typowanie fagowe, mikrobiologia


Terapia fagowa jako alternatywa w leczeniu zakażeń wywołanych przez bakterie antybiotykooporne

Komisja Europejska, amerykańska Food and Drug Administration i wiele organizacji międzynarodowych (np. Światowa Organizacja Zdrowia) uznało walkę z lekoopornością drobnoustrojów za działanie priorytetowe. Jednak, jak wskazują wyniki analiz, poszukiwanie nowych leków przeciwbakteryjnych przez przemysł farmaceutyczny jest ograniczone, m.in. ze względu na rosnące koszty związane z prowadzeniem stosownych badań naukowych, niski zwrot poniesionych kosztów i wysokie ryzyko związane z możliwością stosunkowo szybkiego wytworzenia się oporności [1]. Pojawiły się już bakterie Gram-dodatnie oporne na linezolid i chinuprystynę/dalfoprystynę - antybiotyki wprowadzone niedawno do leczenia zakażeń wywołanych przez szczepy oporne na wankomycynę [2]. Problemy związane z zakażeniami tymi bakteriami dotyczą również Polski [3]. Niestety, w coraz większym odsetku przyczyną infekcji wieloopornymi bakteriami są nie tylko zakażenia szpitalne, ale i nabyte poza tym środowiskiem [4]. Wśród alternatywnych wobec antybiotyków i chemioterapeutyków sposobów zwalczania infekcji bakteryjnych, w tym zakażeń szczepami wieloopornymi, coraz częściej wymienia się terapię z użyciem bakteriofagów [5-8].
Bakteriofagi jako potencjalny środek w leczeniu zakażeń bakteryjnych
Bakteriofagi (w skrócie fagi) to wirusy bakteryjne bardzo rozpowszechnione w przyrodzie - zasiedlają glebę, oceany, a nawet gorące źródła [9]. Występują również w pokarmie i organizmach ludzi oraz zwierząt (izolowano je np. z ludzkiego kału). Podane doustnie mogą przenikać do krwiobiegu i być wydalane z moczem [10-12]. Bakteriofagi szybko penetrują z krwi do wątroby i śledziony, a także nerek, grasicy i otrzewnej [9]. Dystrybucja fagów do narządów może też się odbywać poprzez naczynia limfatyczne [13]. Wykazano, że mogą pokonywać barierę krew-mózg, nie tracąc zdolności do niszczenia bakterii [14]. Bakteriofagi infekują wyłącznie komórki bakteryjne. W komórce gospodarza możliwe są 2 podstawowe cykle życiowe fagów: lizogenny i lityczny. W cyklu lizogennym materiał genetyczny wirusa zostaje wbudowany do genomu bakterii i wraz z nim ulega replikacji, przez długi czas nie wywierając na komórkę szkodliwego wpływu. Głównym celem cyklu litycznego jest natomiast namnażanie fagów, czego konsekwencją jest śmierć komórki gospodarza [15]. Zdolność efektywnego zabijania bakterii implikuje możliwość zastosowania fagów litycznych w profilaktyce i leczeniu infekcji bakteryjnych. Fundamentalną cechą fagów, jako potencjalnych leków przeciwbakteryjnych, jest silne działanie bakteriobójcze in vitro i in vivo zarówno przeciw bakteriom Gram-dodatnim, jak i Gram-ujemnym. W klasycznych doświadczeniach Smitha i Hugginsa, pojedyncza dawka kolifaga była bardziej skuteczna od powtarzanych dawek 4 różnych antybiotyków w mysim modelu infekcji E. coli [16]. Tak dużą skuteczność fagów tłumaczy się ich unikatową zdolnością replikacji w komórkach bakteryjnych, dzięki której liczba wirionów zwiększa się w miejscu toczącej się infekcji. Ze względu na brak możliwości namnażania w komórkach eukariotycznych, po eradykacji bakterii miano fagów zmniejsza się aż do całkowitego ich usunięcia z