LABORATORIUM Z BIOCHEMII.
Ćwiczenie nr.8
„Ochrona Środowiska”
Grupa dziekańska nr. II
Czwartek godz.: 16:15-20:00
Grupa:
Maciej Kurzyk
Magdalena Kołuda
Jacek Bogdański
Temat: Oksyreduktazy.
Uwagi: ______________
Ocena: ______________
Wstęp - teoria.
Oksydoreduktazy katalizuja przeniesienie równowa_ników redukcyjnych miedzy
dwoma układami redoks. Termin równowa_nik redukcyjny okresla kombinacje elektronów i
protonów, które pojawiaja sie w procesach redoks
Procesy oksydacyjno-redukcyjne w komórkach zachodza we wszystkich przedziałach
subkomórkowych (cytozolu, wewnetrznej błonie mitochondriów, w błonie tylakoidów, błonach siateczki sródplazmatycznej, błonie jadrowej, a tak_e w przestrzeni miedzykomórkowej). Procesy te sa katalizowane przez enzymy współdziałajace z rozpuszczalnymi (koenzymy) lub
zwiazanymi z białkiem enzymatycznym (grupy prostetyczne) kofaktorami. Najwa_niejszymi
kofaktorami oksydoreduktaz sa: NAD+, NADP+, FMN, FAD, ubichinon (koenzym Q), plastochinon,plastocyjanina, lipoamid, hem oraz kilka rodzajów centrów żelazowo-siarkowych.
Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD+) oraz jego forma ufosforylowana - fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP+), koenzymy przenoszace jony wodorkowe (2e- i 1H+), wykorzystywane sa przez ponad 200 oksydoreduktaz. W utlenionej formie tych koenzymów w pierscieniu aromatycznym amidu kwasu nikotynowego dodatnie ładunki sa zdelokalizowane. Jedna z dwóch przechodzacych w siebie struktur ma w
położeniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom wegla. W to
miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworzac zredukowane formy NADH-H+ i
NADPH-H+. Poprawny zapis zredukowanych koenzymów pokazuje, że przyjeciu jonu wodorkowego przez koenzym towarzyszy uwolnienie protonu.
Powstawanie nadtlenku wodoru (H2O2) w komórce:
W komórce nadtlenek wodoru powstaje w wielu różnych reakcjach. Jednym z jego źródeł
jest reakcja katalizowana przez dysmutaze ponadtlenkowa - enzym usuwajacy aniony
ponadtlenkowe zgodnie z reakcja:
O-2 + O-2 + 2H+ → H2O2 + O2
Anion ponadtlenkowy (O-2) jest produktem ubocznym wielu reakcji redoks powstajacym w
wyniku czesciowej redukcji tlenu czasteczkowego (przyjecie jednego elektronu). W komórkach roslin aniony ponadtlenkowe powstaja np. jako produkty uboczne przepływu elektronów przez centra żelazowo-siarkowe (reakcja Mehlera) w obrebie fotosystemu I, czy w reakcji katalizowanejprzez oksydaze NADPH.H+ zlokalizowana w błonie komórkowej, gdzie aktywne formy tlenu służą do obrony przed patogennymi drobnoustrojami.
Ważnymi enzymami wytwarzajacymi H2O2 sa tak_e oksydazy flawoproteinowe, do
których nale_a m. in. oksydazy L-aminokwasowe i D-aminokwasowe. Utlenianie aminokwasu przebiega zgodnie z reakcja:
aminokwas + O2 + H2O → ketokwas + H2O2 + NH3
W komórkach zwierzat H2O2 powstaje tak_e w peroksysomach w reakcji utleniania
kwasów tłuszczowych o dłuższym niż 18C łancuchu weglowodorowym. W tym wypadku szlak -oksydacji, podobnie jak utlenianie kwasów tłuszczowych u roslin, rozpoczyna sie od reakcji katalizowanej przez oksydaze acylo-CoA zgodnie z równaniem:
acylo-CoA + O2 → Δ2-enoilo-CoA + H2O2
Bogatym zródłem H2O2 w komórkach roslin jest szlak przemian okreslany jako fotooddychanie. Enzym „rubisco” (karboksylaza/oksygenaza rybulozo-1,5-bisfosforanu) może do rybulozo-1,5-bisfosforanu przyłaczac CO2 lub O2. W pierwszym wypadku powstaja 2 czasteczki kwasu 3-fosfoglicerynowego, natomiast w reakcji, w której zamiast CO2 uczestniczy O2 powstaje 1 czasteczka kwasu fosfoglicerynowego i 1 czasteczka kwasu 2-fosfoglikolanowego. Powstajacy w chloroplastach 2-fosfoglikolan jest najpierw defosforylowany, a nastepnie powstający glikolan w peroksysomach zostaje utleniony przez oksydaze glikolanowa do glioksalanu zgodnie z reakcja:
glikolan + O2 → glioksalan + H2O2
Nadtlenek wodoru jest zwiazkiem szkodliwym, głównie ze wzgledu na możliwosc powstawania w obecnosci Fe2+ rodników hydroksylowych .OH, a tak_e tlenu singletowego 1O2. Enzymatyczne usuwanie H2O2 Enzymami funkcjonującymi w usuwaniu H2O2 sa katalaza i peroksydaza. Katalaza, enzym zawierający hem, dysproporcjonuje dwie cząsteczki H2O2 do H2O i O2 zgodnie z równaniem:
2 H2O2 → 2H2O + O2
Katalazy moga także wykazywać aktywność peroksydacyjna, w której H2O2 jest wykorzystywany do utleniania alkoholi, aldehydów, fenoli czy azotynów.
