Szybkie metody mikrobiologicznej analizy żywności.

Metody ilościowego oznaczania drobnoustrojów:

Bezpośrednie:

1. JTK, NPL

2. pomiar elektroniczny

3. DEFT

4. HGMF

Pośrednie:

1. oznaczanie biomasy, białka, DNA

2. oznaczanie ATP

3. metody wykorzystujące pomiar parametrów elektrycznych

4. oznaczanie testem LAL

Metody identyfikacji drobnoustrojów:

1. klasyczne

2. nowe:

- szeregi identyfikacyjne

- nowe podłoża i zestawy

- zestawy immunologiczne

- metody oparte o budowe DNA i geny

rolnictwo:

uprawa: mikrobiologia gleby, fitopatologia

hodowla: mikrobiologia weterynaryjna

przetwórstwo:

mikrobiologia żywności

przechowalnictwo:

mikrobiologia przemysłowa

konsumpcja:

higiena: mikrobiologia żywności

Norma mikrobiologiczna musi definiować:

- minimalną ilość produktu, która ma być poddawana analizie

- maksymalną dopuszczalna ilość ogólnej liczby drobnoustrojów i/lub grup wskaźnikowych

- ilość produktu w którym NIE mogą występować patogenne drobnoustroje (Salmonella, Schigella) nieobecne w 25g

- metody analizy: aparatura, sposób rozdrobnienia, stosowane podłoża, temperatura, czas inkubacji, metodę identyfikacji…

Najważniejsze skróty dotyczące normalizacji:

ICMSF - Międzynarodowa Komisja Mikrobiologicznej Standaryzacji Żywności

ISO - Międzynarodowa organizacja Normalizacyjna

EN - Europejska Norma

PN - Polska Norma

BN - Branżowa Norma

ZN - Zakładowa Norma

PCBC - Polskie Centrum Badań i Certyfikacji

PCA - Polskie Centrum Akredytacji

CBJW - Centralne Biuro Jakości Wyrobów

IPMiT - Instytut Przemysłu Mięsnego i Tłuszczowego

PKN - Polski Komitet Normalizacyjny

CEN - Europejski Komitet Normalizacyjny

Centralne Biuro Jakości

Polskie Centrum Badań i Certyfikacji - 01.01.1994.

28.04.2000r zostało podzielone na PCBC i PCA

PCBC - certyfikuje

PCA - akredytuje

Inne skróty:

CENELEC - Europejski Komitet Normalizacyjny Elektrotechniki,

EAC - Europejska Organizacja Jednostek Akredytujących i Jednostki Certyfikujące

EOQ - Europejska Organizacja Jakości

EUROLAB - Forum wymiany Doświadczeń

IQNet - Międzynarodowa sieć Certyfikująca w Systemie Jakości

EQNet - Międzynarodowa sieć Certyfikująca

EN 45001: 1989 pkt 5.4.2. System Jakości, Księga Jakości -

EAL - Europejska Organizacja Jednostek Akredytujących

POLLAB - polska gałąź EUROLAB

PCBC:

- organizuje i nadzoruje system badań i certyfikacji

- certyfikuje systemy jakości dostawców

- certyfikuje audytorów

- organizuje szkolenia i doskonalenia kadr na potrzeby badań i certyfikacji

PCA:

- akredytuje laboratoria badawcze

- akredytuje jednostki certyfikujące

- kontroluje działalność akredytowanych lub badawczych jednostek certyfikujących

- organizuje szkolenia i doskonalenia kadr na potrzeby badań i certyfikacji.

Schemat badania ogólnego:

Badania mikroskopowe

Badania ilościowe

Badania jakościowe

Badania dodatkowe

Interpretacja wyników

Badania mikroskopowe:

1. wykazanie skażenia we florze produkcyjnej

2. wstępne oznaczenie ogólnej liczby drobnoustrojów

3. oznaczenie liczby drożdży

4. szybkie sprawdzenie proporcji drobnoustrojów przy procesach mieszanych

5. jako szybki test wstępny przy dojrzewaniu mleka na obecność bakterii z rodzaju Mycobacterium

6. w badaniach cytologicznych mleka

7. w badaniu wody na obecność pasożytów

Badania ilościowe:

1. oznaczenie ogólnej liczby bakterii

2. oznaczenie ogólnej liczby drożdży i pleśni

3. oznaczenie liczby drobnoustrojów z grup wskaźnikowych

4. oznaczenie liczby bakterii z grup fizjologicznych (proteolitycznych, amylolitycznych, lipolitycznych)

Badania jakościowe:

1. selektywne poszukiwanie patogenów (izolacja i identyfikacja)

2. izolacja i identyfikacja składników flory niepatogennej (korzystnej, pożądanej) lub patogennej (niekorzystnej, niepożądanej) w danym procesie konsumpcyjnym

Badania dodatkowe:

1. badania fizyko-chemiczne (np. test pasteryzacji)

2. badania organoleptyczne

3. inne

Grupy wskaźnikowe:

1. bakterie z grupy coli→ coliformy - Escherichia coli

2. enterokoki kałowe→ enterokoki z grupy D - Enterococcus fecalis

3. clostridia redukujące siarczyny - Clostridium perfringens

4. gronkowce Staphylococcus aureus

5. pleśnie i grzyby

coliformy - bakterie z grupy coli typu kałowego - Escherichia, Citobacter, Enterobacter, Klebsiella (Seratia), są one zdolne do fermentacji laktozy z wydzieleniem gazu w 44ºC

enterokoki= dawne streptokoki z grupy D - Enterococcus faecalis, Enterococcus liquefaciens, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus bovis, Enterococcus equinus

Podłoża dla:

- coli: PCPL do oznaczania grup wskaźnikowych, BLBVB - bulion laktozowy z żółcią i zielenią brylantową, podłoże Schuberta, fluorocalty Brylla,

- streptokoki: podłoże Rotha, Lickiego

- clostridium: podłoże Wintsona-Blura, agar TSC (tryptoza,siarczyn, cykloseryna)

- gronkowca: Giolitti - Cantoni

- pleśnie i drożdże: agar ziemniaczany wzbogacony antybiotykiem

Najważniejsze patogenny związane z żywnością

Salmonella

Schigella

Escherichia coli (enteropatogenne)

Yersinia

Vibrio

Campylobacter

Staphylococcus aureus

Clostridium perfringens

Clostridium botulinum

Brucella

Listeria

Mycobacterium tuberculosis

Bacillus cereus

Grzyby:

Aspergilus flavus

Aspergillus parasiticus

Penicillium viridicatum

Fusarium

Phitomyces

Ogólny klucz identyfikacji bakterii ważnych w dziedzinie żywności

1. Ziarniaki G+

Katalazo-dodatnie - zgrupowane w grona: Staphylococcus, Micrococcus

Katalazo-ujemne - zgrupowane w łańcuszki: Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus

2. Pałeczki i laseczki G+

Zarodnikujące:

Katalazo-dodatnie, tlenowce: Bacillus

Katalazo-ujemne, beztlenowce: Clostridium

Niezarodnikujące:

