Terapia genowa, wykłady


Terapia genowa

Terapia genowa - Leczenie chorób poprzez przeniesienie materiału genetycznego do komórek organizmu ludzkiego

Może ona dotyczyć zarówno komórek linii zarodkowej, komórek płodu, komórek somatycznych.
Próby leczenia komórek somatycznych organizmu obejmują głównie wrodzone defekty genetyczne, nowotwory, choroby zakaźne.

Wskazania do terapii genowej:
- brak efektywnego leczenia metodami konwencjonalnymi
- choroba pojedynczego genu, który udało się sklonować 
- regulacja genu nie może być precyzyjna
- choroba zagrażająca życiu 

Sposoby transferu genu do komórki docelowej
- precypitacja DNA jonami wapnia
- elektroporacja (szok elektryczny)
- wstrzyknięcie DNA do jądra komórki (mikropipety)
- podanie nagiego („naked”) DNA bezpośrednio do mięśni
- transfer DNA przy użyciu liposomów
- transfer DNA przy użyciu lipidów kationowych
- transfer DNA przy użyciu gąbek protonowych
- transfer DNA opłaszczonego białkami
- wektory wirusowe

Najczęściej stosowane wektory wirusowe zestawiono w tabeli:
0x01 graphic


Do ograniczeń terapii genowej zależą przede wszystkim:

- krótkotrwały charakter terapii genowej - aby terapia genowa stała się uznanym, nieeksperymentalnym sposobem leczenia, DNA wprowadzone do komórek docelowych musi pełnić swą funkcję przez dłuższy okres czasu, a same komórki winny długo żyć i funkcjonować. W terapii substytucyjnej, transgen z trudem i w sposób nieprzewidywalny integruje się z genomem, podziały komórek często znoszą leczniczy efekt transfekcji. Chorzy wymagają powtarzanych kuracji.

- odpowiedź immunologiczna - w typowej terapii in vivo podanie obcych antygenów (DNA, białka nośnika) do tkanek organizmu może wywołać odczyn immunologiczny.

- problemy z nośnikami wirusowymi (toksyczność wirusów, odczyn immunologiczny, łączenie z niewłaściwymi komórkami, brak kontroli ekspresji transgenu).

- wieloczynnikowy charakter większości chorób - tylko nieliczne choroby spowodowane są mutacją pojedynczego genu. Większość chorób ma podłoże wielogenowe i wieloczynnikową patogenezę.

Znana od lat 80 XX wieku terapia genowa jest metodą umożliwiającą leczenie wielu schorzeń na poziomie molekularnym. Aby uzyskać efekt terapeutyczny, do komórek docelowych pacjenta wprowadzany jest preparat genowy zawierający prawidłową kopię genu (najczęściej w postaci cDNA - bezintronowej sekwencji kodującej aminokwasy) lub oligonukleotydy (krótkie fragmenty kwasów nukleinowych - DNA lub RNA).

Wyróżnia się dwa rodzaje terapii genowej: germinalną i somatyczną (tabela 1). Terapia germinalna dotyczy komórek rozrodczych (gamet), z których powstanie nowy organizm lub komórek we wczesnym stadium zarodkowym. Tak wprowadzona zmiana jest dziedziczna tzn. przekazywana komórkom potomnym przy podziałach komórkowych. Natomiast terapia somatyczna polega na wprowadzeniu preparatu genowego do komórek ciała (są nimi wszystkie typy komórek poza gametami). W tym przypadku wprowadzona zmiana nie jest dziedziczna, a leczenie ma charakter zachowawczy tzn. że wprowadzony gen powoduje złagodzenie lub usunięcie objawów choroby, natomiast pierwotny defekt nie jest usuwany i mutacja odpowiedzialna za powstanie choroby pozostaje obecna w DNA wszystkich komórek chorego i może być zgodnie z prawami dziedziczenia przekazywana następnym pokoleniom. Obecnie u ludzi stosowana jest wyłącznie terapia somatyczna. Terapia germinalna jest prawnie zakazana ze względu na aspekty dotyczące bezpieczeństwa oraz aspekty etyczne.

Czym są geny i plazmidy?

Gen to podstawowa fizyczna i funkcjonalna jednostka dziedziczności. Jest to fragment DNA o określonej sekwencji nukleotydów kodujący sekwencję aminokwasów budujących określone białko. Geny oprócz sekwencji kodujących (egzonów) zawierają także sekwencje niekodujące (introny). W terapii genowej ze względu na ograniczenie wielkości wprowadzanego genu wykorzystuje się tzw. cDNA - bezintronową sekwencję kodującą aminokwasy. Metody inżynierii genetycznej umożliwiają wklonowanie cDNA kodującego określony gen do wektora jakim jest plazmidowe DNA (kolista, dwuniciowa cząstka DNA pochodzenia bakteryjnego, występująca w komórce jako element pozachromosomowy zdolny do replikacji niezależnej od replikacji DNA gospodarza). Na wklonowanie insertu (cDNA) do wektora pozwala obecność charakterystycznych sekwencji rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne tzw. miejsce wielokrotnego klonowania (MCS - multiple cloning site). Konstrukt plazmidowy zawiera kasetę ekspresyjną w skład której oprócz cDNA wchodzi także promotor kierujący transkrypcją transgenu oraz sygnał poliadenylacji warunkujący powstanie tzw. „ogonka poliA” będącego ciągiem reszt adeninowych chroniącym powstały transkrypt przed degradacją. Ponadto w skład konstruktu plazmidowego wchodzą: miejsce inicjacji replikacji (ang. ori - origin of replication) umożliwiające namnożenie plazmidu w dużej ilości kopii zarówno w komórkach prokariotycznych jak i eukariotycznych, geny selekcyjne warunkujące odporność na antybiotyki i umożliwiające wyselekcjonowanie bakterii zawierających plazmid (np. Amp® - warunkuje odpornośc na ampicylinę), geny reporterowe np. gfp kodujący białko zielonej fluorescencji (ang. GFP - green fluorescent protein) umożliwiające ocenę poziomu ekspresji wprowadzonego transgenu (rysunek 1). Oprócz wyżej wymienionych elementów, konstrukt może zawierać dodatkowe sekwencje wzmacniające ekspresję transgenu (tzw. enhacery), umożliwiające powstanie kilku białek na matrycy jednego transkryptu np. wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (ang. IRES - internal ribosome entry site) czy kierujące transportem wektora plazmidowego do jądra komórek docelowych np. sygnał lokalizacji jądrowej (ang. NLS - nuclear localization signal). Konstrukcja wektora plazmidowego jest bardzo ważna ponieważ ma bezpośredni wpływ na efektywność ekspresji transgenu. Szczególnie ważne jest wybranie odpowiedniego promotora, ponieważ to on kieruje transkrypcją wklonowanego cDNA kodującego „terapeutyczny gen”. Wyróżniono wiele typów promotorów: umożliwiających stałą i stabilną ekspresję transgenu, wykazujących specyficznośc tkankową (czyli aktywowanych tylko w określonym typie tkanki) lub aktywowanych w określonych warunkach np. w warunkach niedotlenienia. Zastosowanie odpowiedniego promotora umożliwia kierowanie transkrypcją transgenu tak aby efekt terapeutyczny powstał tylko w komórkach docelowych.

Jak wprowadzić „terapeutyczny gen” do komórek?

Preparaty genowe mogą być wprowadzane do komórek docelowych ex vivo (łac. poza organizmem) lub in vivo (łac. w organizmie) (rysunek 2). W przypadku transferu ex vivo komórki pobiera się od pacjenta i hoduje in vitro (łac. w szkle). Następnie przeprowadza się transfekcję i selekcję - wybiera się tylko zmodyfikowane komórki, które zawierają transgen. Tak otrzymane zmodyfikowane genetycznie komórki są wszczepiane do organizmu pacjenta. Jest to metoda sprawdzająca się w przypadku łatwo dostępnych komórek, które łatwo można pobrać i hodować poza ustrojem np. komórki hematopoetyczne (komórki macierzyste krwi) i szpiku kostnego. Transfer in vivo polega na bezpośrednim podaniu preparatu genowego do organizmu. Preparat można podać ogólnoustrojowo, czyli do głównych naczyń krwionośnych rozprowadzających krew po całym organizmie lub lokalnie - do określonej tkanki np. śródskórnie, dootrzewnowo, doguzowo. Lokalne podanie obejmuje także wprowadzenie preparatu do naczyń krwionośnych zaopatrujących w krew narząd docelowy np. podanie preparatu do żyły wrotnej w celu transfekcji hepatocytów (komórek wątroby).