ustroju (np. wydalanie z moczem, kałem). Możliwość replikacji nabiera szczególnego znaczenia w wypadku leczenia infekcji rozwijającej się w gorzej ukrwionych tkankach; do eliminacji bakterii wystarczy wówczas dotarcie do zakażonego obszaru nawet małej liczby wirionów. Równocześnie możliwość namnażania w komórkach bakteryjnych znacznie utrudnia charakterystykę BF pod względem farmakokinetycznym [17]. Wielkie znaczenie ma zdolność zabijania przez fagi bakterii antybiotykoopornych, co udowodniono na mysim modelu infekcji wywołanej przez opornego na metycylinę gronkowca złocistego (MRSA) [18], oporne na wankomycynę enterokoki (VRE) [19], wielooporny szczep P. aeruginosa [20] oraz E. coli wytwarzające b-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) [21]. Również w tych pracach do wyleczenia zakażenia wystarczała zaledwie jedna dawka faga. Warto ponadto odnotować możliwość uzyskania efektu synergistycznego w działaniu przeciwbakteryjnym faga i antybiotyku, co wykazano w modelu infekcji E. coli u kurcząt [22]. Najważniejszym elementem ograniczającym skuteczność działania leków przeciwbakteryjnych jest rozwój oporności. Przyjmuje się, że ryzyko jej powstania jest w wypadku bakteriofagów mniejsze niż dla antybiotyków, dzięki możliwości zachodzenia w genomie faga mutacji, które mogą umożliwiać łatwiejszą adaptację do mutujących komórek bakteryjnych [23]. Poza tym, przynajmniej w niektórych wypadkach, rozwój oporności na bakteriofagi wiąże się ze zmniejszeniem zjadliwości bakterii [16]. Wiele prac przedklinicznych dokumentuje nie tylko wysoką skuteczność fagoterapii, lecz również jej bezpieczeństwo. Praktycznie w żadnym z kontrolowanych badań eksperymentalnych z użyciem oczyszczonych preparatów fagowych nie zaobserwowano u zwierząt doświadczalnych objawów ubocznych. Przykładem są 4 niedawno opublikowane prace na temat leczenia bakteriemii wywołanej S. aureus [18], E. faecium [19], P. aeruginosa [20] i E. coli [21]. W żadnej z nich nie stwierdzono u myszy objawów niepożądanych, które teoretycznie mogły być oczekiwane, np. jako konsekwencja masywnej bakteriolizy. Jednym z głównych problemów znacznie utrudniających zastosowanie terapii fagowej jest wąskie spektrum działania przeciwbakteryjnego bakteriofagów. Najczęściej jest ono ograniczone do części szczepów w obrębie jednego gatunku bakterii [19]. Jest to korzystne, gdyż umożliwia eliminację bakterii patogennych bez naruszenia równowagi naturalnej mikroflory, co może być konsekwencją antybiotykoterapii. Z drugiej jednak strony, wąski zakres działania przeciwbakteryjnego w praktyce powoduje, że konieczna jest ocena in vitro wrażliwości czynnika etiologicznego na bakteriofagi przed podaniem preparatu fagowego pacjentowi. Inne rozwiązanie to zastosowanie koktajlu fagowego, czyli kilku różnych fagów, wspólnie zapewniających szerszy zakres działania przeciwbakteryjnego. Istnieją również metody oparte na wielokrotnym pasażowaniu, które umożliwiają otrzymanie nowych wrażliwych fagów w przypadku utraty przez nie zdolności do lizy specyficznych bakterii [24]. Drugim istotnym problemem znacznie ograniczającym skuteczność fagoterapii jest szybki klirens fagów, uzależniony głównie od niespecyficznego wychwytywania wirionów przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego wątroby i śledziony. Dobrym rozwiązaniem jest izolacja wariantów bakteriofagów cechujących się wydłużonym okresem półtrwania w surowicy. Są one dość łatwe do uzyskania przy użyciu metody seryjnego pasażu u myszy [11]. Interakcje fagów i komórek bakteryjnych mogą być również zaburzone przez swoiste przeciwciała przeciwfagowe, co może ograniczać efektywność terapii, zwłaszcza po podaniu wielokrotnych dawek fagów. Do tej pory nie zaproponowano skutecznej metody ograniczającej ich immunogenność, sugeruje się jedynie zwiększenie kolejnych dawek lub podanie fagów o podobnym zakresie działania przeciwbakteryjnego, lecz odmiennej specyficzności antygenowej [23]. Trzeba jednak pamiętać, że podawanie doustne może nie pobudzać produkcji przeciwciał, ponieważ taka droga podawania antygenu wiedzie często do tolerancji. Warto ponadto podkreślić, że skuteczność fagoterapii u zwierząt była dotychczas oceniana wyłącznie na modelach ostrych infekcji. Niektórzy eksperci kwestionują możliwość uzyskania równie wysokiej efektywności w leczeniu zakażeń przewlekłych [25].
Fagoterapia w praktyce klinicznej
Zdolność efektywnego zabijania bakterii implikuje możliwość zastosowania fagów litycznych w profilaktyce i leczeniu infekcji bakteryjnych. Pierwsze próby w tej dziedzinie podjęto już na początku lat 20. XX wieku, kilka lat po odkryciu bakteriofagów. Fagi nigdy jednak nie zdobyły silnej pozycji w medycynie zachodniej, a zainteresowanie nimi znacznie zmniejszyło się po wprowadzeniu pierwszych antybiotyków. Od odkrycia bakteriofagów w roku 1917 do połowy lat 40. XX wieku opublikowano setki prac opisujących zastosowanie fagów w leczeniu biegunek i innych infekcji u ludzi [7, 26]. Również w Polsce w latach międzywojennych XX wieku prowadzono próby tego rodzaju leczenia w znanej Klinice Chirurgicznej Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie [27]. W tym czasie na świecie produkowano nawet komercyjnie preparaty fagowe. Jednak z powodu kontrowersyjnych wyników spowodowanych słabą znajomością natury fagów, ich niewłaściwym stosowaniem (np. przeciwko niewrażliwym bakteriom czy chorobom o etiologii innej niż bakteryjna), a także szybkiego rozwoju antybiotykoterapii, w krajach zachodnich zarzucono ten kierunek badań [7]. W II połowie XX wieku BF były stosowane głównie w Europie Środkowej i Wschodniej, gdzie dwoma największymi ośrodkami fagoterapii były (i są nadal) Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu (najważniejsze publikacje instytutu z tego zakresu są dostępne pod adresem internetowym: http://surfer.iitd.pan.wroc.pl/phages/phages.html) i Instytut Eliavy w Tibilisi [26, 28]. Od kilku lat obserwuje się olbrzymi wzrost zainteresowania zastosowaniem fagów w profilaktyce i leczeniu infekcji bakteryjnych. Wiele prywatnych firm w USA, Kanadzie, Wielkiej Brytanii i Izraelu zaczęło prowadzić intensywne badania związane z terapią fagową [5]. Pod koniec 2005 r. Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu otworzył pierwszy w Unii Europejskiej Ośrodek Terapii Fagowej, w którym prowadzone jest eksperymentalne leczenie chorych zakażonych antybiotykoopornymi bakteriami za pomocą bakteriofagów, zgodnie z aktualnymi wymogami terapii eksperymentalnej. Nature Medicine określiło to wydarzenie jako fundamentalny krok naprzód w terapii fagowej [29]. W kolekcji Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu znajduje się ponad 300 fagów, które mogą być stosowane u chorych z zakażeniami wywołanymi przez bakterie z rodzaju Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Shigella, Serratia, Salmonella, Proteus, Pseudomonas i Stenotrophomonas. Preparaty fagowe przygotowywane są wg zmodyfikowanej procedury Ślopka i wsp. indywidualnie dla każdego chorego [30, 31]. Pierwszym etapem jest znalezienie w kolekcji faga, wykazującego aktywność lityczną przeciwko szczepowi bakterii wyhodowanemu od pacjenta - proces ten nazywa się typowaniem fagowym. Materiał mikrobiologiczny do typowania fagowego stanowią z reguły już zidentyfikowane szczepy bakteryjne, wyizolowane od pacjenta, dostarczone do Laboratorium Bakteriofagowego na skosie albo płytce agarowej odpowiedniej dla danego szczepu. Jeśli wynik typowania jest dodatni, w drugim etapie wyselekcjonowany rodzaj bakteriofagów namnaża się na odpowiednim szczepie bakterii pochodzącym z kolekcji Instytutu lub szczepie wyhodowanym od pacjenta. Uzyskuje się w ten sposób tzw. lizat fagowy, w którym oprócz cząstek fagowych w wodzie peptonowej znajdują się produkty przemiany i rozkładu bakterii. Lizat przesącza się przez filtr bakteryjny, oznacza w nim miano fagów, ampułkuje (po 5 ml lub 10 ml) i kontroluje jałowość preparatów, które dalej przechowuje się w temperaturze 2-8°C. W latach 1981-1986, we współpracy Instytutu z klinikami Akademii Medycznej we Wrocławiu i innymi szpitalami, terapię fagową zastosowano u 550 chorych w wieku od 1. tygodnia do 86 lat, z różnymi spontanicznymi lub pooperacyjnymi ropnymi infekcjami wywołanymi przez bakterie z rodzajów Staphylococcus (73,1% przypadków), Klebsiella, Echerichia, Proteus, Pseudomonas [32]. W 32,4% przypadków występowała infekcja mieszana, a 94,2% wszystkich chorych było wcześniej nieskutecznie leczonych antybiotykami. Bakteriofagi stosowano doustnie i miejscowo. Podawano je 3 razy dziennie po 10 ml, 30 min przed jedzeniem, po uprzedniej neutralizacji soku żołądkowego. Leczenie prowadzono od 1 do 12 tyg. (średnio 5 tyg.). W 152 przypadkach fagi podawano równolegle z antybiotykami, natomiast u 398 pacjentów zastosowano same fagi. Odsetek osób, u których infekcja spowodowana była szczepem antybiotykoopornym, wynosił 94,2%. Pozytywne wyniki leczenia (oparte na ocenie skuteczności eliminacji procesu ropnego, gojeniu zmian miejscowych i posiewach) uzyskano u ponad 92,4% chorych. Najsłabsze wyniki obserwowano u pacjentów z zespołem pozakrzepowym (ok. 76% wyleczeń), najlepsze - w zakażeniach przewodu pokarmowego, ostrym ropnym zapaleniu osierdzia, czyraczności (niemal 100% skuteczności). Wysoką, co najmniej 90% skuteczność fagoterapii stwierdzono również w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych, zapaleniu kości i szpiku, zapaleniach kości po złamaniu, zakażeniach układu moczowego, przewlekłych ropnych przetokach, zapaleniu powiek, spojówek, ucha środkowego, ropniach skóry, ropowicy, trądziku martwiczym i ropniach gruczołu piersiowego. Na podkreślenie zasługuje fakt, że aż w 87 z 98 przypadków posocznicy osiągnięto pozytywny efekt terapeutyczny. Bakteriofagami leczono (doustnie i miejscowo, średnio przez 4 tyg.) również 