Katalazo- dodatnie: Corynebacterium, Propionibacterium, Brevibacterium, Streptomyces, Mycobacterium

Katalazo-ujemne: Lactobaclillus

3. Pałeczki i coccopałeczki G-

Oksydazo-dodatnie: Pseudomonas, Acetomonas, Gluconobacter, Vibrio, Brucella

Oksydazo-ujemne: rodzina Enterobacteriaceae

Metody bezpośrednie oznaczania ilości drobnoustrojów:

- klasyczne oznaczanie ilości JTK i NPL

- liczenie komórek w wyskalowanych objętościowo komorach

- elektryczny pomiar ilości drobnoustrojów

- DEFT

- HGMF

- cytometria przepływowa

JTK - Jednostka Tworząca Kolonię (CFU)

NPL - Najbardziej Prawdopodobna Liczba (MPN)

Przygotowanie do badania:

- przygotowujemy co najmniej 4 rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach (hodowla na agarze)

- liczymy trzy lub dwa rozcieńczenia

- liczba koloni 30-300

- wynik podajemy na 1g lub 1ml

NPL - oznaczenie w podłożach płynnych

- 3 lub 5 powtórzeń, kilka rozcieńczeń

- wynik odczytujemy z odpowiedniego klucza

Firma 3M produkuje Petrifilmy Plater

- analiza produktu

- analiza środowiska

trzy etapy:

1. inokulacja

2. inkubacja

3. odczyt

Różne płytki dla odpowiednich drobnoustrojów:

- Rapid Coliform

- High- Sensivity Coliform

- Escherichia coli & Coliform

- drożdże i pleśnie

- Coliform

- Enterobacteriaceae

- ogólna liczba

Budowa Petrifilmu:

- górna warstwa: plastik

taśma adhezyjna ze wskaźnikiem

żel rozpuszczalny na zimno

- dolna warstwa: składniki podłoża

taśma adhezyjna

plastik zgrzany do kratkowanej bibuły

Trwałość takich Petrifilmów to 12 m-cy i 18 m-cy, są bardzo dokładne.

HYGICULT - szybki dokładny test stanu higienicznego, są to szpatułki pokryte obustronnie podłożem

Nakłada się go przez: odcisk, nałożenie, zanurzenie.

Wyniki są szacunkowe, porównujemy je z kluczem.

Podłoża:

- ogólna liczba bakterii

- Enterobacteriaceae

- glukoronidaza

- drożdże i pleśnie

Gotowe zestawy do Monitorowania Higieny:

- Higicult, cult-Dip - mniej dokładne

- Envirocheck Contect

- Płytki Rodac

- Pertifilm

- Readycult

Mikrobiologiczny Próbnik Powietrza MAS 100

Stosowany jest do gotowych płytek Pertiego i samodzielnie wykonanych. Wymusza się obieg powietrza. Różna kalibracja przepuszcza 1000l powietrza w ciągu 10min. Można opóźnić włączenie pompy np. o 1godz. Małe urządzenie.

Licznik elektroniczny - stosowany do liczenia białych i czerwonych ciałek krwi

Budowa:

Są dwie elektrody oddalone od siebie. Malutki otwór umożliwia przejście cząsteczek do 30*m. gdy taka cząsteczka przejdzie z komory do komory wywołuje zmianę napięcia. Ruch komórek wywołany jest próżnią. Aparat ten nie nadaje się do grzybów strzępkowych (bo komórka się ciągnie zakłócając sygnał), nadaje się tylko do czystych kultur bakterii i drożdży.

System sterowniczy:

Aparat wytwarzający próżnię →aparat pomiarowy → komputer →ekran →drukarka

Aparatu nie stosuje się do mikrobiologicznej analizy żywności.

DEFT - Direct Epifluorescent Filter Technique

DEFT jest kombinacją metody filtracji membranowej (koncentracja mikroorganizmów) z mikroskopią fluorescencyjną (wizualizacje pojedynczych komórek wybarwionych fluorochromami). Metoda bardzo szybka, 30 min, zdecydowanie lepsza od metod wzrostowych.

Epifluorescencja - fluorescencja odbita

1. przygotowanie próbki w zależności od rodzaju próbki wcześniej trzeba ją odpowiednio przygotować, np. przy mleku dajemy enzym bakteriotrypsyna, różnie jest przy próbkach roślinnych.

2. filtracja- próbkę dajemy do wiezy filtracyjnej w niej są membrany poliwęglanowe, przesączamy próbkę.

3. barwienie i przemycie membrany. Tu dajemy oranż akrydyny na m,membranę nie do probówki.

4. liczenie drobnoustrojów. Membrany umieszczamy pod mikroskopem i liczymy. Liczenie bakterii o pomarańczowej fluorescencji.

Liczba liczonych pól widzenia	Średnia liczba grupek 1 polu widzenia
15	0-10
10	11-15
6	26-50
3	51+75
2	76-100
Analizę powtarzamy	Powyżej 100

Współczynnik mikroskopu= powierzchnia membrany filtracyjnej (mm²)/ powierzchnia pola mikroskopu (mm²) x objętość próbki (ml).

Uciążliwe jest liczenie. Teraz liczenie odbywa się na komputerze.

Zalety stosowania DEFT:

1. szybka (30min jedno oznaczenie)

2. czuła - pozwala oznaczyć nawet <1komórkę/ml

3. dokładna - korelacja z oznaczeniami wykonanymi innymi metodami

4. niski koszt oznaczenia 1 próbki

5. łatwa do wykonania - akceptowana przez personel

6. zautomatyzowana i skomputeryzowana wersja DEFT (Cobra 2024) jednoczesna obróbka 24 próbek.

Zastosowanie:

- oznaczenie liczby zanieczyszczających mikroorganizmów w piwie, wodzie, popłuczynach, mleku, oznaczenie pleśni

- poprawę zróżnicowania komórek żywych i martwych w filtrowanych próbkach browarniczych osiągnięto:

- stosując w procedurze z oranżu akrydyny dodatkowy barwnik - siarczyn berberysy

- stosując inne barwniki fluorescencyjne (błękit aniliny, pochodne tetrazoliowe)

Wada:

- nie odznaczymy martwych i żywych komórek

HGMF

Hydrofobowe kratkowe filtry

Płytka Petriego, membrana przez którą filtruje się produkt. Kratki tworzą się przez hydrofobowe właściwości membrany.

Najbardziej prawdopodobna liczba jednostek tworzących wzrost

MPNGU =

NPLJW

N- liczba kratek w HGMP

x- pozytywne kratki (wzrost)

zasady liczenia:

1. pozytywne <200 - liczymy wszystkie

2. b) pozytywne w 50% liczymy 8 środkowych kolumn i mnożymy x5 (8x40x5=1600)

3. pozytywne - przewaga duża - liczymy negatywne

metoda ta wychodzi z użycia.

Cytometria przepływowa

Ma zastosowanie w piwowarstwie, służy do badań bezpośrednich a także badań interpretacji.

Cytometria przepływa oparta jest o trzy układy:

- hydrauliczny

- optyczny

- informatyczny

Moldovan w 1934 r zlicza komórki przepływające w kapilarze i ma problemy z jednolitym przepływem.