Jak najefektywniej wprowadzić preparat genowy? Na to pytanie szuka odpowiedzi wielu naukowców. Transfer genów jest głównym etapem ograniczającym uzyskanie wydajnej ekspresji i efektu terapeutycznego. Najłatwiej podać preparat genowy w postaci tzw. „nagiego” plazmidowego DNA, czyli z niczym nie związanej cząstki plazmidu niosącej „terapeutyczny gen”. Jednak sposób ten jest mało wydajny, ponieważ „nagie” DNA jest degradowane przez nukleazy zawarte w surowicy oraz nukleazy komórkowe, co znacznie obniża liczbę cząstek plazmidu docierających do jądra komórkowego. Ze względu na niską wydajność transfekcji „nagim” plazmidowym DNA zaczęto poszukiwać innych metod wprowadzania genów. Szczególną uwagę naukowców zwróciły wirusy, ponieważ w trakcie ewolucji wykształciły wiele mechanizmów do wprowadzania własnego materiału genetycznego do komórek gospodarza. Zaczęto modyfikować cząstki wirusowe tak aby mogły efektywnie wprowadzać „terapeutyczne geny”. Rekombinowane wirusy wykorzystywane w terapii genowej to przede wszystkim retrowirusy, adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami (AAV - z ang. adeno-associated virus) (rysunek 3). Wirusy są tak modyfikowane, aby efektywnie wprowadzały geny do docelowych komórek nie wywołując efektów ubocznych zagrażających życiu pacjenta. Modyfikacje najczęściej polegają na usunięciu genów wirusowych odpowiedzialnych za wywoływanie choroby (geny wirulencji) oraz za replikację materiału genetycznego wirusa i jego namnożenie w komórkach gospodarza. W to miejsce wprowadzany jest transgen kodujący „terapeutyczne białko”. Ponadto naturalne białka otoczki wirusa są zastępowane innymi białkami lub modyfikowane w celu zwiększenia powinowactwa wektora do określonych typów tkanek, dzięki czemu infekcji ulegną tylko komórki docelowe. Modyfikacje obejmują także usunięcie lub zmutowanie genów, które wywołują najsilniejszą reakcję układu odpornościowego. Wykorzystanie naturalnych zdolności wirusów do wprowadzania kwasów nukleinowych do określonego typu komórek i zdolności do integracji z genomem gospodarza umożliwia wydajną transfekcję wielu typów komórek oraz zapewnia wysoki poziom ekspresji transgenu. Jest to obecnie najczęściej wykorzystywana metoda transferu genów, choć ma wiele wad. Pod znakiem zapytania stawia się bezpieczeństwo stosowania preparatów pochodzenia wirusowego, ze względu na możliwość powrotu wirusa do „typu dzikiego” i wywołania choroby, wysoką immunogenność będącą przyczyną powstania silnej odpowiedzi immunologicznej i możliwość wywołania dodatkowych mutacji w wyniku integracji transgenu w nieodpowiednim miejscu (mutageneza insercyjna), co może doprowadzić do uszkodzenia ważnych genów lub aktywacji onkogenów. Wyżej wymienione wady spowodowały poszukiwania alternatywnej metody, która umożliwiłaby wydajną transfekcję i byłaby bezpieczniejsza. Zaczęto stosować kationowe nośniki chemiczne takie jak lipidy i polimery. Związki te kompleksują kwasy nukleinowe na bazie oddziaływań elektrostatycznych. Powstałe kompleksy wnikają do komórek na drodze endocytozy. Transfer jest wydajniejszy niż w przypadku „nagiego” plazmidowego DNA, choć mniej wydajny niż w przypadku wirusów, toteż nadal trwają badania nad ulepszeniem nośników chemicznych. Transfer można także wzmocnić stosując metody fizyczne takie jak: elektroporacja, ultradźwięki, iniekcja hydrodynamiczna, mikrowstrzeliwanie, metody wykorzystujące laser lub pole magnetyczne. Większość z nich to metody inwazyjne, powodujące powstanie przejściowych porów w błonie komórkowej, dzięki czemu więcej preparatu genowego może wniknąć do komórek. Metody fizyczne znacznie zwiększają wydajność transfeu, jednak mają swoje ograniczenia i nie mogą być stosowane we wszystkich przypadkach. Najczęściej ograniczają się do łatwo dostępnych, powierzchniowych tkanek np. skóry.

Jakie cechy powinien mieć idealny nośnik? Wydaje się, że powinien łączyć w sobie najlepsze cechy wektorów wirusowych i nośników chemicznych. Powinien wydajnie wprowadzać geny do komórek, chronić DNA przed degradacją, wykazywać specyficzność tkankową (dzięki czemu możliwa będzie terapia celowana) oraz umożliwiać ukierunkowaną integrację z genomem gospodarza warunkującą długotrwałą i stabilną ekspresję transgenu. Jednocześnie idealny nośnik powinien być bezpieczny tzn. nie może wywoływać odpowiedzi zapalnej, immunologicznej i innych efektów ubocznych np. mutagenezy insercyjnej. Jak na razie idealny wektor nie istnieje. Niemożliwe jest też uzyskanie uniwersalnego nośnika. Każda tkanka jest inna, posiada charakterystyczne cechy względem których należy dobrać odpowiedni nośnik. Prowadzonych jest wiele badań z zakresu metod transferu. Testowane są coraz to nowsze związki i ich połączenia, jednak jeszcze wiele badań musi zostać wykonanych aby uzyskać wydajny i bezpieczny system wprowadzania genów do komórek.

Wprowadzony preparat genowy musi dotrzeć do jądra komórkowego, ponieważ tylko tam może ulec ekspresji w wyniku której powstanie białko o działaniu terapeutycznym. Jednakże droga od podania preparatu do powstania zamierzonego efektu jest długa. Preparat genowy napotyka na niej wiele barier często uniemożliwiających powstanie efektu terapeutycznego. Do głównych barier zalicza się degradację preparatu przez nukleazy obecne w surowicy oraz nukleazy komórkowe. Etapem limitującym jest również moment oddziaływania z błoną komórkową i wnikania do komórki. Ujemnie naładowany kwas nukleinowy („nagi” plazmidowy DNA) słabo oddziałuje z ujemnie naładowaną błoną komórkową, natomiast kompleksy DNA z nośnikami chemicznymi o wypadkowym ładunku dodatnim (liposomy lub polipleksy) efektywniej wiążą się z błoną, dzięki czemu ułatwiają wnikanie preparatu do komórki. Kolejną przeszkodą na drodze pDNA jest przedział lizosomalny, w którym większa część wprowadzonego preparatu ulega degradacji. Wektory wirusowe oraz nośniki chemiczne są tak konstruowane, aby unikały przedziału lizosomalnego lub umożliwiały ucieczkę z lizosomu. Na przykład polietylenoimina (polimer kationowy) dzięki obecności grup aminowych posiada właściwości buforujące, które warunkują napływ anionów chlorkowych do lizosomu, co z kolei powoduje jego pęcznienie (tzw pęcznienie osmotyczne) i pęknięcie. Dzięki temu kompleksy DNA z polietylenoiminą unikają degradacji. Sposób w jaki plazmidowy DNA i jego kompleksy są transportowane do jądra nie został jeszcze dokładnie zbadany. Prawdopodobnie wykorzystywana jest do tego sieć mikrotubul tak jak w przypadku wirusów. Kolejną barierą jest podwójna błona jądrowa ograniczająca liczbę cząsteczek wchodzących do jądra komórkowego. Wykazano, że preparaty genowe jako cząsteczki o masie większej niż 50kDa są transportowane do jądra na drodze specyficznych oddziaływań z kompleksem porów jądrowych będących częścią podwójnej błony jądrowej. Badania wykazały, że z wprowadzonych cząstek plazmidowych tylko 10% wnika do jądra komórkowego. Niestety jest to często zbyt mało aby osiągnąć zamierzony efekt terapeutyczny. Dlatego też tak ważne jest uzyskanie wydajnego systemu transferu, który umożliwiałby wprowadzenie wystarczająco dużej liczby kopii plazmidowego DNA. Gdy już podany preparat wniknie do jądra komórkowego może ulec integracji z genomem lub pozostać jako element pozachromosomowy (episom). W jądrze komórkowym zachodzi transkrypcja (synteza mRNA na matrycy DNA). Następnie mRNA transportowane jest do cytoplazmy, gdzie zachodzi translacja (synteza łańcucha polipeptydowego na matrycy mRNA). Powstałe białko często wymaga jeszcze dodatkowych modyfikacji aby stało się funkcjonalne.

