Wojciech Kluźniak Szczecin, dnia 18-01-10

Grupa 2b/ rok IV/ Biotechnologia

Ćwiczenie laboratoryjne nr 5

Konspekt

Temat: Amplifikacja DNA badanych materiałów roślinnych przy zastosowaniu techniki RAPD-PCR

Cel ćwiczeń: Ocena losowej zmienności badanych linii wsobnych oraz ich mieszańców F1

Istota zastosowanej metody badawczej:

RAPD - jest to metoda losowej amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA, wykorzystywana w analizie podobieństwa szczepów drobnoustrojów.

W metodzie tej stosuje się jeden losowo dodany starter oligonukleotydowy (10 lub 20 nukleotydowy, o dużej ilości zasad G i C).

Dwa pierwsze cykle amplifikacji przeprowadza się w stosunkowo niskiej temperaturze przyłączania startera (Ta = 35-450C), co umożliwia hybrydyzację startera do sekwencji matrycowych, nie będących w 100% homologicznymi.
Kolejne cykle amplifikacji (ok. 30-40) zachodzą przy właściwej dla startera Ta.

Ponieważ DNA różnych szczepów różni się między sobą, po rozdzieleniu na żelu uzyska się wzór prążków charakterystycznych dla każdego ze szczepów analizowanych.
Podobieństwo wzorów uzyskanych w tym teście pozwala na ocenę pokrewieństwa badanych szczepów.

Amplifikacje PCR badanych materiałów przeprowadzono w oparciu o niżej zamieszczony protokół - skład mieszaniny reakcyjnej.

Matryca DNA:

1. OT-1-3

2. 153/79xOT1-3

3. 153

4. OT 0-6

5. OT-0-6xOT1-3

6. OT-1-3

	x1 [μl]	x8 [μl]	x6 [μl]
H2O	9	72	432
10x bufor	2,5	20	120
MgCl2	2,5	20	120
dNTPs	2,5	20	120
Primer	5	40	---
DNA	2	---	---
Taq BC	1,5	12	72
suma			864

864 : 6 = 144 μl do każdej z 6 probówek

144: 8 = 18 μl

Do każdej z próbek dodano 18 μl (mixu) + 5 μl (primer) + 2 μl (DNA) = 25 μl

Elektroforeza produktów PCR i krótkie omówienie wyników analiz:

153/79-1 F1 Ot1-3 Ot0-6 F1 Ot1-3

Podsumowanie/Wnioski

Na żelach możemy zauważyć zestawy różnych długości prążków, przez co możemy określić, że dane osobniki różnia się między sobą.

---