7 pacjentów po zabiegu na otwartym sercu i dużych naczyniach z ostrym ropnym zapaleniem osierdzia, wywołanym przez Staphylococcus (5 przypadków) albo mieszaną infekcję Staphylococcus i Pseudomonas lub Escherichia (2 przypadki), u których antybiotykoterapia była nieskuteczna. Pozytywny efekt leczenia (całkowite wyleczenie lub eliminacja procesu ropnego i gojenie) obserwowano u 6 osób, a zadowalający u 1 [32, 33]. Od 1987 r. do 1999 r. terapię fagami zastosowano u 1307 pacjentów (w wieku od 4 tyg. do 89 lat) z różnymi zakażeniami bakteryjnymi szczepami wieloopornymi rodzajów Staphylococcus, Klebsiella, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter [34]. Odsetek pozytywnych wyników typowania fagowego bakterii wyizolowanych od kwalifikowanych wtedy do terapii wynosił 95% dla szczepów Staphylococcus, 89% dla Pseudomonas, 81% dla Escherichia i 60% dla Klebsiella. Bakteriofagi podawano przez 1-12 tyg. (średnio 32 dni), wg schematu stosowanego w latach poprzednich. Całkowite wyleczenie (i eliminację bakterii) uzyskano u 85,9% osób, a poprawę, ale bez eradykacji patogenu u 10,4%. U 3,8% chorych terapia była nieskuteczna. Najlepsze wyniki uzyskano u pacjentów z ropnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych (100% całkowitych wyleczeń), zapaleniem kości i szpiku (95%), ropnym zapaleniem gruczołu piersiowego (93,1%), przewlekłymi ropnymi przetokami (93%), ropnym zapaleniem stawów i mięśni (89%), ropnym zapaleniem ucha środkowego (88,4%), posocznicą (87,7%). W grupie z ropnymi zakażeniami pooperacyjnymi, odsetek całkowitych wyleczeń wynosił 86% (u pozostałych stwierdzano poprawę, ale nie wyeliminowano bakterii). Terapię fagową prowadzono z bardzo dobrym skutkiem u dzieci. Szczegółowa analiza jej wyników u 114 pacjentów w różnym wieku - od noworodków i niemowląt do 20. roku życia (39 pacjentów poniżej 3. roku życia, 29 pacjentów w wieku 14-20 lat) - wykazała, że u 95,5% z nich leczenie zakończyło się pozytywnym efektem (ocenianym na podstawie skuteczności eliminacji procesu ropnego oraz posiewach) niezależnie od wieku i natężenia stanu schorzenia [33]. Przyczyną zakażeń były szczepy Staphylococcus, Klebsiella, Escherichia, Proteus lub Pseudomonas (monoinfekcje stwierdzono u 68,4% przypadków, a infekcje mieszane u 36,6%). U 64,9% osób stosowano wyłącznie fagoterapię, a u 35,1% fagi równocześnie z antybiotykami. Leczenie było szczególnie skuteczne w przypadku zakażeń przewodu pokarmowego i sepsy (95,2%), nosogardzieli, zatok przynosowych i ropnych zapaleń płuc (92,5%), zapalenia skóry i tkanki podskórnej, czyraczności (92,5%), zapalenia kości i mięśni (100%) oraz ropnych ran pooperacyjnych i urazów (100%). Strój i wsp. na Oddziale Niemowlęcym Zespolonego Szpitala Dziecięcego w Sosnowcu stosowali fagoterapię preparatem zawierającym pojedynczy szczep faga lizujący pałeczki Klebsiella u noworodka urodzonego w 35. tyg. ciąży poprzez cięcie cesarskie (1 punkt w skali Apgar), u którego od pierwszej doby występowały objawy posocznicy z ropnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych wywołanej przez oporny na stosowane antybiotyki szczep Klebsiella pneumoniae [35]. Preparat faga podawano przez 5 tyg. doustnie 3 razy dziennie po 5 ml, 30 minut przed karmieniem, po wcześniejszej neutralizacji soku żołądkowego. Uzyskano wyjałowienie płynu mózgowo-rdzeniowego, poprawę stanu ogólnego, przyrost masy ciała i normalizację wyników laboratoryjnych.