Białka pełnią wiele funkcji - odpowiadają za prawidłowe funkcjonowanie i strukturę komórek budujących organizm. Gdy gen kodujący dane białko ulegnie uszkodzeniu, może powstać nieprawidłowe białko lub w ogóle nie powstanie produkt białkowy, co zaburza funkcjonowanie organizmu i jest przyczyną choroby. Przykładem jest mukowiscydoza (zwłóknienie torbielowate) - choroba genetyczna spowodowana mutacją genu odpowiedzialnego za syntezę błonowego kanału chlorkowego CFTR (ang. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Odkryto wiele mutacji w obrębie genu CFTR odpowiedzialnych za powstanie choroby. Najczęściej występuje mutacja ΔF508 (66% przypadków), polegająca na usunięciu trzech nukleotydów CTT dla fenyloalaniny (Phe) z sekwencji nukleotydowej (rysunek 4). Brak tego aminokwasu w łańcuchu białkowym uniemożliwia powstałemu polipeptydowi osiągnięcie prawidłowej lokalizacji w komórce, co zaburza transport elektrolitów. Powstaje lepka i gęsta wydzielina, której zaleganie w układzie oddechowym, pokarmowym i rozrodczym, jest przyczyną wystąpienia różnorodnych objawów chorobowych.

W przypadku mukowiscydozy strategia terapeutyczna polega głównie na wprowadzeniu do komórek nabłonków oddechowych z defektem genetycznym prawidłowych, niezmutowanych kopii genu CFTR. Badania wykazały, że wprowadzenie prawidłowej kopii genu do 10% nieprawidłowych komórek zapewnia uzyskanie poziomu prawidłowego białka CFTR zbliżonego do poziomu u osób zdrowych, co kompensuje skutki defektu genetycznego, choć go nie usuwa.

Strategie i ich zastosowanie

W zależności od typu choroby stosowane są różne strategie terapii genowej:

1.Komplementacja defektu genetycznego.
Do komórek z defektem genetycznym wprowadzana jest prawidłowa kopia genu, na podstawie której powstanie białko, którego wcześniejszy brak lub nieprawidłowe funkcjonowanie powodowało objawy choroby. Strategia stosowana jest w przypadku chorób monogenowych recesywnych np. mukowiscydozy, anemii sierpowatej, hemofilii.

2.Korekta mutacji.
Metoda polega na naprawie defektu genetycznego (uszkodzony fragment genu lub cały gen zastępowany jest poprawną sekwencją). Najczęściej do tego celu wykorzystuje się oligonukleotydy lub rybozymy (RNA o aktywności katalitycznej). Strategia jest wykorzystywana w próbach leczenia chorób monogenowych recesywnych i dominujących (np. pląsawicy Huntingtona).

3.Zahamowanie ekspresji zmutowanego genu.
Jako preparat podaje się antysensowne oligonukleotydy, rybozymy lub siRNA (mały interferujący RNA) wiążące docelową sekwencję DNA lub RNA i degradujące ją. Strategia ma na celu inaktywację genów, których produkty odpowiedzialne są za powstanie choroby. Metoda znalazła zastosowanie w przypadku chorób infekcyjnych, nowotworowych oraz chorób monogenowych dominujących.

4.Eliminacja komórek.
Do komórek docelowych wprowadzane są preparaty genowe zawierające cDNA kodujące białka wywołujące śmierć nieprawidłowych komórek np. czynniki proapoptotyczne, immunostymulujące, toksyczne białka lub ich prekursory. Metoda jest stosowana w przypadku chorób infekcyjnych i nowotworowych

5.Nadanie komórkom nowych cech fenotypowych.
Przykładem jest terapia proangiogenna polegająca na podaniu preparatów genowych zawierających cDNA kodujące proangiogenne czynniki indukujące formowanie nowych naczyń krwionośnych. Terapia proangiogenna znalazła zastosowanie w leczeniu chorób układu krążenia np. niedokrwienia serca i kończyn. Innymi przykładami tego typu strategii są szczepionki DNA mające na celu immunizację ustroju oraz terapia antyangiogenna wykorzystywana w próbach leczenia nowotworów.

Główne problemy terapii genowej

Stosunkowo proste założenia terapii genowej okazały się trudne w realizacji. Pojawiło się wiele problemów uniemożliwiających osiągnięcie efektu terapeutycznego i zastosowanie terapii genowej w klinice. Dlatego też prowadzone są dalsze badania mające na celu ominięcie zaistniałych barier. Przede wszystkim należy zapewnić bezpieczeństwo procedury poprzez przygotowanie nietoksycznych, nieimmunogennych preparatów genowych zgodnych z wymogami farmakopealnymi. Należy także zaprojektować sposób podania (łatwy, bezpieczny i efektywny) oraz określić dawkę preparatu. Ponadto preparaty genowe powinny być łatwe i tanie w syntezie i przechowywaniu. Poważnym problemem jest także brak wydajnego systemu transferu genów do jąder komórkowych komórek docelowych. Z tym z kolei są związane problemy z uzyskaniem długotrwałej ekspresji transgenu na odpowiednim poziomie. Przyczyną niestabilnej ekspresji są także trudności z uzyskaniem ukierunkowanej integracji wprowadzanego DNA, przez co konieczne staje się wielokrotne podawanie preparatu genowego, co z kolei przyczynia się do powstania odpowiedzi immunologicznej ze strony organizmu. Wydajna ekspresja na stałym poziomie wymaga także dobrania odpowiedniego systemu ekspresyjnego tzn. odpowiedniego konstruktu wektora, przy czym szczególną uwagę należy zwrócić na wybór promotora inicjującego transkrypcję.

Podsumowanie

Terapia genowa jest obiecującą metodą leczenia wielu chorób - zarówno wrodzonych (choroby uwarunkowane genetycznie) jak i nabytych (choroby infekcyjne, układu krążenia, nowotwory). Ulepszenie metod transferu pod względem bezpieczeństwa i wydajności wprowadzania genów do komórek docelowych, wybór „genu terapeutycznego” oraz uzyskanie ukierunkowanej integracji z genomem gospodarza w wyniku czego możliwa będzie stabilna i długotrwała ekspresja transgenu, są głównymi celami badań prowadzonych w zakresie terapii genowej. Pomimo licznych trudności stojących na drodze do sukcesu, terapia genowa wydaje się być metodą przyszłościową. Toteż należy zintensyfikować badania oraz poddać wnikliwej analizie wyniki przeprowadzonych doświadczeń. Czy terapia genowa spełni oczekiwania naukowców i pacjentów? Dotychczasowe wyniki badań są zachęcające i dają nadzieję, że terapia genowa znajdzie praktyczne zastosowanie w leczeniu chorób z którymi nie radzą sobie konwencjonalne metody terapeutyczne.

Rekombinacja i wedrowki genow

Rekombinacja nazywamy wymiane odcinkow miedzy regionami DNA. Spelnia ona dwie zasadnicze role:

Ze wzgledu na charakter czasteczek, kotre ulegaja rekombinacji istnieje podzal na:

REKOMBINACJA UPRAWNIONA
Wzajemna wymiana odcinkow miedzy homologicznymi czasteczkami DNA zostala okreslona przez Th. Morgana (naukowca, ktory w latach trzydzestych badal mejoze u muszki owocowki) jako crossing-over. Proces ten zachodzi u bakterii, wirusow, a takze miedzy homologicznymi chromosomami organizmow eukariotycznych, glownie w czasie mejozy. W proces crossing-over zaangazowane sa czesto liczne kompleksy enzymatyczne, lecz dokladny mechanizm ich dzialania nie jest do konca poznany. W swietle obecnej wiedzy mechanizm rekombinacji uprawnionej przedstawia sie nastepujaco:

Wiadomo, ze w proces rekombinacji zaangazowane sa bialka. Jednym z najlepiej poznanych bialek bioracym udzial w tym procesie jest RecA u Escherichia coli. Bialko to odpowiada za rozplecenie spirali DNA, prawidlowe rozpoznanie komplementarnych sekwencji i wydluzanie mieszancowego DNA. Aby pelnic te funkcje musi miec mozliwosc tworzenia kompleksow z DNA.

