc mleka: wprowadzenie genów białęk beta - k - kazeiny
Przyrost i jakośc wełny (toksyczna dla moli, niekurcząca się w praniu)
Zwiększenieodporności na choroby i pasożyty, priony
Polepszenie trawienia i metabolizmu
Szybsze rozmnażanie
Zwierzęca bioreaktory: krowa, owca, koza.
Produkty wydzielane do mleka, np.: antytrombina (kontrola powstawania zakrzepów), antytrypsyna (rozedma płuc), erytropoetyna (anemia).
PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE
Budowa przeciwciała.
Przeciwciała monoklonalne: wykazują jednakową swoistośc względem danego epitopu. Otrzymywane przez fuzję limfocytów B o żądanej swoistości z komórkami szpiczaka.
Pobranie limfocytów B z trzustki myszy + szpiczak = komórka hybrydowa = kładziemy 1 komórkę na szalce ona produkuje przeciwciała. Podłoże trzeba dac takie, żeby przeżyły tylko komórki hybrydowe. Komórki szpiczaka muzą być tak uszkodzone, żeby nie produkowały jakiegoś enzymu ważnego dla życia.
Nazewnictwo:
tu - przeciw guzom
mo - mysie
xi - chimeryczne
zu - humanizowane
mab - monoklonalne
zastosowanie:
diagnostyka i terapia nowotworów
immunosupresja w transplantologii
immunosupresja w chorobach o podłożu zapalnym
blokowanie krzepnięcia krwi
neutralizacja toksyn
mab jest rozpoznawany jako obce białko, 2 - 3 tyg po podaniu produkcja HAMA, ale produkuja przeciwciała: chimeryczne (mysie 30 - 35%), humanizowane (mysie regiony hiperzmienne 10%)
TERAPIA GENOWA
Leczenie przyczyn chorób genetycznych.
Mutacje recesywne: 1. komplementacja defektu genetycznego
Mutacje dominujące: 2. hamowanie ekspresji zmutowanego genu oraz 3. naprawa mutacji.
Wprowadzenie genu prawidłowego, retrowirusy, lentiwirusy; in vivo (wprost do organizmu) lub ex vivo (pobranie komórki pacjenta, namnożenie, modyfikacj genetyczna, wprowadzenie do organizmu pacjenta
Antysensy: 20 - 30 nukleotydowe cząsteczki DNA i RNA, komplementarne do mRNA, sekwencji DNA genu, jego promotora
Trwała, nieznany mechanizm molekularny, naprawa błędnie sparowanych zasad przez wycinanie nukleotydów, rekombinacja homologiczna
Eliminacja komórek : komórki nowotworowe, zainfekowane wirusami. Metody:
Bezpośrednio: wprowadzenie genu samobójczego, proapoptotycznego, z toksycznymi białkami
Pośrednio: pobudzenie układu odpornościowego
Zahamowanie unaczynienia nowotworu.
Efekt sąsiadującej komórki.
Nośniki transgenów: wirusowe TRANSDUKCJA: adeno - retro - lenti - wirusy, AAV, np. wirus opryszczki; niewirusowe TRANSFEKCJA
CZYNNIKI MUTAGENE
Mutageny: czynniki indukujące powstawanie mutacji ponad poziom mutacji spontanicznych.
MUTAGENY FIZYCZNE np. promieniowanie X, gamma, kosmiczne, UVA, UVB, jonizujące (działa na komórki szybko dzielące się: szpik kostny, nabłonek przewodu pokarmowego, nabłonek plemnikotwórczy; indukuje powstawanie w komórkach nadtlenków, np. H2O2, rodnika hydroksylowego w wyniku radiolizy wody), niejonizujące.