Peroksydazy redukują nadtlenek wodoru równocześnie utleniając (odwodorowujac)
różne substraty. Reakcje katalizowana przez peroksydazy można zapisać:
SH2 + H2O2 → S + 2H2O
SH2 i S to, odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym. Grupa prostetyczna
peroksydaz roślinnych jest _elazoprotoporfiryna (hemina), natomiast enzymy zwierzęce zawieraja inny typ heminy. Ważna funkcje ochronna w komórkach zwierząt i roślin spełnia peroksydaza glutationowa współdziałająca z glutationem w usuwaniu nadtlenku wodoru i szkodliwych nadtlenków organicznych. W centrum aktywnym tego enzymu występuje analog cysteiny (selenocysteina), w którym siarka została zastąpiona selenem.
Oksydazy fenolowe - przenoszą elektrony i protony z orto- lub para-dwufenoli na tlen. Oksydaza o-dwufenolwa poza utlenianiem o-dwufenolu katalizuje także reakcje hydroksylacja.
Oksydaza cytochromowa (EC 1.9.3.1) - końcowe ogniwo łańcucha transportu elektronów
zlokalizowanego w wewnętrznej błonie mitochondriów. Łańcuch oddechowy katalizuje transport elektronów z NADH-H+ lub zredukowanego ubichinonu na tlen cząsteczkowy. Ubichinon może być redukowany enzymatycznie w reakcjach, w których np. utleniany jest bursztynian bądź flawoproteina (ETF) redukowana przez dehydrogenaze acylo-CoA, dehydrogenaze 3-fosfoglicerynianu lub dehydrogenazy utleniające choline czy dihydroorotan.
Większą część energii towarzysząca reakcjom redoks wykorzystywana jest do formowania w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej gradientu protonowego, który z kolei napędza syntezę ATP katalizowana przez syntaze ATP. Łańcuch oddechowy obejmuje 3 białkowe kompleksy (kompleks I, III i IV) oraz dwie cząsteczki przenośnikowe:
ubichinon (Q) i cytochrom c. Poza tym, z błona wewnętrzną związana jest dehydrogenaza bursztynianowa (kompleks II) oraz inne dehydrogenazy przekazujące elektrony
na ubichinon (Q).
Wykonanie ćwiczenia. Wnioski.
I. Analiza jakościowa.
Celem doświadczenia jest stwierdzenie obecności w analizowanym surowcu trzech enzymów oksyreduksyjnych: oksyreduktazy o-difenolowej, peroksydazy i katalazy . Polega to na zmieszaniu ekstraktów z odpowiednimi substratami. Obserwowane efekty zachodzących reakcji wskażą obecość danego enzymu.
Oznaczenie.
Przygotowujemy ekstrakt enzymatyczny 200cm3 z brukselki według przepisu .
W 6 probówkach umieszczamy po 2 cm3 ekstraktu enzymatycznego i do każdej probówki dodajemy po 3cm3 wody destylowanej, natomiast w dwóch probówkach (7 i 8) umieszczamy po 5 cm3 wody destylowanej.
Nr. Probówki |
Próba |
Oznaczany enzym |
Wynik analizy |
Opis próby |
1. |
Ekstrakt |
|
|
Jasno zielony kolor |
2. |
Ekstrakt + katechol |
Oksydaza |
+- |
Kolor o ton ciemniejszy od barwy ekstraktu |
3. |
Ekstrakt + pirogarol |
|
+- |
|
|
|
|
|
|
4. |
Ekstrakt + katechol+ H2 O2 |
Peroksydaza |
+++ |
Ciemno brunatna barwa; |
5. |
Ekstrakt + pirogarol +H2 O2 |
|
++ |
|
6. |
Ekstrakt + H2 O2 |
Katalaza |
+++ |
Wydzielają się pęcherzyki gazu |
7. |
Woda + katechol |
Próby odczynnikowe |
- |
Próba bezbarwna |
8. |
Woda + pirogarol |
|
- |
|
Zabarwienie ekstraktu w probówkach 1 i 2 świadczy o obecności w ekstrakcie z brukselki oksydazy o-difenolowej. Intensywniejsze zabarwienie prób w probówkach 4i 5 swiadczy o obecności w ekstrakcie również peroksydazy . Wydzielające się w probówce 6 pęcherzyki powietrza świadczą o obecności katalazy.