U organizmow eukariotycznych rekombinacjia genetyczna zachodzi zwykle w czasie mejozy (w pachytenie pierwszgo podzialu mejotycznego) i jest zwiazana z koniugacja chromosomow homologicznych.

REKOMBINACJA NIEUPRAWNIONA
Jest to szczgolny przypadek rekombinacji, w ktorym biora udzial czasteczki DNA o roznych sekwencjach nukleotydowych, majace jedynie niewielkie odcinki homologiczne.

Jednym z przykladow takiej rekombinacji, jest integracja DNA bakteriofagow w genofor bakteryjny. DNA fagowe i bakteryjne ma specjalne 15 nukleotydowe sekwencje rozpoznawane przez specyficzne enzymy (integrazy), ktore umozliwiaja wzajemna rekombinacje. Zintegrowane w genofor bakteryjny DNA faga nosi nazwe profaga. Profag moze ulec wycieciu (tzw indukcja profaga) z udzialem enzymow bioracych udzial w jego integracji oraz dodatkowego, kodowanego przez DNA fagowe.

Innym przykladem rekombinacji nieprawnionej jest "wedrowka" transpozomow, czyli elementow genetycznych zdolnych do zmiany polozenia w genomie . Rekombinacja z udzialem transposomow odbywa sie w obrebie genomu jednego organizmu. Transpozomy sa odcinkami DNA, zlozonymi z kilkuset lub kilkutysiecy par nukleotydow, wystepujacymi w wielu kopiach, mogacymi w wyniku swojego przemieszczania (transpozycji) powodowac zmiany w strukturze genomu (np. duplikacje, inwersje lub delecje). Przemieszczanie sie transpozomow sterowane jest specyficznymi enzymami - transpozazami.
Bardziej zlozone transpozomy maja specyficzne sekwencje na obu koncach. Sa to tzw. sekwencjie insercyjne (IS), rozpoznawane przez odpowiednie enzymy decyduja o wintegrowaniu sie w chromosom. Pomiedzy sekwencjami IS moga znajdowac sie geny warunkujace opornosc na anybiotyki. Aby transpozaza mogla poprawnie wlaczyc DNA transpozomu, na chromosomie musza wystepowac specyficzne, zlozone z kilku nukleotydow, sekwencje docelowe.
W komorkach eukariotycznych odkryto inny rodzaj transpozomow tzw. retrotranspozomy. Retrotranspozomy podobnie jak retrowirusy w procesie transpozycji przechodza przez stadium RNA, ktory w wyniku dzialania dzialania odwrotnej transkryptazy jest przepisany na DNA.

Regiony hiperzmienne - regiony cząsteczki przeciwciała znajdujące się w obrębie regionu zmiennego (V, ang. variable) łańcuchów lekkiego i ciężkiego. Charakteryzują się bardzo dużą zmiennością sekwencji aminokwasowej dla odmiennych cząsteczek.

Fotoreaktywacja - jeden z mechanizmów naprawy DNA, w którym enzym fotoliaza specyficznie reaguje z jedno- lub dwuniciowym fragmentem DNA, zawierającym fotodimery pirymidyn. Pod wpływem światła o długości fali 310-480 nm, następuje enzymatyczne rozszczepienie fotodimerów do monomerów i przywrócenie DNA do stanu pierwotnego. Zachodzi bezustannie w organizmie, w komórkach narażonych na działanie promieni UV.

Enzym fotoliaza odpowiedzialny za fotoreaktywację został wykryty u bakterii (m.in. Eschericha coli), grzybów, roślin i niektórych kręgowców.

Fotoreaktywacja - Reakcja polegająca na usunięciu uszkodzenia powstałego ekspozycją DNA na promieniowanie UV o długości fali 200 - 300 nm wykorzystując energię dostarczaną przez promieniowanie o długości fali 300 - 500 nm, a więc przez długofalowy UV lub światło widzialne (system obecny w E. coli, S. cerevisiae).

Reakcja fotoreaktywacji polega na wiązaniu się enzymu z produktem (dimer pirymidynowy) na etapie niezależnym od światła widzialnego, po czym następuje absorpcja fotonu światła widzialnego, która powoduje rozszczepienie dimeru, odtworzenie pirymidyn i dysocjację enzymu.
Reakcja rozszczepiania dimerów najefektywniej przebiega w stosunku do dimeru T:T, a najmniej efektywnie w stosunku do C:C.

Jak powstają nowe geny?
Bogacenie się genomu o zapis nowych białek rozpoczyna się od przypadkowego zwielokrotnienia pewnego odcinka DNA, bądź to przez duplikację, bądź przez dodanie całego chromosomu, czy też przez poliploidyzację. Jeśli nowy genom stworzy organizm zdolny do życia, będzie on mógł produkować białko w dwu lici. Jeśli na jednym z nich będzie się wytwarzać dosyć produktu dla wypełnienia dotychczasowej funkcji, drugi locus może bez przeszkody ulec mutacji. Gdy zmutowany odcinek będzie tworzył białko o podobnym działaniu do białka wyjściowego, dobór może preferować osobniki posiadające w genomie obie izoproteiny, np. o różnym optimum działania zależnym od temperatury. Powtarzanie tego procesu doprowadziło do istnienia takich rodzin genów jak np. hemoglobiny wraz z mioglobiną. 

17. CZYNNIKI MUTAGENNE. ICH ZNACZENIE I WYKRYWANIE

Skutecznosc dzialania mutagenow zalezy od : wilgotnosci, dostepnego tlenu, temp, stanu fizjologicznego ( wiek,faza komorki ), dostepnosci (stezenia) tla genetycznego, skutecznosci selekcji.
Naprawa uszkodzen powstalych na skutek dzialania promieni UV ( np.u E.coli)

1. fotoreaktywacja - polega na uzyciu specjalnego enzymu - fotoliazy. Czasteczka ta wykorzystuje pochlaniana energie swietlna do rozrywania wiazan kowalencyjnych w dimerach np.tymidynowych. odtwarza wiec strukture DNA znoszac skutek mutacji

2. reperacja przez wycinanie - dimery i inne uszkodzenia moga byc wycinane na odcinku 20-30 nukleotydow. Warunkiem powodzenia jest brak uszkodzen na drugim pasmie DNA. Naprawa polega na tym ze specyficzny enzym endonukleaza nacina nic w poblizu miejsca uszkodzenia. Inny enzym usuwa caly rejon uszkodzenia i wstawia brakujace nukleotydy. Korzysta przy tym z matrycy jaka jest nic nieuszkodzona. Potem pozostaje polaczyc naprawiona nic w calosc przy uzyciu ligazy.