Skutki narażenia na promieniowanie jonizujące:
Uszkodzenie wiązań fosfodiestrowych, pęknięcia jedno- i dwuniciowe DNA, aberracje strukturalne chromosomów
Modyfikacje zasad azotowych
Uszkodzenia pentozy,
Powstawanie wiązań krzyżowych w DNA,
Powstawanie wiązań krzyżowych między białkami a białkami DNA
Promieniowanie UV, najgorze 260 nm, indukuje powstawanie dimerów pirymidynowych, głównie tymidynowych. Zatrzymuje wiązania nukleotydów przez polimerazę DNA do nowo syntetyzowanego łańcucha, powstają mutacje typu tranzycji i trans wersji. Dimeryzacja pirymidyn wywołana przez UV powoduje tez delecję nukleotydów podczas kopiowania zmodyfikowanej nici.
MUTAGENY CHEMICZNE
Analogi zasad purynowych i pirymidynowych włączone do nukleotydów i do DNA podczas replikacji, tworzą parę z innymi zasadami, mutacje tranzycji
Czynniki interkalujące - barwniki akrydynowe, płaskie cząsteczki kilku pierścieni, wnikają między pary zasad azotowych w łańcuchu DNA, zwiększając odległośc między sąsiednimi parami zasad. Powodują `poślizg” polimerazy Dna podczas replikacji, indukują mutacje typu insercji i delecji, co prowadzi do zmiany ramki odczytu.
Związki alkilujące - wprowadzają gruoy alkilowe do puryn. Skutek: tranzycie, transwersje. Produkt: fosfodiestry. Hydroliza wytworzonych nietrwałych wiązań może doprowadzic do przerwania łańcucha DNA. Są to też leki antynowotworowe.
CYKL KOMÓRKOWY
Zaburzenia G1 S przyczyną transformacji nowotworowych.
G0 - spoczynkowa
G1 - najdłuższa, 10 - 12h
S - synteza, replikacja DNA 8h
G2 - 6 - 8h
M - mitoza 0,5 - 1h
Białka przyspieszające cykl komórkowy: cykliny + kinazy cyklino zależne, działają razem, komplet
Białka hamujące, (geny supresorowe), antyonkogeny: Rb, P53, P16
G1/S, G2/M i w obrębie M są `punkty kontrolne”, punkty restrykcyjne.
Kompleksy 4 składnikowe:
Cyklina (inna w każdej fazie: G1 cyklina D, N)
Kinaza cyklino zależna
PCNA białko antygen poliforujący
P21 białko
Inne białka: c - Myc, p 27
Udział w regulacji ma TGF - beta
Czynnik E2F - czynnik transkrypcyjny, przyłącza się do DNA w jądrze
Geny syp resorowe G1
p53 - działa pośrednio na cykl, „strażnik genomu”
Jak zadziała czynnik genotoksyczny, to p53 pobudza transkrypcję genu kodującego p21, który hamuje cykl komórkowy, zwłaszcza w S, aby naprawic uszkodzenie.
Aktywacja szlaku apoptozy.
Rb - regulacja fazy G1/S. na chromosomie 13q14
Białko 928AA, Białko 105 - 110kDa - regulacja ekspresji czynników transkrypcyjnych G1, promocja różnicowania komórek G0; jego mutacja: siatkówczak dziedziczny (nowotwór gałki ocznej)
Gen p16INK - 4A (CDKN2; MTS1) na chromosomie 9p21 białko p16, białko 148AA hamowanie aktywności kompleksu kinazowego: cdk4 - cyklinaD (G1); cdk6 - cyklina D (G1)
Gen p21WAF1 nachromosomie 6p21.1 białko p21, 164AA, 18.1 kDa hamowanie aktywności kompleksu kinazowego: cdk4 - cyklina D (G1); dk6 - cyklina E (G1); cdk2 - cyklina E (G1/S); cdk2 - cyklina A (S); cdk1 (cdk2) - cyklina B (G2/M); inhibitor PCNA (S)
Gen CCND1/ PRAD1 na chromosomie 11q13 cyklina D1, 295AA, 36kDa aktywacja cdk4, cdk6 (G1), (podjednostka regulatorowa)
Gen p53 na chromosomie 17p13.1 białko p53 kontrola regulacji cyklu komórkowego (modulacja ekspresji genów WAF1, GADD45, MDM2), (G1)
Białko 393AA, 53 kDa kontrola naprawy DNA (akumulacja prawidłowego p53) (G1); inicjacja procesu apoptozy (wzrost ekspresji genu Bax) (G1)
Wirusowe białka onkogenne tworzące kompleksy z p52 i pRb:
p53 |
Duży antygen T wirusa SV40 |
pRB |
Białko E6 |
Ludzkie wirusy Papillona |
Białko E7 |
Białko E1B |
Adenowirusy |
Białko E2B |
Ludzki wirus Papillona powoduje: brodawki na szyi starszych ludzi oraz raka szyjki macicy. Mutacja p53 jest w większości nowotworów (w tkance guza).