W 1953 r opracowano technikę „strumień w trumieniu”

Komentsky w 1960 r wykorzystuje absorbancje DNA.

Niektóre parametry komórkowe mierzone przez CP:

- strukturalne: bez barwienia: ziarnistość cytoplazmy

zawartość pigmentów (np. hemoglobiny)

fluorescencja białek (tryptofan)

z barwieniem: zawartość DNA i RNA

struktura chromatyny

zawartośc białka tłuszczu

obecność antygenów

ergosterol

zawartość Ca²⁺

- funkcjonalne: bez barwienia: stany redox

z barwieniem: przepuszczalność błony komórkowej

aktywność enzymów

receptory

potencjał komórkowy i pH

synteza DNA

Barwniki do CP:

FDA - dwuoctan fluoresceiny do pomiaru białek

CFDA - dwuoctan karboksyfluoresceiny

izotiocjanian fluoresceiny - wybarwienie białka w komórce

BCECF-AM-2,7-bis-karboksy-etylo-5,6-karboksyfluoresceino-acetoksymetylowy ester do badania białek

Rhodamina 123 rozróżnia martwe i żywe komórki, potencjał błony mitochondrialnej

DiOC6 pomiar potencjału międzybłonowego

Dihydrorhodamina 123 ukazują zmiany metaboliczne

Dichlorofluoresceina ukazują zmiany metaboliczne

Rhodamina 110 pomiar aktywności enzymów

MOECHST 33342 wybiórczo barwi obszary AT w kwasach nukleinowych

Chemichrom B

Stosuje się lampy pobudzające barwniki

Phycoerythrin (PE) długość fali 535±5nm (lamp); 488nm (Arsen laser)

Fluoresceuin isothiocynate (FILC) 480±10nm (lamp); 488nm (Arsen laser)

Metodą ta można dokładnie wyznaczyć żywe i martwe komórki, o różnym poziomie fluorescencji, widać to na wykresie w postaci szczytów.

Przyrząd pomiarowy, rejestrujący, interpretujący

Szybkość przepływu cieczy w kapilarze 10-20m/s

Możliwość liczenia od 10⁴-10⁶ komórek/min

Etapy postępowania

1. zebranie komórek - próbkę trzeba odpowiednio przygotować rozdrobnić itp.

2. barwienie fluorescencyjne - znakowanie (np. rodamina, dwuoctan fluoresceiny)

3. automatyczne pobranie i transport (zawiesiny znakowanych komórek) do punktu analizy

4. odczyt i interpretacja

Może to być metoda bezpośrednia i metoda interpretacji - ale tylko z fluoresceiną przeciwciała.

Zalety:

- szybka - czas wykonania całego testu do 30min (znakowanie komórek +odczyt)

- dobra korelacja (r=0,93-0,99) z metoda płytkową w zakresie 10⁴-10⁷ j.t.k/Ml

Wady:

- wysoki koszt kapitałowy, drogie cytometry

- specjalistyczna obsługa

Zastosowanie:

- kontrola prawidłowości przebiegu procesów biotechnologicznych (fermentacyjnych) ocena liczby, kształtu, wielkości, żywotności komórek

- oznaczenie liczby drożdży, bakterii w różnych próbkach browarniczych

- barwienie immunofluorescencyjne umożliwia identyfikację i liczenie kilku gatunków drobnoustrojów w jednym środowisku (S. cerevisiae, Schigella pomne, Lactobacillus brevis, Pediococcus damnosus).

Metody pośrednie oznaczania liczby drobnoustrojów:

- oznaczanie biomasy, białka, ilości DNA oraz innych składników komórki lub oznaczenia zawartości płynu pohodowlanego (ubytek substratu, przyrost glukozy itp.)

- oznaczenie potencjału elektrycznego komórek

- oznaczenie testem LAL

- oznaczenie ilości ATP - ważny test higieniczny

Pomiar gęstości optycznej

Aparat do hodowli drobnoustrojów mierzy ilość drobnoustrojów, wzrost, interakcje między drobnoustrojami na zasadzie absorbancji - Mikrobiology Workstation Bioscreen C - można wykonać wiele oznaczeń na jednym podłożu.

W mikrobiologii chodzi o to aby jak najszybciej wykryć złą jakość żywności, dążymy do takich metod w których pozbędziemy się złej jakości.

Pomiar elektryczny

Pierwsze badania parametrów elektrycznych robione były przez Okera i Bluma w 1910r.

R - rezystancja (opór czynny) *

Z - impedancja (opór pozorny) *

G - konduktancja (przewodność czynna) S (simens)

C - pojemność elektryczna F (farad)

U - napięcie elektryczne V

I - natężenie A

V - potencjał elektryczny V

Q - ładunek elektryczny C (kulomb)

Układ pomiarowy

Jeżeli mamy dwie próbki zerową i badaną to napięcie mierzymy przez różnicę pomiędzy nimi.

Nie wszystkie parametry elektryczne nadają się do pomiaru wszystkich grup drobnoustrojów np. dla drożdży nie nadaje się parametr - potencjał elektryczny, a tylko można mierzyć pojemność elektryczną.

W zależności od tego jakiedrobnoustroje nam rosną to czas detekcji będzie różny, wydłużony.

Mediatory - w zależności od ilości komórek i dodania mediatora to wzrost był różny i sygnał miał wyższą wartość.

Mediatorami mogą być:

- tiamina - Proteus bulgaris

- TMAO - trójaminoetylo tlenek - Alteromonas sp.

Stosowane mediatory:

Etosiarczan fenazyny: Pseudomonas aeruginosa

Lactobacillus plantarum

Żelazicyjanek potasu: Alcaligenes faecalis

Enterobacter aerogenes

Lactobacillus bulgaricus

Lactococcus lactis

Nocardia

Saccharomyces cerevisiae

Cladosporium resinae

Dichlorofenyloinolofenol: Achromobacter album

Schemat RABIT

TTD czas do wykrycia detekcji (time the detektion)

Metody oparte o pomiar wybranych parametrów elektrycznych.