Naprawa uszkodzenpowodowanych przez czynniki chemiczne

1. endonukleazy

2. reperacja przez wycinanie i resynteze

23. FAG LAMBDA - CHARAKTERYSTYKA

· jest to fag lagodny 9umiarkowany)
· nalezy do fagow przeprowadzajacych transdukcje ( przeniesienie inf.genetycznej z jednej baktrii do drugiej za pomoca baktreriofaga)
· to ze jest fagiem lagodnym oznacza ze nie musi koniecznie doprowadzic do smierci komorki bakteryjnej po uprzednim namnozeniu (cykl lityczny), moze natomiast wlaczyc sie do chromosomu bakteryjnego i byc razem z nim replikowany
· fag zintegrowany w chromosomie bakterii nazywamy PROFAGIEM
· profag jednak moze ulec oddzieleniu od DNA bakerii (np.pod wplywem czynnikow zewn.tj. promieni UV lub X) wtedy rozpoczyna sie cykl lityczny ktory konczy sie smiercia bakterii
24. GENOM FAGA LAMBDA - CHARAKTERYSTYKA

· DNA faga moze przybrac dwie formy : albo kulista albo liniowa
· Gdy DNA jest w wirusie wtedy jesy liniowe, gdy w bakterii - kuliste lub liniowe
· Zmiana formy liniowej w kolsta jest mozliwa dzieki enzymom, ktore powoduja pekniecie zarowno jednej nici (+) jak i drugiej (-). Pekniecia nie powstaja w tym samym miejscu, ale b.blisko siebie. To powoduje ze liniowe DNA faga na 2 jednoniciowe konce, ktore sa w stosunku do siebie komplementarne. Nazywamy je lepkimi koncami i dzieki temu froma liniowa moze zmienic sie w kolistai odwrotnie. Wymaga to tylko wytworzenia wiazan wodorowych pomiedzy komplementarnymi koncami.
· Koliste DNA faga wystepuje u bakterii w momencie gdy jest ona w fazie litycznej, w fazie lizogenicznej jest forma liniowa wbudowana w chromosom bakterii (profag)
· „lepkie” konce sa wolne o dlugosci do 12 nukleotydow


25. REGULACJA LIZOGENICZNOSCI NA POZIOME MOLEKULARNYM

etapy cyklu lizogenicznego :

1. etap integracji
· polega na wbudowaniu DNA faga w konkretnym miejscu od DNA gospodarza
· powstaje profag - powoduje to brak cyklu litycznego

2. etap trwania : 
· jedynym genem ulegajacym ekspresji jest gen C I
· gen C I odpowiada za kodowanie represora bialkowego
· represor z kolei blokuje ekspresje pozostalych genow procz genu C I to powoduje trwanie w fazie lizogenicznej
· ]jedyne inaktywacje represora umozliwia ekspresja innych genow co z kolei powoduje wyciecie profaga z DNA bakterii i rozpoczyna cykl lityczny

3. etap uwalniania : 
· represor wykazuje duze powinowactwo do operonow O2 i O12
· represor laczac sie z nimi warunkuje zahamowanie ekspresji innych genow
· taki stan jest dosc slaby i umozliwia i umozliwia autoryzacje represora oraz cyklu litzogenicznego
· jesli profag przechodzi z kom.lizogenicznej do nielizogenicznej okazuje sie ze brak tam bialek represorowych i nie mam co juz utrzymywac fazy lizogenicznej inaktywacje moga powodowac rowiniez np.promieniowania
· pod wplywem enzymow profag zostaje wyciety z DNA bakterii i rozpoczyna sie cykl lityczny

27. CHARAKTERYSTYKA I DZIALANIE OPERONU LAKTOZOWEGO

Schemat przedstawia operon laktozowy. 
Geny struktury
regulator promotor operator X Y Z


Pojedyncza komorka bakteryjna jest zmuszona do czestych zmian substratow pokarmowych, a ze wzgledu na koszty energetyczne, nie moze sobie pozwolic na stala synteze wszystkich enzymow potrzebnych do ich rozkladu. Zatem w komorkach prokariotycznych musza istniec bardzo precyzyjne mechanizmy regulujace biosynteze tylko tych bialek, ktore sa w danej chwili niezbedne. 
Jednym z najlepiej poznanych ukladow regulacyjnych u bakterii jest operon. Jego mechanizm jest oparty na oddzialywaniu bialka regulatorowego z okreslona sekwencja nukleotydowa DNA - operatorem . Operon mozna sobie wyobrazic jako grupe genow kontrolowanych przez wspolny system regulacyjny, majacych jeden promotor i transkrybowanych w postaci pojedynczego mRNA. 
Dzialanie operonu mozna przedstawic na przykladzie operonu laktozowego, wystepujacego u paleczki okraznicy (Escherichia coli). Umozliwia on utrzymanie niskiego stezenia enzymow warunkujacych rozklad laktozy w warunkach jej braku oraz szybki wzrost stezenia przy pojawieniu sie substratu. Operon laktozowy sklada sie z trzech lezacych obok siebie genow kodujacych enzymy (lacZ, lacY, lacA) - tzw. genow struktury. W kierunku 5' do tych genow znajduje sie sekwencja DNA, zwana operatorem, z ktora wybiorczo moze sie laczyc bialko zwane represorem. Dodatkowo region operatorowy (operator) naklada sie piecioma nukleotydami na promotor genow struktury, znaczy to, ze dolaczenie represora uniemozliwia transkrypcje tych genow. 
Istota mechanizmu regulacyjnego operonu jest to, ze zdolnosc laczenia sie represora z odcinkiem operatorowym jest zmieniana przez drobnoczasteczkowe zwiazki chemiczne. W przypadku operonu laktozowego, polaczenie sie laktozy do bialka regulatorowego (represora) powoduje obnizenie jego zdolnosci do wiazania sie z operatorem. W rezultacie zmieniony w ten sposob represor przestaje blokowac sekwencje operatorowa i umozliwia przylaczenie sie polimerazy RNA do promotora. 
Represor jest wytwarzany w komorce bakteryjnej w sposob ciagly, nie zaleznie od tego, czy laktoza jest obecna w srodowisku, czy tez nie. Przy braku laktozy represor uniemozliwia przylaczenie sie polimerazy RNA i rozpoczecie transkrypcji. Pojawienie sie laktozy w srodowisku zmienia strukture czasteczek represora, umozliwiajac tym samym synteze mRNA z zapisana informacja o enzymach rozkladajacych laktoze. Po wyczerpaniu substratu, nie modyfikowane juz czasteczki represora znow lacza sie z operatorem, przywracajac wyjsciowa sytuacje. 
Na uwage zasluguje fakt, ze operon laktozowy nie moze byc zaindukowany, kiedy w srodowisku srodowisku obok laktozy znajduje sie latwiej przyswajalne zrodlo wegla - glukoza. Musi wiec istniec mechanizm, dzieki ktoremu glukoza nie dopuszcza do indukcji operonu laktozowego. Zjawisko to nazwano represja glukozowa (ogolnie represja kataboliczna). 
A TERAZ PO MOJEMU J

· O.L wystepuje u org. Prokariotycznych
· Umozliwia wykorzystanie konkretnej inf.genetycznej gdy jest ona potrzebna, w przypadku O.L. dotyczy to syntezy enzywmow potrzebnych do rozlozenia laktozy w taki sposob by mogla byc wykorzystana przez bakterie (E.coli)
· E.coli wykorzystuje laktoze jakos zrodlo wegla
· Jednak lepszym subrtratem dla bakterii jest glukoza i jesli glukoza i latkoza sa w srodowisku to glukoze wykorzystuja jako pierwsza
· FRANCOIS JACOB i JAQUES MOROD - naukowcy ktorzy opracowali teorie operonu laktozowego (Nobel)

Bakterie (Ecoli) syntezuja ok 800 roznych bialek. Niektore z nich syntezowane sa w sposob konstytuywny, np bialka szlaku glikolitycznego, podobnie bialka budulcowe, lecz wiekszosc genow bedzie potrzeban tylko przy specjalnych okazjach. Geny kodujace enzymy jednego szlaku metabolicznego czesto zorganizowane sa w operony ktore sa zdolne do jednoczesnego sterowania wieksza liczba genów. Laktoza jest wykorzystywana jako zapasowe zrodlo energii a poniewaz jest dwucukrem jej uzycie wymaga: 

· Wprowadzenia czastek laktozy do wnetrza kom. Operacje ta przyspiesza enzym permeaza
· Rozlozenia czastki 2-cukrowej do monosacharydowych skladnikow : glukozy i galaktozy. Reakcje katalizuje beta-galakotzydaza
· Przeksztalcenia galaktozy w glukoze. Byc moze bierze w tym udzial transacetylaza galaktozydowa

Wazne jest to ze w przecietnych war. Ilosc tych enzymow jest b.niska, gdy komorke przeniesiemy z pozywki glukozowej na laktozowa to ilosc ich czasteczek wzrasta do prawie 5% masy wszystkich bialek kom. Jesli il.laktozy w pozywce jest niewielka to po wyczerpaniu zapasow tego zrodla energii stezenie w/w enzymow dosc szybko spada
.
Operon - odcinek ktory jest genem kodujacym bialka kontrolujace ekspresje genow enzymow przerabiajacych laktoze.