Zespół Lee - Frauneni - dziedziczenie mutacji p53, dziedziczne nowotwory (predyspozycja do nowotworu).
Aktywnośc:
G1 |
Cyklina D |
cdk 4 |
G1/S |
Cyklina E |
cdk2 |
S |
Cyklina A |
cdk 2 |
G2/M |
Cyklina A |
cdk 1 (cdk2) - fosforyzuje histon H1 |
G2/M |
Cyklina B |
cdk 1 (cdk 2) - fosforyzuje resztę serynową L - aminy; rozpad otoczki jądrowej i fosforylacja wrzeciona kariokinetycznego |
Antygeny politeracyjne, białko PCNA: niehistonowe białko jądrowe, jednostka pomocnicza polimerazy DNA delta (replikacja) i polimerazy DNA elipsa (naprawa uszkodzonego DNA)
NER - naprawa przez wycinanie nukleotydów; BER - naprawa przez wycinanie zasad azotowych; MMr - naprawa błędnie sparowanych zasad
Dwie frakcje, udział w regulacji cyklu, jest w kompleksie czteroskładnikowym. Czas biologicznego półtrwania 8 - 20 h (długo!)
Ki - 67 (MIB1)
Niehistaminowe białko jądrowe
Z dwóch podjednostek
Dystrybucja zależna od fazy cyklu
Wzrost poziomu ekspresji w fazie S
Czas biologiczngo półtrwania 1h
Niewykrywane w G0
Udział w metabolizmie rRNA jako element gęstego składnika firbylarnego jąderka
MCM; MCM2 - 7
Hydrofilowe białka jądrowe
Wysoki stopień homologii sekwencji aminokwasowej pomiędzy białkami S. cerevisiae człowieka
Kompleksy: heksamery: MCM2 - MCM3 - MCM4 - MCM5 - MCM6 - MCM7; tetramery: MCM2 - MCM4 - MCM6 - MCM7; dimery: MCM3 - MCM4
Dwie frakcje
Fosforylacja przy udziale kinaz cyklino zależnych cdk
Udział w inicjacji replikacji DNA (formowanie kompleksu prereplikacyjnego)
Udział w elongacji replikacji DNA
Nowotwór złośliwy można obecnie określic jako jako wynik akumulacji błędów genetycznych w komórce prawidłowej, która przestaje podlegac normalnym mechanizmom kontrolującym wzrost i różnicowanie komórek. W chorobie nowotworowej uszkodzenie DNA (delecje, translokacje, amplifikacje, insercje, mutacje punktowe) dotyczą genów zaangażowanych w kontrolę wzrostu i/lub różnicowania komórkowego. Karcinogeneza jest procesem wieloetapowym, który poprzedza inicjacja transformacji na poziomie komórkowym, efektem jest pełne rozregulowanie aparatu genetycznego, mechanizmów homeostazy i zniszczenie całego organizmu. Przyjmując wieloetapowy charakter karcinogenezy uznajemy, że pojedyncze onkogeny nie wystarczają do wywołania pełnej transformacji nowotworowej. Podstawowe znaczenie w transformacji nowotworowej ma inaktywacja genów supresorowych i aktywacja onkogenów. Potoonkogeny - geny ulegające ekspresji w komórkach prawidłowych i spełniające podstawową rolę w regulacji procesów wzrostu, różnicowania i dojrzewania komórek. Stają się onkogenami na skutek przynajmniej punktowej zmiany sekwencji DNA. Komórkowe protoonkogeny mają stałą lokalizację w chromosomach 1% wszystkich genów. Występują w haploidalnym genomie w pojedynczych kopiach. Istnieje duża homologia DNA do onkogenów komórkowych z sekwencjami onkogennych retrowirusów. Jednak wirusowe onkogeny nie posiadają intronów.