Podczas wzrostu drobnoustrojów ulegają zmianie własności elektryczne podłoża:

- obniża się całkowicie impedancja (oporność przepływu prądu zmiennego przez przewodząca pożywkę)

- wzrasta konduktancja (przewodnictwo) i kapacytancja (pojemność elektryczna)

Impedymetry: aparat Malthusa (Malthus instruments GB)

Bactometr (bio Merieux F)

Zastosowanie w browarnictwie:

• zastępują próbę termostatową (czas testu ulega skróceniu z ok 3tygodni do 2-4 dni)

• określenie skażenia drożdży zarodowych bakteriami

• oznaczenie ogólnej liczby bakterii, drożdży i pleśni przy wykorzystaniu wybiórczych podłoży np. ilości Enterobacteriaceae

Zalety:

1. Redukcja czasu wykrywania drobnoustrojów:

1 komórka Escherichia coli - 9 godzin

1 komórka drożdży - 18-20 godzin

2. Możliwość różnicowania grup fizjologicznych drobnoustrojów (wybiórczość pożywki)

3. Równocześnie można analizować wiele próbek (nawet do 100 w zależności od aparatu)

4. Oszczędność materiałów i automatyczna interpretacja wyników

Wady:

1. Wysokie koszty kapitałowe (drogie urządzenia) i eksploatacyjne

2. Pewne podłoża nie nadają się do analizy elektrometrycznej (zakłócenia jonowe)

Oznaczenie	Limit elektryczny	Czas trwania badania
				Bac Trac	Płytki (JTK)
TVC (ogólna liczba drobnoustrojów)	10 JTK/g, 1JTK/ml	>10^6 6-10h 10^4 10-15h 10^2 15-20h 1 20-24h	3 dni
Drożdże i pleśnie	10JTK/g, 1JTK/ml	Max 72h	3-10dni
Coliformy	10JTK/g, 1JTK/ml	<16h	1-2dni
Enterobacteriaceae	10JTK/g, 1JTK/ml	<16h	1-2dni
Salmonella	1 komórka w 25g (+hodowla namnaż)	30-40h z namnażaniem	4-5dni
Listeria	1 komórka w 25g (+hodowla namnaż)	66h z namnażaniem	5-7dni
Clostridia	10JTK/g, 1JTK/ml	48h (C. perfringens 24h)	3-6dni
Staphylococcus aureus	1JTK/g	48h	2-4dni
Bakterie skażające piwo	1JTK/ml	Max 72h	3-7dni

Cecha	Bactometr	Bac Trac	Malthus	RABIT
Liczba testów jednocześnie	512	240	1200	512
Zakres temp ºC	18-55	4-60	5-96	15-46
Liczba kombinacji temperaturowych	8	6	5	16
Ilość typów jednostek inokulacji	1	2	3	1
Objętość próbki ml	2	5-100	2-100	2-12
Swobodne nastawienie próbek	Nie	Tak	Tak	Tak
Próbki testowe: - wielokrotnego użytku - dostępne handlowo	Nie Tak	Tak Nie	Tak Tak	Tak Nie
Pomiar	Z lub C	Z lub C	G	Z
komputer	W zestawie	W zestawie	Brak w zestawie	W zestawie

Proste metody

LAL - Lizat Amebocytów Limulus'a

W 1964r. opracowano test do wykrywania endotoksyn bakterii z rodzaju Vibrio. Aktualnie stosowany test został opracowany w 1976r. przez Sullivan'a i współpracowników.

Lizat amebocytów Limulusa jako odczynnik LAL daje dodatni test tzn żeluje głównie w obecności lipopolisacharydów (LPS) oraz z :

- β-glukanem

- peptydoglikanami (w dużych stężeniach)

- syntetycznymi dekstrynami

- karagenem

- mamnanem i dekstranem

- kwasami lipotejchojowymi

- materiałami celulozowymi (np. w hemodializatorach)

- pirogenami (np. z cukru)

- z wirusowym RNA i innymi RNA

- endotoksynami bakterii G(-)

- dużymi ilościami bakterii G(+)

Odczynnik LAL to lizat amebocytów hemolitycznych

Limus (Atlantyk)

Tachyplu (Pacyfik)

Carcinoscorpius (Pacyfik)

Mechanizm doprowadzający do żelowania odczynnika LAL, przez LPS (Nakamura i wps. 1986)

Mechanizm doprowadzający do żelowania odczynnika LAL, przez β-glukan (Morita i wsp. 1981)

Czynnik C jest procteazą serynową aktywowaną LPS, jest to glikoproteina zbudowana z 2łańcuchów białkowych.

Czułość testu LAL - autorzy Sullivan i wsp.

Można ją zwiększyć przez:

- żelowanie w mikrokapilarach

- pomiar zmętnienia

- automatyczny pomiar zmętnienia z chromogenem znakowanym I¹²⁵

Test LAL jest stosowany:

- do badania płynów ustrojowych (mocz, krew, płyn mózgowo-rdzeniowy)

- na obecność pirogenów

- w diagnostyce infekcji oczu, dróg moczowych oraz innych zapaleń

- do badania żywności w szczególności żywności pochodzenia morskiego

- do badania wody pitnej

- do badania mleka surowego i pasteryzowanego

- przy poszukiwaniu pirogenów w cukrze

Czułość testu LAL zależy od:

1. przygotowania odczynnika

2. źródła LPS (od bakterii)

3. użytej metody (detekcja żelowania, warunki inkubacji)

Aby być pewnym swoich badań:

- przeprowadzamy standaryzację odczynnika: oznaczenie czułości źródła LPS (szczep E. coli)

- wykorzystujemy udokumentowane statystyczne wyliczenia innych badaczy

- wybór należy do nas

Przykład

Badanie wody pitnej

Dodatni test: 0,7ng LPS/ml - 1,25ngLPS/ml

Metoda żelowania w 37ºC przez 70-90min

Badanie wody morskiej

Dodatni test: 0,04ngLPS/ml - 17,8ngLPS/ml

Bioluminescencja - pomiar ATP

ATP Mg²⁺ AMP+PP

Lucyferyna Lucyferaza Oksylucyferyna

O₂ CO²

Etapy postępowania:

- uwolnienie ATP z komórek do środowiska

- dodanie lucyferyny i lucyferazy

- pomiar emitowanego światła

Zaleta:

- pióro 2 w 1

- wykrywa niewidzialne resztki żywności

- łatwa obsługo

- czułość

- opatentowany system

ATP istnieje także we łzach, jest pochodzenia komórkowego ale nie musi występować tam gdzie są komórki.

Lucyferyna: C₁₁H₈N₂O₃S₂

Fotometr - najważniejszą częścia jest lustro wklęsłe które skupia światło wydzielane w czasie realizacji w jedno miejsce.

RLU - jednostka pomiarowa ATP

Stosunek ATP niemikrobiologicznego do ATP pochodzenia mikrobiologicznego

Produkt	ATP nie pochodzące z drobnoustrojów	ATP mikrobiologiczny
Mleko	15	1
Bekon	300	1
Rosół z makaronem	3500	1
Rozdrobnione mięso	12000	1
Lody	40000	1
Sok pomidorowy	∞	1

To jest test higieniczny - czystośći środowiska pracy, czystości maszyn, rąk, a nie jest testem ilości drobnoustrojów (bo niektóre produkty zawieraja bardzo dużo ATP, którego nie można odnieść do ilości drobnoustrojów)

Bioluminescencja - pomiar ATP

Zalety:

- czułość: ~1000komórek bakterii

~100 komórek drożdży

- krótki czas pomiaru ~1min

- prostota oznaczenia i interpretacji wyników

- oznaczenie możliwe do wykonania w warunkach produkcyjnych (małe rozmiary lumenometrów, gotowe zestawy odczynników- „pióra”)

- dostępność w handlu

Wady:

- nie różnicuje grup drobnoustrojów

- precyzyjne ilościowe oznaczenie drobnoustrojów możliwe tylko w przypadku czystej kultury

Zastosowanie w przemyśle spożywczym:

- monitorowanie stanu sanitarnego:

higiena stanowisk,

powierzchni urządzeń

ludzi zatrudnionych w produkcji

ocena skuteczności dezynfekcji i mycia urządzeń

- badanie skażenia piwa, wina, wody, soków.