Geny trzech enzymow ( geny strukturalne ) polozone sa obok siebie a powyzej sekwencji 1 z nich kodujacego beta-galaktozydaze znajduje sie miejsce inicjacji transkrypcji ( promotor ). Do niego przylacza sie polimeraza RNA przepisujaca wszystkie trzy geny na jedna czasteczke mRNA. Pomiedzy promotorem a a genem pierwszgo enzymu znajduje sie jeszcze inny odc.DNA zwany operatorem. Odgrywa on zasadnicza role w ekspresji genow lezacych ponizej niego ( genow strukturalnych ). W ten sposob tworzy sie sekwencja DNA :

PROMOTOR-OPERATOR-GEN I-GEN II-GEN III

Pozostaje ona pod kontrola innego dosc odlegle polozonego genu ktory transkrybowany jest ciagle a powstajacy w mRNA ulega translacji. Jej produktem jest bialko ktore rozpoznaje przestrzennie sekwencje zasad operatora i oplaszcza sie wokolniego. Represor poniewaz blokuje polimerazie DNA dostep do sekwencji polozonych ponizej - blokuje transkrypcje genow strukturalnych. Gdy zachodzi potrzeba pobrania laktozy element blokujacy zostaje zablokowany :) . Bialko represora moze ulec allsoterycznej modyfikacji tak ze przestaje odczytywac sekwencje operatora i uwalnia go. W ten spos.polimeraza moze zaczac przesuwanie sie wzdluz odcinaka DNA.Czynnikiem ktory moze spowodowac dezaktywacje represora jest laktoza.. Dlatego w tej sytuacji nazywa sie derepresorem .

FUNKCJONOWANIE UKLADU ^ v

· W momencie gdy w srodowisku nie ma laktozy represor wyprodukowany przez gen regulatorowy (i) przylacza sie do operatora ( powinowactwo operatora do represora)
· To powoduje ze pomimo istnienia miejsca promotorowego transkrypcja nie zachodzi - uniemozliwia ja represor
· Jesli w srodowisku pojawia sie laktoza za jej stezenie jest duze wzrasta powinowactwo repsesora do laktozy (represor jest bialkiem allosterycznym ma 2 centra i przylacza sie jednym do operatora a drugim do laktozy)
· Przylaczenie laktozy do operatora powoduje odksztalcenie drugiego centrum aktwynego. Dziala to na zasadzie inhibicji odwracalnej w zal. Od tego ktorego substratu jest wiecej z tym sie laczy.
· Represor laczy sie z laktoza i odlacza od operatora dzieki temu mozliwa jest transkrypcja genow strukturalnych Z,Y,A
· Geny strukturalne odpowiedzialne sa za synteze odpowiednich enzymow

Gen Z beta - galaktordaza? - enzym ten powoduje rozpad laktozy na glukoze i galaktoze

Gen Y parmeaza? - beta-galaktorydoza? - umozliwia wprowadzenie laktozy ze srodowiska zwewnetrznego do wewn. Na drodze transportu aktywnego 

Gen A Ttransacetylacja galaktozydowa - akceptuje gestniejace galaktozydazy, rozklada galaktoze na glukoze
- do momentu gdy w kom.znajduje sie laktoza powtarza sie
- gdy laktozy nie ma represor przylacza sie do operatora i dzialalnosc genow Z,Y,A zostaje zahamowana, nie sa rowniez syntezowane niepotrzebne enzymy rozkladajace laktoze. NIC NIE ROZUMIEM :/

Operon laktozowy nalezy do operonow indukowalnych czyli uruchamialnych, ktore pierwotnie sa blokowane i ulegaja uaktywnieniu jedynie w specyficznych sytuacjach.



28. MUTACJE REPRESORA W OPERONIE LAKTOZOWYM LAC

1. Powstajace mutacje zwiazane sa z uszkodzeniami w DNA (zmiana sekwencji nukleotydow )
2. moga wynikac rowniez z tego ze polimeraza lubi sie mylic
3. poniewaz represor jest tworem genu regulujacego to jego mutacje beda zwiazane bezposrednio
4. z tym genem (i)
5. gen regulatorowy (i) lezy po lewej stronie nici DNA bakterii i jest oddalony od promotora, operatora i genow strukturalnych
6. wyrozniamy 4 rodzaje mutacji genu regulatorowego : 


i - represor nie jest syntezowany. Powoduje to konstytuywna synteze enzymow nie ma bowiem represora ktory moze polaczyc sie z operatorem
is - mutacja superrepresjonujaca - powoduje ze represor ma szczegolnie duze powinowactwo do operatora i wynikiem tego jest sytuacja gdy represor nie oddziela sie od opertora nawet gdy w srod.jest laktoza, nie ma wiec syntezy enzymow. Jest to mutacja dominujaca nad normalnym stanem (i+ )
i-d - gen regulacyjny wytwarza represor ale jest on nieaktywny. Wynikiem tego jest konstytuywna synteza enzymow
i-q - na skutek mutacji promotora genu regulacyjnego nadmiar represorow. Wynikiem jest induktywna ( powodowana induktorem ) synteza




29. MUTACJE GENÓW STRUKTURALNYCH W OPERONIE LAC


Kazdy z tych genow odpowiedzialny jest za powstawanie innego enzymu i przeprowadzanie innej reakcji

· jesli Z -Y+A+ - pomimo aktywnosci Y i A brak podzialu na galaktoze i glukoze, z to w kom.jest duzo laktozy - dzialanie Y
· jesli Z-Y-A+ - brak podzialu brak laktozy w kom
· jesli Z-Y-A- - nic sie nie dzieje
· jesli Z+Y-A+ - jest podzial ale nie ma sprowadzonej laktozy do kom (?)
· jesli Z+Y-A- -jest podzial ale ani nie jest pobrana ani nie ma jej kto obrobic-galaktozy

Wszystkie geny musza funkcjonowac prawidlowo zeby proces byl pelny. Najgorzej wplywa brak lac2 bo aktywnosc YiA nie maja pozniej znaczenia. Przy braku Y po prostu mniej laktozy i szybciej sie wyczerpuje. Przy braku A galaktoza nie moze byc rozlozona.

Z - permeaza
A - transacetylaza galaktozydowa
Y - beta-galaktozydaza



30. MUTACJE CZESCI REGULATOROWYCH OPERONU LAC


Mutacje nastepuja rowniez w promotorze i operatorze pomimo ze nie sa one transkrybowane i reguluja ten proces.

m.o c - mutacja operatora polega natym ze represor nie moze dolaczyc sie do niego. Wynikiem jest synteza enzymow ciagla

m. p. - rozne mutacje promotora powodujaca synteze enzymow ale z rozna wydajnoscia, rozna wydajnosc transprypcji


31. ROLA CAMP W REGULACJI OPERONU LAC


Mamy tu doczyniena z nadrzednym systemem regulacji. Jesli w srod.znajduzje sie glukoza i laktozanajpierw bakt.wykorzystuje glukoze bo do wykorzyst.laktozy potrzeba energii. Zwiekszenie poziomu glukozy powoduje obnizenie zawartosci CAMP ( cykliczny adenozynomonofosforan ) i odwrotnie. Zwiekszenie poziomu CAMP powoduje aktywacje operonu laktozowego. AKTYWACJA operonu jest mozliwa dzieki temu ze CAMP laczy sie z bialkiem regulatorowym CAP (CRP) ,ktore w innym ukladzie jest nieaktywne. CAMP i CAP tworza kompleks, ktory laczy sie ze specyficznym odcinkiem DNA na obwodzie promotorowym. To polaczenie powoduje zmiane struktury promotora, represor odlacza sie od operatora i rozpoczyna sie transkrypcja genow. Samo bialko CAP nie wykazuje powinowactwa do promotara operonu lac, dopiero po polaczeniu z CAMP.