Bezpieczeństwo terapii fagowej
Dotychczas nie pojawiły się doniesienia sugerujące, że bakteriofagi mogą być przyczyną jakichkolwiek komplikacji lub schorzeń u ludzi. Wprawdzie mogą one pośredniczyć w przekazywaniu genów oporności na antybiotyki między bakteriami, jednakowoż takich fagów nie stosuje się w terapii. Istnieją pewne obawy, że fagi mogą spowodować szybkie zniszczenie dużej liczby bakterii Gram-ujemnych, co wiąże się z uwolnieniem endotoksyn bakteryjnych i zagrożeniem wystąpienia wielu objawów niepożądanych, włącznie ze wstrząsem kardiogennym, szczególnie u chorych predysponowanych [6]. Zjawisko to obserwowano u zwierząt i ludzi w przypadku niektórych antybiotyków [36]. Dotychczasowe badania przedkliniczne fagów nie potwierdzają jednak tej hipotezy [37]. Wyniki badań Ślopka i wsp. wskazują, że bakteriofagi nawet stosowane w postaci lizaków, rzadko powodują pojawienie się objawów niepożądanych [30]. Tylko u 3 ze 138 pacjentów (109 leczonych preparatami fagowymi doustnie i zewnętrznie, 22 tylko doustnie, a 7 tylko zewnętrznie) stwierdzono objawy niepożądane: u 2 wystąpiła nietolerancja po podaniu doustnym - objawiająca się głównie bólami wątroby między 3. a 5. dniem leczenia (prawdopodobnie spowodowanymi uwolnieniem endotoksyn). W jednym przypadku stosowania zewnętrznego stwierdzono miejscowe objawy uczuleniowe. Na szczególne podkreślenie zasługuje fakt, że na dużym materiale Kliniki Chirurgii Uniwersytetu Jagiellońskiego, nawet przy podawaniu parenteralnym fagów i to u dzieci, włączając niemowlęta, praktycznie nie obserwowano poważnych objawów ubocznych zarówno w obserwacji doraźnej, jak i odległej [27]. Bruttin i Brussow, którzy 15 zdrowym ochotnikom podawali doustnie oczyszczonego faga T4 (fag E. coli) w dawce 103 pfu/ml i 105 pfu/ml, również nie obserwowali częstszego występowania objawów niepożądanych, związanych z przyjmowaniem fagów (w tym wzrostu poziomu transaminaz) w porównaniu z placebo [38]. Nieznane są skutki odległego w czasie oddziaływania fagów na organizm i materiał genetyczny człowieka. Jednak warto podkreślić, że przez ponad 30 lat test powstawania przeciwciał w odpowiedzi na dożylnie podane fagi służy monitorowaniu odpowiedzi immunologicznej u pacjentów z niedoborem odporności (biorcy szpiku, zakażeni HIV, dzieci z niedoborami odporności w renomowanych centrach akademickich w USA) [39-41]. Co więcej, Food and Drug Administration po stwierdzeniu, że mimo oczyszczenia, niektóre szczepionki zawierają bakteriofagi oraz rozważeniu wszystkich za i przeciw, zgodziła się dopuścić do obrotu preparaty zawierające unavoidable bacteriophage [42]. Wydaje się zatem, że terapia fagowa jest w pełni bezpieczna i bardzo dobrze tolerowana, tym bardziej, że fagi te są naturalnym składnikiem naszego środowiska (woda, ziemia, pokarmy, są również obecne w przewodzie pokarmowym i ślinie). W konkluzji należy stwierdzić, że terapia fagowa może być metodą bezpieczną i o wysokiej skuteczności u chorych z zakażeniami lekoopornymi. Wydarzenia ostatnich miesięcy w pełni to potwierdzają, jako że zaczyna się ją również stosować w Wielkiej Brytanii i USA [43, 44].