Klasyczne metody identyfikacji

1. charakterystyka mikroskopowa (wiemy czy bakterie czy drożdże)

2. charakterystyka makroskopowa (to co na płytkach: kolor, kształt, strzepek)

3. charakterystyka biochemiczna i fizjologiczna

4. charakterystyka wegetatywnych struktur rozmnażania identyfikacja grzybów)

5. charakterystyka immunologiczna (badanie obecności antygenów na powierzchni komórki)

6. charakterystyka linotypowa (możliwość wykazania lizy komórki pod wpływem wirusa atakującego komórkę)

7. zdolności patogenne

Charakterystyka mikro- i makroskopowa - ukierunkowanie badań, identyfikujemy czy to drożdże czy bakterie G(-), G(+), to decyduje o dalszych badaniach.

Charakterystyka biochemiczna i fizjologiczna

- badanie typu energetycznego i oddechowego

- badanie metabolizmu cukrowego (badanie utylizacji alkoholi cukrowych)

- badanie metabolizmu białkowego

- badanie metabolizmu tłuszczowego (wykorzystanie źródeł azotu i tłuszczu jako źródło węgla)

- badanie ogólnych własności fizjologicznych (zapotrzebowanie witaminowe, pH, temperatury)

Badanie typu energetycznego i oddechowego

Produkcja NH₃ i H₂S wykazywana jest także przy metabolizmie białkowym (nie wiąże się z anaerobizmem)

Metabolizm cukrów

Wykonuje się test na wykorzystanie wielocukrów. Te źródła węgla są aplikowane na podłoże za pomocą testów cuksenograficznych.

Hodowla na podłożu Clark-Rubs'a

- test z czerwienią metylową RM (produkty kwaśne)

- test Vogers-Proskauer'a VP (produkcja acetony, detekcja acetony)

- krążki ONPG (orto-nitro-fenylogalaktozyd)

- asymilacja kwasu cytrynowego - podłoże Simmons'a (dla Enterobacterium)

Metabolizm białek

Najpierw test na hydrolizę żelatyny (upłynnienie podłoża żelatynowego)i kazeiny (zanik białego zabarwienia na podłożu z mleka)

- metoda Kocha (pył węglowy uwalnia się do probówki, gdy żelatyna będzie upłynniana - czarne zabarwienie podłoża)

- ODC - dekarboksylaza ornityny (do putrescyny)

- LDC - dekazboksylaza lizyny (do kadaweryny)

- ADM - dekarboksylaza argininy (arginaza)

- TDA - dezaninaza tryptofanowa

- PDA - dezaminaza fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego

- wytwarzanie indolu - na podłozu z peptonem + odczynnik Kovacs'a lub odczynnik Erlich'a

- wytwarzanie H₂S - na podłozu Mossel'a, Kligler'a lub TSI

- wytwarzanie NH₃ - na podłożu z peptonem + odczynnik Nessler'a

- wytwarzanie ureazy - na podłożu Ferguson'a, stuart'a, Christensen'a

Ogólny klucz identyfikacji bakterii ważnych w dziedzinie żywności patrz wykład na początku.

Ogólny klucz identyfikacji bakterii należących do rodziny:

1. Laktoza+ (fermentacja)= bakterie z grupy coli, coliformy

1. cytrynian - brak wykorzystania = Escherichia coli

2. cytrynian + wykorzystanie

- RM⁺VP^- : indol - Citrobacter Freundi

indol+ Citrobacter intermedius

-RM⁺VP^- : ruchliwe LDC+ Enterobacter aerogenes

LDC - Enterobacter cloaceae

nieruchliwe Klebsiella

1. Laktoza - (brak fermentacji)

1. ureaza +(rozkład mocznika)

- fermentacja glukozy z gazem, β-galaktoza^- Proteus

- fermentacja glukozy bez gazu, β-galaktoza⁺ Yersinia enterocolitica

b) ureaza - (brak rozkładu mocznika)

- ruchliwe: indol+ H₂S - Providencia

H₂S + Edwardsiella tarda

indol - Żelatyna - Salmonella (RM⁺VP^-)

Hafnia alvei (RM^-, VP⁺)

Serratia (RM^-VP⁺, barwna)

Żelatyna +, RM^-VP⁺ Arizona (β-galaktoza+)

Salmonella (β-galaktoza-)

- nieruchliwe: LDC - Shigella

LDC+ Salmonella Galinarum

Badania biochemiczne i fizjologiczne

- zapotrzebowanie na witaminy i czynniki wzrostu

- zdolność do wzrostu w obecności NaCl

- obserwacje mikroskopowe - zdolność ruchowa, kształt

- zdolność wytwarzania barwników

- badanie halofilnośći

- osmofilnosć - względem cukrów (glukozy, sacharozy) do ostatecznego stężenia 70% glukozy

- optymalna temperatura wzrostu + limit temperaturowy (temp max i temp min)

- zdolność do zarodnikowania - bada się przez pasteryzację

- oporność na antybiotyki i inhibitory

Charakterystyka płciowa struktur rozmnażania

- nie jest to cecha dobra do identyfikacji drobnoustrojów (wyjątek grzyby)

- kolejne stadia rozwojowe drożdży i pleśni umożliwiają ich identyfikacje

- najpierw obserwujemy strukturę grzybni

- Zygomycetales - sprężniaki, cąłe ciało jedna komórka

- grzybnia stepowana - workowce, podstawczaki Ascomycetales - Bazydiomycetales

- pseudogrzybnia - charakterystyczna dla grzybów, pojedyncze komórki połączone ze sobą, drożdże

- fermentacja strzępki zdolność do wytwarzania artrospor Cladosporium - rodzaj Geotrichum

- tworzenie zarodników bezpośrednio na grzybni

- tworzenie zarodnika w strukturze strzępki (plechy)

- worki z zarodnikami

- wytwarzanie zarodników na komórkach zarodnionośnych (fialidy- wytwarzają zarodniki)

- plerotecium - rodzaj Phaetomium

- połączenie różnoimiennych strzępek - powstawanie owocników

Drożdże różnicuje się bardziej cechami fizjologicznymi niż morfologicznymi.

Różnicowanie drożdży na podstawie ich kształtu a nie sposobu rozmnażania.

Yarrowia lipolytica - wytwarza grzybni właściwą.

Uproszczony klucz do oznaczania drożdży występujący w produktach żywnościowych:

1. rozmnażanie w podłożu płynnym przez podział komórki Mycelium i artrospory na agarze: Schizosaccharomyces

2. rozmnażanie w podłożu płynnym przez pączkowanie Mycelium i artrospory na agarze: Endomycopsis (zarodnikujące askospory), Trichosporon (nie zarodnikuje)

3. rozmnazanie przez pączkowanie biegunowe (bipolarne): Nadsonia, Hanseniospora, Kloeckera.