CHARAKTERYSTYKA PLAZMIDU Ti

Charakterystyka plazmidu Ti
· duży kolisty plazmid zawierający min. geny:
- wirulencji
- katabolizmu specyficznych dla szczepu opin 
- biosyntezy opin specyficznych dla szczepu
- związane z biosyntezą hormonów roślinnych - specyficzne dla szczepu
· geny wirulencji i katabolizmu opin są zgrupowane razem i znajdują się poza obszarem T-DNA
· geny biosyntezy opin oraz geny związane z syntezą hormonów roślinnych znajdują się w obszarze T-DNA
· obszar T-DNA jest wyznaczony przez specyficzne sekwencje DNA (bezpośrednie powtórzenia o długości 25 pz) zwane granicznymi (LB- Left Border i RB - Right Border)
· tylko prawa sekwencja graniczna (RB) jest wymagana do rozpoznania i przeniesienia T-DNA 
· obecność lewej sekwencji granicznej (LB) poprawia efektywność tego procesu
· wielkość plazmidów Ti: 150-800 kb

Typy plazmidów Ti (dzikich)
Istnieją różne typy plazmidów Ti zależnie od tego jaki rodzaj opin potrafią utylizować. Najlepiej poznane są plazmidy Ti nopalinowe i oktopinowe. Obydwa typy posiadają obszar T-DNA ale różniący się strukturą:
· Nopalinowy T-DNA - prosty ciągły segment, około 22 kb
· Oktopinowy T-DNA - złożony z 3 segmentów; lewy segment DNA (TL) = 13kb, centralny segment (TC) = 1.5kb, prawy segment (TR) = 7.8kb; lewy segment zawiera funkcje onkogenne a prawy segment geny syntezy opin 
Uogólniony model przeniesienia i integracji T-DNA
· Nić T powstaje i jest przenoszona do komórki roślinnej w postaci kompleksu DNA-białka. Transfer wymaga genów vir zlokalizowanych na plazmidzie Ti i genów chromosomalnych
· Białko, które znajduje się na końcu 5' nici T-DNA wchodzi w interakcję z roślinnym DNA i nacina je
· Jednoniciowe T-DNA jest przyłączane do jednej nici roślinnego DNA a napięcia torsyjne z tym związane powodują rozerwanie drugiej nici roślinnego DNA
· Końce nici T są łączone z końcami roślinnego DNA na drodze ligacji, dosyntetyzowana zostaje nić komplementarna do nici T
· Naprawy (łatanie dziur) i replikacja obszarów integracji nici T prowadzą często do duplikacji i rearanżacji w tym obszarze

Onkogeny - dosłownie geny nowotworów. Powstają z protoonkogenów, normalnie biorących udział w regulacji podziałów komórkowych np. w transdukcji sygnałów np. jako czynniki transkrypcyjne. Mutacja zachodząca w protoonkogenie przekształca go w onkogen. Produkt onkogenu pozostaje stale w aktywnej formie, prowadząc do niekontrolowanej proliferacji. Komórka, w której dochodzi do niekontrolowanego wzrostu uległa transformacji nowotworowej. Proces przekształcenia protoonkogenu w onkogen nazywamy onkogenezą.

Jest szereg różnic między genami supresorowymi a onkogenami. W przeciwieństwie do genów supresorowych onkogeny są genami dominującymi (wystarczy jeden zmutowany allel aby wywierał onkogenne działanie). Mutacje genów supresorowych prowadzą do utraty funkcji a onkogenów do nadmiernej funkcji. Większość genów supresorowych może ulegać mutacjom wkomórkach rozrodczych i wywołać zatem dziedziczne postacie nowotworów. Onkogeny niezwykle rzadko warunkują dziedziczne postacie nowotworów; z reguły związane są z mutacjami somatycznymi. W nowotworach występują sporadycznie.

Białko p53 - czynnik transkrypcyjny o własnościach supresora nowotworowego. Białko p53 jest zaangażowane w regulację wielu procesów komórkowych, a w szczególności aktywacji mechanizmów naprawy DNA lub indukcji apoptozy w odpowiedzi na uszkodzenia DNA.

Mutacje w genie kodującym białko p53 są obserwowane w dużym odsetku nowotworów i korelują z ciężkimi rokowaniami. Efekt przeciwnowotworowy białka p53 jest związany z jego proapoptotyczną aktywnością. Dziedziczne mutacje w genie p53 są przyczyną zespołu chorobowego Li-Fraumeni.

Białko p53 - Żyj lub pozwól umrzeć - odpowiedź komórki na białko p53

Białko p53 jest jednym z czynników transkrypcyjnych odgrywających ważną rolę podczas aktywacji zaprogramowanej śmierci komórki. Proces apoptozy pozwala na utrzymanie homeostazy w organizmie. Jednakże w komórkach rakowych p53 jest nieaktywne co pozwala na dalszy rozwój nowotworu.

Komórki rakowe skupiają się na niszczeniu p53 tak, aby uzyskać nieśmiertelność. Dlatego właściwości białka p53 są rozpatrywane jako jeden z celów przyszłej strategii leczenia raka. Terapia, która zmuszałaby komórki rakowe do popełnienia samobójstwa, mogłaby zatrzymywać rozwój prawie wszystkich typów raka. Jednakże wielkim problemem jest złożoność procesu apoptozy, który regulowany jest przez sieć czynników. Zmiana jednego czynnika wpływa na ekspresję innych genów. Ale żeby uzyskać prawidłowy wynik badań trzeba znać dokładne powiązania wszystkich czynników apoptotycznych.

Budowa i funkcje białka p53


Białko p53 razem z p63 i p73 należy do małej rodziny białek. Składa się z 393 aminokwasów (53kDa). Białko p53 jest kodowane przez gen (TP53), który leży na chromosomie 17. Jako czynnik transkrypcyjny potrafi wiązać się do specyficznych sekwencji DNA, przez co wpływa na ekspresję białek. P53 reguluje aktywność ponad 60 genów. W wiązaniu sekwencji DNA bierze udział tylko 6 aminokwasów. Polipeptydy p53 tworzą tetramery, które dopiero w takiej strukturze potrafią wiązać się do promotorów.

Aktywacja p53 zachodzi pod wpływem wielu różnych czynników, takich jak promieniowanie UV, X, gamma, hipoksja, zmiany temperatury i potencjału redoks, delecja nukleotydu, zmiana w budowie czynników wzrostowych oraz mikrotubul. W zależności od miejsca wiązania do DNA, p53 pobudza ekspresję różnych genów. Powstałe białka wywołują odpowiedzi adekwatne do sytuacji w komórce. Może to być indukcja procesu apoptozy, zatrzymanie cyklu komórkowego i naprawa błędu lub naprawa uszkodzonego DNA. To właśnie p53 decyduje jak duże są zmiany w komórce i czy komórka jest w stanie naprawić te zmiany czy też jedynym wyjściem jest śmierć komórki.


Sposoby regulacji p53

- Powinowactwo p53 do różnych sekwencji DNA

Naukowcy wykryli, że p53 posiada mniejsze lub większe powinowactwo do różnych sekwencji DNA. Mniejsze powinowactwo jest charakterystyczne dla sekwencji DNA, które kodują białka biorące udział w apoptozie, natomiast większe do tych sekwencji, które kodują białka odpowiedzialne za naprawę DNA lub zatrzymanie cyklu komórkowego. 

- Fosforylacja p53

Niezwykle ważna jest rola procesu fosforylacji p53. Aby p53 mogło aktywować ekspresję czynników apoptotycznych (np. BAX) musi być odpowiednio ufosforylowane. Odpowiadają za ten proces kinazy - HIPK2 oraz MAPK. 

- Białka wiążące się do p53 - p300/CBP, JMY, ASPP, p63, p73, MDM2

Ogromny wpływ na p53 mają białka regulujące jego pracę. Białek tych jest wiele i są one ściśle powiązane ze sobą. Najważniejszym regulatorem jest białko MDM2, które wiążąc się do p53 uniemożliwia jego dalsze przyłączenie do DNA. Jeżeli p53 jest wolne może łączyć się z promotorami na DNA, co w konsekwencji prowadzi do ekspresji genów. Innymi regulatorami p53 są ASPP i JMY, które wpływają na wzmocnienie ekspresji genów odpowiadających za aktywację apoptozy np. genu BAX. Do pełnej aktywacji p53 wymagane są również białka z tej samej rodziny - p63 i p73, jednak ich dokładna rolna jest niejasna.
Regulatorem, który nie działa bezpośrednio na p53 lecz także przyczynia się do regulacji jest acetylotransferaza (p300/CBP), która acetyluje histony występujące w miejscach wiązania DNA. Acetylacja histonów umożliwia łatwiejszy dostęp p53 do promotorów w związku z czym proces aktywacji ekspresji genów zachodzi znacznie szybciej.