3 mld par zasad, 98% introny (części niekodujące).
mutacja mutacja aktywująca
inaktywująca
infekcja i wbudowanie do DNA
Rak - nowotwór z komórki nabłonkowej, np. rak tarczycy
Mięsak - z komórki mezenchymalnych, np., mięsak kości
Gruczolakolak - z komórki gruczołowej, np. jelita
Przerzuty: drogą krwi lub naczyń chłonnych
Mechanizm aktywacji protoonkogenów:
Mutacja punktowa
Amplifikacja
Translokacja
Insercja
Mutacja punktowa w obrębie protoonkogenu powoduje zmianę informacji dotyczącą kodowanie białek. Zmienione białko może indukowac jedną lub więcej zmian związanych z rozwojem nowotworu. Amplifikacja polega na zwielokrotnieniu liczby kopii genów. Liczba kopii niektórych genów w nowotworach wynosi kilka, kilkadziesiąt, a nawet ponad 100 kopii genu. Translokacja polega na przemieszczeniu protoonkogenu w miejsce chromosomowe objęte działaniem regulacji ekspresji innego genu (np. immunoglobuliny). Ten typ aktywacji występuje np. w szpiczaku. Translokacje w tych typach nowotworów są swoiste. Insercja polega na wbudowaniu w rejon poprzedzający protoonkogen lub niekiedy również w rejon przylegający do końca, silnych sygnałów transkrypcyjnych typu promotorów lub tzw. Sekwencji wzmacniającej transkrypcję.
Onkoproteiny, kodowane przez onkogen: jądrowe lub cytoplazmatyczne.
Na podstawie lokalizacji oraz strukturalnych i czynnościowych właściwości białowych produktów onkogenów dokonano podziału na:
Czynniki wzrostu
Białka receptorowe Inie receptorowe wykazujące aktywnośc kinazy tyrozynowej
Cytoplazmatyczne receptory
Białka receptorowe, którym brak aktywności kinaz
Biała G związane z błoną cytoplazmatyczną
Białka wykazujące aktywnośc kinazy serynowej
Białka biorące udział w transkrypcji
Biologiczne funkcje wybranych komórkowych protoonkogenów.
Mutacja - każda zmiana w materiale genetycznym, kótra jest utrwalona i przekazywana pokolenia na pokolenie, która występuje ponad poziom mutacji spontanicznych. Zachodzą na poziomach:
Genowe - mutacje punktowe
Chromosomowe - aberracje chromosomowe, liczbowe i strukturalne
Genomowe - zwielokrotnienie haploidalnego zestawu chromosomów
Ze względu na powstawanie wyróżniamy:
Spontaniczne - błędy w replikacji, które wymykają się spod kontroli mechanizmów korekcyjnych polimeraz DNA syntetyzujących nowe łańcuchy polinukleotydowe. Spowodowane: błędami podczas replikacji lub samorzutną modyfikacją chemiczną zasad azotowych;
Indukowane - powstają w wyniku oddziaływania mutagenu na DNA. Pomiędzy mutacjami spontanicznymi a indukowanymi nie ma różnic jakościowych.
Utrwalone - zmiany w Dna mające inną niż wyjściowa sekwencję.
Mutacje genowe:
Delecja - utrata par zasad (kilku) do łańcucha DNA
Insercja (addycja) - wstawienie 1 lub kilku par zasad do łańcucha DNA
Tranzycja - zamiana zasady purynowej na inną purynę(A G) lub pirymidynowej na Iną pirymidynę (T C)
Trans wersja - zamiana purynu na pirymidyną lub pirymidyny na purynę
We wszystkich typach mutacji mogą zajśc mutacje wsteczne:
Mutacja wsteczna
GEN DZIKI GEN ZMUTOWANY
Mutacja punktowa
TEST AMESA: bakteria Salmonella typhimunum bez operonu histydynowego. Struktura genu eukariotycznego.