4. Rozmnażanie przez pączkowanie na całej powierzchni komórki (multipolarne):

Tu musimy sprawdzić zdolność do wytwarzania balistospor:

- obecność balistospor: Sporobolomyces

- brak balistospor + różowoczerwona barwa: Rhodotorula

- brak balistospor + białe lub jasnokremowe

Zarodnikujące (podłoże Fowel'a)

- metabolizm fermentacyjny, nie uwalniają askospor: Saccharomyces, zygosaccharomyces

- metabolizm fermentacyjny, askospory łatwo uwalniane: Kluyveromyces

-metabolizm oksydacyjny, wykorzystują azotany: Hansenula

- metabolizm oksydacyjny, nie wykorzystują azotanów, komórki owalne, pseudomycelium: Pichia

- metabolizm oksydacyjny, nie wykorzystują azotanów, komórki okrągłe, brak pseudomycelium: Debaryomyces

- metabolizm oksydacyjny, hydrolizuja żelatynę: Yarovia

Niezarodnikujące: Candida

Charakterystyka immunologiczna

Serotypy - bakterie na swoich strukturach majaą antygeny

W przypadku Histerii oznaczono 16 serotypów

Wykazywanie bakteriofagów w wodzie

1. pobranie próbki

2. namnożenie potencjalnego faga (pożywka z E. coli) 6-12h, temp 37ºC

3. przygotowanie hodowli E. coli 6h, temp 37ºC

4. przesączenie hodowli faga przez sączek zatrzymujący komórki

5. „skropienie” przesączem płytek z 6h hodowlą E. coli przez 12-24h 37ºC

Wyniki

Nieobecnośćbakteriofagów, jednolity wzrost E.coli

Obecność bakteri „łysinki”

Kontrolne płytki:

- jednolity wzrost E.coli

- brak wzrostu

Zdolności patogenne:

1. obecność enzymów o aktywności hemolizyn, DNA-zy, koagulaty, fosfatazy, esterazy

Hemolizyny: α, β, γ - test na agarze z krwią.

Fosfatazy, esterazy - powodują rozkład ATP w komórce - metody biochemiczne w probówce.

Obecność DNA-zy - badamy na agarze z DNA i po wzroście spryskujemy NaOH i sprawdzamy obecność łysinek.

Obecność koagulazy - enzym wytwarzany przez gronkowca złocistego, jego aktywność prowadzi do żelowania krwi. W teście wykorzystujemy plazmę królika.

2. Test na myszach - wykorzystywany w przypadku obecności toksyny otulinowej. Bierzemy 4 myszy, każdej podajemy próbkę z patogenem, trzem dajemy surowicę. Jeśli jedna zdechnie to świadczy to o obecności toksyny.

3. wypreparowane jelita świnki morskiej (podobnie jak myszy)

Szeregi identyfikacyjne

Testy: API 20E - Analityczny Profil Identyfikacyjny zawiera 20 testów

ATB - Automatyczny Test Bakteriologiczny

CIT - wykorzystanie cytrynianu

GEC - wykorzystanie żelatyny

ADH - dehydrataza karnityny

LDC, ODC, URE

Automatyczne testy - czytnik przez zmętnienie (nie ma różnych kolorów)

Test API 20E

Triady reakcji wykorzystywana w systemie API 20E

Od 0 do 7 - każda liczba określa dany wynik

Drobnoustroje ……	Agar odżywczy	30ºC, 72h 25ºC, 48h	Wszystkie………
Enterobacteriaceae	VRBG BLBVB	30ºC, 24-48h	Różne
E. coli	Fluorocult + MUG	25ºC, 24-48h	Fluorescencja i wytwarzanie indolu
Enterococcus	m-enterococcus podłoże Roth'a	37ºC, 48h	Czerowne i różowe kolonie katalazo ujemne
Micrococcus Staphylococcus	Agar Chapmana KRANEP	37ºC, 48h	Ziarniaki katalazo dodatnie, test na koagulazę
Clostridium	DRCM Agar, podłoże Wrzoska	37ºC, 72h, anaerobowo	Czarne kolonie
Drożdże i pleśnie	Agar ziemniaczany z antybiotykiem	25ºC, 72h- 5dni	Drożdże i pleśnie

Nowe podłoża

E. coli:

- MUG →metylobelliferon jest fluoryzujący

Enzym B-D - glukuronidaza

- test IMVIC - produkcja indolu, ruchliwość, wykorzystanie cytrynianu (dodatnie dla E. coli)

- test Mc Kenzy'ego - podłoże Shuberta, inkubacja 44ºC

Salmonella - kolonie różowe na testach: glukuronazy, β-galaktozydazy

Różne podłoża dla drobnoustrojów:

Drobnoustroje	Podłoże
Salmonella Proteus Coliformy	Rambach agar
Salmonella	Diasalm
Escherichia coli	BBL chromagar 0157
Do badania wody na wykrywanie enterokoków	Readycult

Salmonella

Gatunek - Salmonella enterica, Salmonella bongori

Podgatunek - subsp

S. enterica subsp enterica

S. enterica subsp salamae

S. enterica subsp arizona

S. enterica subsp houtenoe

S. bongori subsp V (maja swoje numery a nie nazwy)

Serotyp- serowar = ser.

S. enterica subsp enterica ser. Typhimurium - Salmonella Typhimurium

S. enterica subsp. enterica ser. Identidis - Salmonella Identidis

Schemat badań na obecność pałeczek Salmonella wykonywany metodą standardową i z zastosowaniem nowych podłoży i testów

Matoda posiewów do oznaczeń obecności i liczebności Listeria monocytogenes w żywności i paszach - schemat procedury zgodnej z normą ISO/EN/DIN 11290-1:1996

Staphylococcus ureus - badanie produktu

Immunologiczna identyfikacja drobnoustrojów

Wstęp - wprowadzenie do immunologii - definicje

Determinanty antygenowe drobnoustrojów

Typowanie serologiczne

Test ELISA

Aglutynacja lateksowa

Immunomagnetyczna separacja

Antygeny:

- H - rzęskowy

- O - somatyczny (E. coli: O 157:H7; L. monocytogenes 4b; V. cholerae cholerae 01)

- K - otoczkowy

Antygeny wywołują pełną bądź niepełną reakcję immunologiczną. Jeżeli wniknie do organizmu kręgowca wywoła u niego reakcje immunologiczną, swoistą aglutynację, odczyny skórne, wiązanie dopełniacza. Przeciwciała produkowane są przez kręgowce, służą jako odczynniki do identyfikacji ( serotypowania) bakterii.

Przeciwciała nie są produkowane przez bakterie. One wykorzystują bakterie bo te mają antygeny.

Reakcje immunologiczne

Serowanie bakterii

Określenie typu surowicy z jaką reaguje badany szczep.