II. Analiza ilościowa
Oznaczanie aktywności katalazy
Zasada oznaczania katalazy : odmiareczkowujemy polega na odmiareczkowniu za pomocą KMNO 4 w środowisku H2SO4 nierozłożonego przez katalazę H2 O2 .
KMNO4 + 5 H2 O2 + 4 H2SO4 ------> 2 KHSO4 + 2 MnSO4 + 8H2O2 + 5 O2
Oznaczenie.
W dwóch kolbach stożkowych o pojemności 200 cm3 umieszczamy 5 cm3 ekstraktu enzymatycznego i po 25 cm3 wody destylowanej . Do jednej z kolb służącej do przygotowania proby właściwej dodajemy 3 cm3 1% H2O2 i prowadzić reakcję rozkładu nadtlenku wodoru pod wpływem katalazy dokładnie 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do tej kolby dodać 5 cm3 10% H2SO4 co powoduje inaktywacje enzymów i przerwanie reakcji enzymatycznego rozkładu H2O2 . Do drugiej kolby służącej do przygotowania próby odniesienia dodać najpierw 5 cm3 10% H2SO4 celem inaktywacji enzymów a następnie 3 cm 1% H2O2.
Obie próby miareczkujemy 0,1 M KMnO4 do słabo zanieczyszczonej barwy nie znikającej w ciągu 30 sek.
Różnica objętości 0,1 M KMnO4 zużytego do miareczkowani próby odniesienia i próby właściwej odpowiada ilości H2O2 rozłożonego pod wpływem katalazy.
Aktywność Katalazy w analizowanym produkcie:
CAT [U/g] = (a-b)*Vekst*c/ Venz*mprod*t
a - ilość 0,1 m KMnO4 zużyta do miareczkowania próby odniesienia [cm3]
b - ilość 0,1 m KMnO4 zużyta do miareczkowania próby właściwej [cm3]
Vekst -całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego
Venz - objętość ekstraktu enzymatycznego pobrana do oznaczania
c - miano KMnO4 równe 250
t - czas reakcji
m prod -naważka produktu 10g z której uzyskano 200 cm3 ekstraktu
Oznaczanie aktywności peroksydazy.
Oznaczenie aktywności peroksydazy polega na spektrofotometrycznym oznaczaniu barwnych produktów utleniania gwajakolu przez nadtlenek wodoru w obecności peroksydazy. Oznaczenie polega na pomiarze przyrostu absorbancji o 0,1 w czasi 1 min w warunkach prowadzenia oznaczenia .
Próba kontrolna: |
Próba właściwa : |
Bufor fosforanowy 5 cm3 Roztwór gwajakolu 1 cm3 Ekstrakt enzymatyczny 1 cm3
|
Bufor fosforanowy 5 cm3 Roztwór gwajakolu 1 cm3 Ekstrakt enzymatyczny 1 cm3 H2O2 12.3 mM 2krople
|
Aktywność POD [U/g] = ΔA*Vekst / 0,1*Venz*mprod
Aktywność zbadana w naszej próbie = 56,7
ΔA - przyrost absorbancji w czasie 1 min (A1min - A0)
Vekst -całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego
0,1 współczynnik przeliczeniowy jednostki aktywności
Venz - objętość ekstraktu enzymatycznego pobrana do oznaczania
m prod -naważka produktu 10g z której uzyskano 200 cm3 ekstraktu
Wyniki Analizy ilościowej.
Aktywności katalazy i peroksydazy w analizowanych surowcach. |
|||
L.p. |
Produkt |
Aktywność enzymatyczna [U/g] |
|
|
|
Katalaza |
Peroksydaza |
1. 2. 3. 4. |
Brukselka |
A 1. 956,7 2. 950,0 B 3. 777,1 Śr. 953,3
|
Śr 56,7 |
1. 2. 3. 4. |
Kapusta Włoska |
A 1. 553,3 2. 580,0 3. 630 4. 553,4 Śr 579,2 |
1. 22 2. 20 3. 17 4. 38 Śr 19,7 |
Wyniki świadczą o tym, iż aktywność peroksydazy w kapuście włoskiej jest dwukrotnie mniejsza niż w brukselce. Wyniki katalazy są za to odwrotne do peroksydazy gdyż praktycznie dwukrotnie razy większą ilość zawiera brukselka.