Efekty mutacji genomu:
Cicha: wszystkie zmiany zachodzące w DNA w intronach i nieregulatorowych regionach DNA. 97% ludzkiego enomu może ulec mutacji bez wpływu na jego funkcjonowanie
Synonimiczna: w 3. Zasadzie kodonu, nowy kodon koduje ten sam aminokwas, co kodon przed mutacją. Zamiana synonimiczna jest mutacja cichą, bo nie ma wpływu na kodującą frakcję genomu
Niesynonimiczna: zmiany sensu - powstaje nowy kodon, kodujący nowy aminokwas, powstające białko będzie miało inny 1 aminokwas.
Nonsens: kodon kodujący zmienia się na kodn terminacyjny stop (UAA, UAG, UGA). Powstaje skrócone białko.
Ominięcie kodonu terminacyjnego: mutacja zmienia kodon stop n taki, który koduje aminokwas, powstające białko jest wydłużone o dalsze aminokwasy na końcu C.
Skutki delecji i insercji: Jeżeli liczba usuniętych lub wstawionych nukleotydów wynosi 3 lub wielokrotnośc 3 - usunięcie lub wstawienie 1 lub większej liczby kodonów. Jeżeli liczba nie jest równa 3, 6, 9,… - przesunięcie ramki odczytu. Wszystkie kodony poniżej miejsca mutacje będą odczytywane..........
Aberracje chromosomowe: wszelkie zmiany w liczbie i strukturze chromosomów. Mogą być dziedziczne lub powstawac de novo:
Liczbowe:
Aneuploidzie - zestaw chromosomów, których liczba nie stanowi wielokrotności liczby haploidalnej, np. 47, XX, +21. Przyczyna: nierozdzielenie się chromosomów komórkowych (nondysjunkcja) podczas mejozy. Częściej w oogenezie niż spermatogenezie. W nondysjunkcji powstają gamety: disomiczne i nullisomiczne. Nondysjunkcja mitotyczna prowadzi do powstawania mozaikowatości chromosomowej, np. 46, XX / 47, XX, +21
Strukturalne: wywołuje je: promieniowanie jonizujące, czynniki chemiczne. Powstają w fazie G1 lub G0.
Translokacje: zrównoważone i nie
Inwersje para- i pericentryczne
Delecje: terminalne i interstycjalne
Duplikacje
Izochromo somy
Chromosomu dicentryczne
Chromosomy pierścieniowe
Chromatynowe: dotyczą 1 chromatydy, wywołane przez mutageny chemiczne. Powstają w fazie S lub G2.
Mutacje genomowe: euploidie (poliploidie), u człowieka letalne. Liczba chromosomów jest wielokrotnością, u triploidia np. 69, XXY. Zapłodnienie oocytu przez dwa plemniki (dispermia) lub połą dwóch gamet, z których jedna jest diploidalna. Tetraploidia, np. 92, XXYY, brak podziału zygoty.
Komórka ulegająca transformacji
Patoonkogen komórkowy
Gen supresorowy
Onkogen wirusowy
progresja
promocja
inicjacja
Komórka prawidłowa
przerzuty
Nowotwór złośliwy
Nowotwór łagodny
Prekancerogen
Kancerogen bezpośredni
Mutacja DNA
Mutagen, kancerogen
aktywacja
Inaktywacja
Premutagen, prekancerogen
nowotwór
Śmierc komórki
Aberracje chromosomowe
mutacje
apoptoza
niekompletna
kompletna
Naprawa DNA
Zatrzymanie cyklu komórkowego
Czynniki genotoksyczne
Kancerogen „ostateczny”
detoksykacja
Inicjacja procesu nowotworowego
Zaburzenia genetyczne mechanizmów regulacji podziału komórek
Kowalencyjne wiązania z DNA
niekompletna
kompletna
Naprawa DNA