Reakcje:

- precypituje - precypitacja

- aglutynuje - aglutynacja (tworzy zlepy)

Ab - przeciwciała

Ag - antygen

Reakcje aglutynacji:

- aglutynacja cząstek obojętnych (lateksowe cząstki, krwinki czerwone) przez kompleks Ag-Ab

- aglutynacja wielofunkcyjnego antygenu ( komórek bakteryjnych) przez kompleks Ag-Ab

Znakowanie:

Ag+Ab*→AgAb*

Ag*+Ab → AgAb

Ag+Ab₁+Ab₂ → AgAb₁Ab₂

Znakowanie enzymatyczne jest najlepsze - typ ELISA

Znakowanie fluorescencyjne - typ Flisa

Test ELISA E - enzyme L - linked I - immuno S - sorbent A - assay

specyficzne przeciwciała Ab zaabsorbowane na płytce

badanie antygenu Ag (badana próbka)

badanie specyficznego Ab znakowanego enzymem

dodanie substratu (rozkładający enzym). Pomiar intensywności zabarwienia- im enzymu więcej tym barwa jest intensywniejsza

Wiadomości z internetu:

jest testem immunologicznym reakcję barwną enzymu sprzęrzonego z przeciwciałami do jakościowego i ilościowego oznaczania antygenów.

Test wykonuje się w studzienkach wykonanych z plastiku do umieszczonych na specjalnie do tego celu zaprojektowanej mikropłytce. W przykładowej procedurze tzw. 'kanapkowego' testu ELISA do studzienki dodaje się przeciwciał przeciwko specyficznemu antygenowi, które przyczepiają się do powierzchni tworzywa sztucznego. Następnie dodawane są kolejno: antygen, przeciwciało drugorzędowe przeciwko antygenowi z przyłączonym enzymem (np. alkaliczną fosfatazą lub peroksydazą chrzanową), oraz substrat dla enzymu. W reakcji enzymatycznej powstający produkt jest barwny, a jego stężenie może być oznaczone spektrofotometrycznie. Zawartość enzymu, a więc i ilość powstałego produktu jest proporcjonalna do ilości antygenu.

Istnieje wiele odmian testu ELISA.

Test Tecra Unique Salmonella - zasada taka sama jak przy teście Elisa. Umożliwia dość czystą pracę z próbką. Pozwala przez 15-20h zidentyfikować w próbce Salmonella.

Rys.

Jest 6 etapów- cały test trwa niecałą dobę max 21h

Zawsze jest robiona próba kontrolna.

Testy lateksowe - aglutynacja czastek lateksu pod wpływem antygenu - przeciwciała dostępne dla: Gronkowców, Streptococcus, Staphylococcus, drożdży.

Immunomagnetyczna separacja - pozwala wyizolować bakterie z podłoża, cząstki, granulki ferromagnetyczne z podłoża np. jak będą opłaszczone przeciwciałem Salmonella to wyłapią Salmonella. W zależności czym je opłaszczymy do tego będą stosowane.

Żeby zbadać drobnoustroje można wykonać: test Elisa, wylac na płytkę, oznaczenie RNA/DNA, zbadać impedancję.

Etapy otrzymywania przeciwciał monoklinalnych

1. immunizacja zwierzęcia

2. wyizolowanie komórek śledziony

3. przygotowanie komórek szpiczaka

4. fuzja komórek szpiczaka z komórkami śledziony

5. hodowla klonów mieszańcowych

6. selekcja klonów pozytywnych

7. otrzymanie masowych hodowli form mieszańcowych

8. zagęszczenie i oczyszczanie przeciwciał monoklinalnych

9. analiza przeciwciał i określenie ich specyficzności

Metody oparte o właściwości genów:

1. budowa DNA: zasady azotowe A, T, C, G

Dezoksyryboza

Fosforan

2. właściwości: kompetentarność zasad

Swoista sekwencja

Wierne powielanie

3. znakowanie i/lub detekcja

Badanie wg gen……

1. liza komórek drobnoustrojowych + odczynniki lizujący (lub bonifikacja)

2. hybrydyzacja (znakowany kwasem RNM) + komplementarny DNA 60min 72ºC

Powstały hybrydy DNA-rRNA lub brak hybrydów

3. separacja + hydroksyapatyt + wirowanie (adsorbancja hybrydów na powierzchni hydroksyapatytu

4. odczyt odczynnika znakującego w osadzie hydroksyapatytu

W zależności od tego czym znakujemy, potem odpowiednim przyrządem sprawdzamy wyniki.

Zestawy Cen-Probe

Campylobacter - C. jejuni. C. coli

Haemophilus influenzae

Enterococcus

Listeria monocytogenes

Staphylococcus ureus

Mycobacterium tuberculosis

Metody oparte o DNA i RNA:

- sondy DNA

- rybotypowanie (rRNA)

- PEGE (żelowa elektroforeza w polu pulsacyjnym)

- PCR - (reakcja łańcuchowa polimerazy

- RAPD (losowo amplifikowany polimorficzny DNA)

- RFLT - (polimorfizm długości restrykcyjnych fragmentów

- AFLP - polimorfizm długości amplifikowanego fragmentu

- ITS oraz ETS-RFLP - (polimorfizm długości restrykcyjnych fragmentów, odcinków transkrypcyjnych wewnętrznych lub zewnętrznych względem genów kodujących rRNA najczęściej 16s rRNA

- cCPR - (kompetytywne PCR) - ilościowe oznaczenie

- NASBA - sekwencjonowanie oparte na amplifikacji DNA

- technika „Microtray”

Izolacje DNA - wyekstrahowanie DNA

1. denaturacja nici DNA

2. przyłączenie primerów

3. ponowna denaturacja 4 nici

Pojedyncza i kilkustarterowa PCR jako metoda wykrywania i identyfikacji bakterii

Pary primerów dobrane do sekwencji genów kodujących bakteryjne enzymy restrykcyjne

- pojedyncze powielanie DNA z bakterii

- jednoczesne powielanie DNA z różnych gatunków bakterii

Identyfikowano 7 gatunków bakterii poprzez analizę wielkości produktu od 109 do 727pz (par zasad)

(F - primer wiodący R - primer odwrotny)

Metoda umożliwia wykrycie od 1 do 1000 komórek, można było wykryć 10^-18 g (DNA)

E. coli - 1-10

S. ureus 100-1000

PCR - ilościowe oznaczenie bakterii (tylko skrót co on oznacza)

Etapy opracowania metody:

1. porównano sekwencję genu 16S rRNA dla losowo wybranych 100 gatunków bakterii

2. wykonano wysoce konserwatywną sekwencję nukleotydów

3. skonstruowano dwa primery wiążące się dla tej sekwencji

4. skonstruowano hybrydowy starter umożliwiającego amplifikację kompetytora o długości 229 pz (par zasad) homologicznego do konserwatywnej sekwencji

5. otrzymano kompetytor

6. przeprowadzono kalibrację metody z użyciem kompetytora

7. zastosowano w ocenie czystości jamy ustnej

Wiarygodność identyfikacji opartej o analizę genomu wynika:

1. z zasadniczej cechy budowy kwasów nukleinowych - komplementarność zasad azotowych

2. ze swoistości sekwencji nukleotydowej sondy lub starterów wybranych do analizy. Dobrana sekwencja może być swoista dla rodzaju, gatunku lub szczepu.