- Lokalizacja p53 w komórce

Ten sposób regulacji jest dość prosty i polega na zmianie położenia p53 w komórce w zależności od potrzeby. Jeżeli p53 jest w jądrze to działa jako czynnik transkrypcyjny, natomiast będąc w cytoplazmie nie ma możliwości regulacji ekspresji genów. Nie jest jednak jasne gdzie dokładnie w cytoplazmie p53 jest przechowywane i w jaki sposób jest transportowany do jądra.


Dlaczego p53 nie działa w komórkach nowotworowych?

Sposobów na dezaktywację p53 w komórkach nowotworowych jest kilka i każdy z nich prowadzi do uzyskania nieśmiertelności komórki. P53 jest wyjątkowo niechcianym białkiem w komórkach rakowych, gdyż odpowiada za aktywację apoptozy. Komórka, która ma wszelkie predyspozycje aby doprowadzić do dalszego rozwoju nowotworu musi szybko pozbyć się p53. Odbywa się to na kilku poziomach.


- Zmiany genu kodującego p53

Gen kodujący p53 jest zmutowany w ponad połowie wszystkich rodzajów nowotworu. Mutacja ta jest nieco inna niż w przypadku pozostałych białek zmutowanych w komórkach rakowych. Przeważnie zmiany w takich białkach są bardzo szerokie np. delecja fragmentu genu lub mutacja typu „frame shift”. Białko takie jest niezdolne do pełnienia jakiejkolwiek funkcji. Natomiast w przypadku p53 jest to mutacja punktowa i polega na substytucji kilku par zasad. Wynikiem mutacji jest białko, które ma zmienione najważniejsze aminokwasy odpowiadające za wiązanie DNA. Tak więc mutacja ta jest dość „skromna”, a jednocześnie zupełnie wystarczająca aby dezaktywować p53. Tetramery, w skład których wchodzi chociaż jeden zmutowany polipeptyd p53 są niezdolne do wiązania DNA. 

- Mutacje czynników regulujących p53

Defekty w działaniu p53 w komórkach nowotworowych są również wynikiem mutacji regulatorów p53. Najprostszym przykładem jest zmutowany MDM2, który łączy się z p53 uniemożliwiając jego pracę. Defekt polega na zmianie sposobu regulacji ilość MDM2, którego jest znacznie więcej niż powinno być w zdrowych komórkach. Tak więc p53 jest całkowicie przyblokowany przez MDM2. Podobny mechanizm dezaktywacji p53 polega na mutacji białka ARF, które w zdrowych komórkach hamuje działanie MDM2.


Działanie p53 i jego regulacja to tematy niezwykle ciekawe, które są uważnie analizowane przez naukowców. Aktywność tego białka jest wyraźnie limitowana w komórkach nowotworowych. Spadek aktywności p53 jest obserwowany w 50-55% ludzkich nowotworów. Terapia związana z przywróceniem aktywności p53 jest bardzo obiecująca, lecz trudności polegają na nieznajomości wszystkich powiązań czynników apoptotycznych. 

Splicing, składanie genu, wycinanie intronów - usunięcie intronów (sekwencji niekodujących) i połączenie egzonów (sekwencji kodujących) z prekursorowego mRNA organizmów eukariotycznych. Proces ten zachodzi podczas obróbki posttranskrypcyjnej po to, by dojrzały mRNA, przygotowany do translacji, kodował ciągły łańcuch polipeptydowy (od kodonu start do stop). Splicing katalizowany jest przez kompleks białek i RNA zwany spliceosomem. W niektórych przypadkach następuje samowycinanie się intronów, bez udziału spliceosomu, funkcję katalityczną pełni wówczas RNA (rybozym).

Wycinanie intronów przez spliceosom [edytuj]

Intron, by podlegał poprawnemu wycięciu, musi posiadać sygnały: sekwencję GU na końcu 5' i sekwencję AG nakońcu 3' (dla spliceosomu klasycznego, odpowiedzialnego za przeważającą większość reakcji wycinania intronów, natomiast dla spliceosomu alternatywnego odpowiednio AU i AC) oraz tzw. miejsce rozgałęzienia, w którym znajduje się nukleotyd adeninowy (A). Podczas reakcji splicingu sekwencje sygnałowe są rozpoznawane przez wchodzące w skład spliceosomu małe jądrowe RNA (snRNA), które tworzą komplementarne połączenia RNA-RNA z obszarami terminalnymi i miejscem rozgałęzienia intronu. Splicing dokonywany przez spliceosom oraz samowycinanie zaczynają się od ataku grupy 2'OH nukleotydu adeninowego z miejsca rozgałęzienia na pierwszy nukleotyd intronu (koniec 5'), co powoduje powstanie pętli. Następnie grupa 3'-OH uwolnionego egzonu atakuje ostatni nukleotyd intronu na końcu 3', dzięki czemu egzony się łączą i uwalniany jest intron w formie lassa[1].

Samowycinające się introny [edytuj]

Samowycinanie intronów odbywa się bez udziału spliceosomu, kiedy sam intron pełni funkcję rybozymu. Istnieje kilka grup samowycinających się intronów. Reakcja autokatalitycznego splicingu z udziałem intronów grupy I rozpoczyna się od ataku guanozyny (pochodzącej z intronu lub z wolnego kofaktora) na miejsce splicingowe 5'. Dla intronów grupy II pierwszym etapem reakcji jest atak grupy 2'hydroksylowej adenozyny pochodzącej z intronu na miejsce splicingowe 5'. Następnie grupa 3'OH egzonu na końcu 5' atakuje miejsce splicingowe na końcu 3', i egzony się łączą[2]. In vivo do zajścia reakcji samowycinania się wielu intronów potrzebne są dodatkowe białka, np. kodowane przez introny maturazy. Niektóre introny grupy II mogą funkcjonować jak transpozony, integrując do pozbawionych intronów alleli swojego genu[3].

Splicing alternatywny [edytuj]

 Osobny artykuł: Splicing alternatywny.

Splicing alternatywny to łączenie ze sobą różnych egzonów, niekoniecznie po kolei (według genu), albo z pominięciem niektórych, a niektóre introny nie są usuwane. W ten sposób z jednego genu może powstać więcej niż jedna cząsteczka mRNA, co jest źródłem zmienności białek. Rekord należy do genu Dscam Drosophila melanogaster, który ma 38 000 wariantów splicingowych[4]. Ocenia się, że od 35 do 75% ludzkich genów podlega alternatywnemu splicingowi[5].

Choroby związane z zaburzeniami splicingu [edytuj]

Zaburzenia splicingu mogą być przyczyną chorób. W dystrofii miotonicznej zmutowany RNA gromadzi się w komórkach, zaburzając splicing innych mRNA, co powoduje objawy choroby[6]. Podobnie niektóre postacie retinopatii barwnikowej związane są z zaburzeniami splicingu[7].

Operon tryptofanowy - operon kodujący enzymy potrzebne do syntezy aminokwasu - tryptofanu. Składa się z operatora, promotora i pięciu genów struktury.

Represor operonu tryptofanowego, kodowany przez gen trpR, jest produkowany w sposób ciągły. Gdy w komórce brak jest tryptofanu represor pozostaje nieaktywny i nie blokuje on transkrypcji genów struktury. W komórce występuje w postaci dimerów. Gdy stężenie tryptofanu w komórce wzrasta, jego cząsteczki łączą się z nieaktywnym represorem. Następuje wówczas zmiana konformacji represora, dzięki czemu staje się on aktywny (tryptofan jest tu korepresorem). Aktywny represor blokuje operator, co uniemożliwia związanie się polimerazy RNA z DNA i prowadzenie transkrypcji genów operonu tryptofanowego (jest to więc system reprymowalny). Stan taki utrzymuje się tak długo, aż stężenie tryptofanu w komórce się zmniejszy. Tryptofan jest stale potrzebny w komórce, zatem kiedy go zabraknie, nieaktywny represor nie wiąże się z operatorem, dzięki czemu geny operonu tryptofanowego ulegają transkrypcji.


Wyszukiwarka