3. z możliwości identyfikacji powstałych produktów (znakowanie sondy lub rozdział elektroforetyczny produktów PCR i analiza obrazu)

Etapy badań z wykorzystaniem PCR

- zebranie materiału - wystarczy pojedyncza kolonia lub 2-10ml hodowli, 25mg próbki lub 25ml mleka.

- izolacja DNA - wieloetapowa, ale końcowa objętość próby na każdym z etapów nie przekracza 2ml

PCR końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej nie przekracza 100ml, w wielu przypadkach wystarczy 25ml.

Elektroforeza - przyjazne aparaty, analiza obrazu przy pomocy komputera.

Zastosowano dwie kilkustarterowe PCR: G-T-P i F-A-N.

Wykorzystano pary starterów: starter wiodący i odwrotny - oskrzydlające fragmenty genów rRNA specyficzne dla następujących gatunkow:

C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilesis, A. fumigatus, C. albicons, C. neoformans.

Odpowiednio: CGL1 i CGL2, CTR1 i CTR2, CPA1 i CPA2; oraz AFUM1 i AFUM2, CALBI1 i CALBI2, CN5 i CN4

RAPD - do identyfikacji drożdży

Wykaz łańcuchowej reakcji polimery do wykrywania genów. W metodzie wykorzystuje się jeden starter który pełni funkcję wiodącego i odwrotnego. Primery muszą być odpowiednio wybrane dla każdego drobnoustroju. W zalezności ile jest prążków to można odczytać na ścieżkach.

Różnicowanie drożdży przy pomocy RFLP-CPR-rRNA - analiza długości fragmentów restrykcyjnych otrzymanych po CPR dla fragmentu rRNA.

Chodzi o budowę genu rRNA - zawiera on 3 regiony konserwatywne i 4 niekonserwatywne.

Region 5,8S dla S. bayanus, S. ceserisiae, S. paradoxus, S. pastorianus ma obszar wielkości 850pz

Fragmenty genów są pocięte na obszary w których działają enzymy: Hae III, Hap II, Scr F, Hind III

Analiza restrykcyjna fragmentów DNA umożliwia identyfikację gatunku. Pozwala stwierdzić czy mamy do czynienia z czystymi gatunkami czy mieszańcami (hybrydami). Analiza ta może być wykonana na dowolnym genie, nie musi być to rRNA.

Kilkustarterowa (Multipleks) CPR jako metoda identyfikacji grzybów i patogenów.

Inne zastosowanie analizy typu CPR na wykrywanie obecności genów.

Pozwala na identyfikację produktów spożywczych, składników żywnościowych, czy nie są zafałszowane czymś.

	RAPD	RFLP-CPR-rRNA	cCPR	Multipleks CPR
Matryca	+	+	+	+
Kompetytor	-	-	+	-
Primery	Jeden (2 funkcje)	Para	Para	Kilka par
Produkt	Różna ilość zależna od matrycy	Jeden	Dwa	Ilość zalezna od homogeniczności matrycy
Analiza restrykcyjna	Nie stosowana	Konieczna	Zbędna	zbędna

Mikrobiologia prognostyczna

Przewidywanie przyszłych zdarzeń na bazie modeli matematycznych wykonanych na podstawie zebranych danych ze szczegółowych analiz mikrobiologicznych.

Wpływ: temp, pH, kwasów organicznych, NaCl, a_w konserwantów i atmosfery gazowej na wzrost, śmierć i przyswajalność drobnoustrojów.

Modele matematyczne + np. modelowanie wpływu temp.

Model typu Arrheniusa

lnk= lnA - E_a/RT

E_a - energia aktywacji T - temperatura w*k R - stała gazowa

A - współczynnik

KONIEC

Niestety ja też z tego nie wiele rozumiem, ale to właśnie było na wykładach. Miłej nauki.

1

Nauka

Żywność

Środowisko

Zdrowie

Człowiek

PPRODUCENT

proces/produkt

produkt surowy

produkt końcowy

KONSUMENT

zatrucie

infekcja

zła jakość

ORGANA KONTRLOLI

kontrola w przypadku zatruć

kontrola rutynowa

BADANIE MIKROBIOLOGICZNE

Kontrola Jakości Badań

Kontrola zewnętrzna

Kontrola wewnętrzna

Porównanie międzylaboratoryjne

Kontrola planowana lub nie

Udział badań porównawczych międzylabora-toryjnych

Badania porównawcze między laboratoriami krajowymi

Badania z zastosowanie dwóch metod badawczych

Badania równoległe tej samej próbki przez dwóch analityków

Badania próbek o znanych parametrach

Badania wielokrotne tej samej próby przez jednego analityka

Wzbudzenie 450-490 nm

650 nm

barwa czerwona

525nm

barwa zielona

Emisja światła

Polimer barwnika

Monomer barwnika

kompleks

Oranż akrydyny

RNA

DNA

Czynnik C

Aktywny czynnik C

Czynnik B

Aktywny czynnik B

Proenzym żelujący

Enzym żelujący

Koagulogen

(żel) koagulin

LPS

Koagulin (żel)

Koagulogen

Enzym żelujący

Proenzym żelujący

Substrat

Metabolizm fermentacyjny

Aktywny czynnik G

Czynnik G

β-glukan

Produkt pośredni

NH₃ NO₃^-

H₂S SO

CH₄ CO₃^—

Bezwzględny anaerobizm

Bezwzględny aerobizm H₂O₂

Metabolizm oddechowy

H⁺

H₂O

NH₂

(CH₂)₄

NH₂

NH₂

(CH₂)₅

NH₂

NH₂-CH₂- CH₂- CH₂- CH₂- CH- NH₂

COOH

NH

C-N-CH₂- CH₂- CH₂- CH-COOH→ornityna+ CO₂+2NH₃

NH₂

NH₂

H

4-5dni

25g woda peptonowa zbuforowana 225ml

Pożywka

Rapaport-Vassiliadis

Hektoen Enterie agar S-S

Próbkowe testy biochemiczne 24h

18-20h

24-48h

24h

25g Salmosyst I 225ml

Salmosyst I

Rabmach Agar

Test Api Rapia 20E

Test lateksowy Welteolex

2,5dnia

6-8h

godzina

Kilka min

24h

20h

25g (szukamy patogenów)

Agar Baird-Parkera

Agar Champana

Podłoże Giolitti-Cantoni 225ml

Podłoże Giolitti-Cantoni 90ml

10g (rutynowe badanie produktu mięsnego

Kolonie mannitol+ i katalazo+

Test lateksowy

Bulion mózgowo-sercowy

24h

Kilka min (przygotowanie)

Inkubacja do 8h

Wynik końcowy

Wynik po 1 min

Plazma królicza po 1h

42h

66h

Antygen

Śledziona

Komórka śledziony

Hodowla komórek szpiczaka

1

2

4

3

5,6

7

Baza danych mikrobiologicznych

Modelowanie matematyczne

Baza modeli matematycznych

System ekspertów

Weryfikacja modeli

Centrum ekspertów

Przemysł

---