TERAPIA BAKTERIOFAGAMI

Bakteriofagi są organizmami powiązanymi swoiście z określonym szczepem bakterii. Są przy tym całkowicie niegroźne dla innych drobnoustrojów. Tak dalece posunięta swoistość czyni je potencjalnym, precyzyjnym narzędziem diagnostycznym i terapeutycznym.

Fagi bakteryjne odkryte zostały w 1917 r. i określone jako „epizootyczne zakażenie bakterii”. Powszechnie stosowane były już w latach trzydziestych i czterdziestych ubiegłego stulecia. Żołnierze frontów II wojny światowej nosili w podręcznych apteczkach fiolki z bakteriofagami na wypadek zranienia i zakażenia. Fagi zostały jednakże wyparte przez antybiotyki, które wówczas okazały się skuteczniejsze, bezpieczniejsze i prostsze w użyciu. Ówczesne ograniczenia w technice badawczej uniemożliwiły poznanie pełnych możliwości bakteriofagów.

Badania przeprowadzone w ostatnich latach zmieniły pogląd na temat możliwości zastosowania wirusów bakteryjnych w diagnostyce i terapii. Niewykluczone, że bakteriofagi staną się równie lub bardziej skuteczną bronią w walce z drobnoustrojami niż chemiofarmaceutyki. Częstokroć nieuzasadnione stosowanie antybiotyków przez całe dziesięciolecia doprowadziło do powstania nowych szczepów bakterii, opornych na tradycyjne środki. Obecnie powstają firmy biotechnologiczne, w których pracuje się nad zastosowaniem bakteriofagów do leczenia chorób zakaźnych - od gruźlicy po salmonellozę.

Pierwsze terapeutyczne zastosowanie fagów bakteryjnych miało miejsce w Paryżu, gdzie poddano je czterem pacjentom chorym na czerwonkę bakteryjną. Leczenie okazało się w 100% skuteczne. Ścisła specyficzność fagów w stosunku do docelowych szczepów bakteryjnych czyni je również przydatnym narzędziem diagnostycznym.

Terapia polega na zastosowaniu bakteriofagów, w przypadku infekcji bakteryjnych u ludzi, zwierząt, ryb a nawet roślin w celu zredukowania ilości patogenów. Istnieje wiele kryteriów, przez które możemy rozróżnić wiele typów terapii. Po pierwsze różnią się one drogą podawania fagów. Można je podawać: miejscowo, doustnie, bezpośrednio do tkanek lub systemowo.

Drugim czynnikiem różnicującym, również związanym z dostarczaniem, jest sposób podania. Stosuje się wolne fagi, co jest rozwiązaniem najczęstszym lub zainfekowane danym fagiem bakterie dostarczające wiriony do docelowej lokalizacji. Naturalna zdolność fagów litycznych do zabijania bakterii może być wykorzystana bezpośrednio lub fagi mogą być traktowane jako bardzo wydajny sposób dostarczenia niefagowych genów kodujących substancje antybakteryjne.

Sukces terapii zależy w głównej mierze od podstawowych reguł oddziaływania fag - bakteria. Poza tym jest ona tym efektywniejsza im silniejsze wiązanie się faga do bakterii, jej liza i amplifikacja wirionów. Jeśli rozpocznie się terapie podczas późnej fazy infekcji, może zajść potrzeba kompensacji przez użycie większych dawek fagów . Podstawowym warunkiem jest konieczność zainfekowania przez faga choć jednej bakterii, zanim ich ilość będzie tak duża, że różne procesy związane ze wzrostem i metabolizmem patogenu staną się uciążliwe i szkodliwe dla pacjenta. Kluczem do sukcesu są wiec w przypadku fagów:

3.1 Terapia bakteriofagami przeciw patogenom bakteryjnym w rolnictwie i hodowlach zwierząt

 Bakteriofagi można wykorzystać wszędzie tam, gdzie tylko pojawiają się ich naturalni gospodarze - bakterie. W ostatnich latach coraz częściej słyszy się o wykorzystaniu fagów jako środków kontrolujących wzrost patogenów roślinnych. Polega to na wprowadzeniu specyficznych fagów do określonego ekosystemu w celu redukcji rozmiarów populacji konkretnych bakterii. Takie użycie fagów pozwala na określenie terapii fagowej jako formy biokontroli, czyli wykorzystaniu jednego organizmu w celu likwidacji innego. Jak w przypadku innych form biokontroli, zaletą takiego postępowania jest redukcja użycia środków chemicznych przeciw szkodnikom, co w tej sytuacji oznacza zmniejszenie wykorzystania antybiotyków.

Terapię fagami u roślin, zakończoną pełnym sukcesem, zastosowano do tej pory w przypadku takich zakażeń bakteryjnych jak:

Fagi można również stosować jako środek usprawniający wiązanie azotu z gleby przez bakterie brodawkowe. Metodę tą zastosowano m.in. w przypadku Bradyrhizobium japonicum. Nie jest ona bezpośrednia. Polega na doborze odpowiednich fagów specyficznych względem infekcji bakterii konkurencyjnych w stosunku do szczepów brodawkowych. Efektem takiego postępowania jest wzrost liczebności mikroorganizmów wiążących azot, a co za tym idzie zwiększenie plonów roślin motylkowych.

Wdrożenie fagów do uprawy roślin, mimo bardzo dobrych wyników wstępnych badań i wielu zalet, napotyka poważne problemy. Po pierwsze występują trudności w sukcesywnym przeniesieniu wyników laboratoryjnych na pola uprawne. Rolnicy, obciążeni wydatkami na walkę z chwastami, insektami, grzybami czy wirusami roślinnymi, nie wykazują zbyt dużego zainteresowania nowymi technologiami. Poza tym panuje ogólna, nieuzasadniona obawa o rozprzestrzenienie się fagów w danym ekosystemie - zarówno „ w dół” jak i w „ w górę” - na talerz człowieka. Pomija się przy tym fakt wszechobecności wirusów bakteryjnych, wysokiej ich labilności oraz znikomej specyficzności względem flory bakteryjnej u ludzi a także procesy, którym ulegają produkty rolne zanim trafią na rynek spożywczy. Dlatego też wszelkie obawy, związane z użyciem fagów wydają się nie mieć potwierdzenia naukowego.

Innym problemem jest sama natura zakażeń bakteryjnych u roślin. Patogeny bardzo często występują w postaci zbitej i gęstej masy, otoczonej pozakomórkowymi polisacharydami. Uniemożliwia to efektywną adsorpcję fagów do bakterii i zmniejsza wydajność terapii.

Bakteriofagi mogą być również skutecznie wykorzystane do zwalczania infekcji u zwierząt hodowlanych. Stosowano je np. w przypadku zakażeń kurczaków wywołanych przez bakterie Campylobacter jejuni. Zakażenia tą bakterią jest jedną z głównych chorób zakaźnych układu pokarmowego. Odpowiedzialna jest ona za prawie 500 milionów przypadków biegunki rocznie. Campylobacter jejuni żyją w przewodzie pokarmowym wielu zwierząt domowych, takich jak drób, świnie, krowy czy owce, u których nie wywołują żadnych objawów. Niestety, u ludzi pod wpływem zakażenia Campylobacter jejuni pojawia się wysoka gorączka, mdłości, bóle brzucha i biegunka. Bakterie wydalane z kałem zakażają następne zwierzęta i dlatego infekcja, szczególnie w dużych hodowlach, np. fermach drobiowych, szerzy się w zastraszającym tempie. Bakterie można oczywiście zwalczać antybiotykami, jednak nadużywanie antybiotyków jest groźnie nie tylko dla zwierząt, ale także spożywających ich mięso czy jaja ludzi. Grupa naukowców z Uniwersytetu w Nottingham pod kierunkiem Catherine Loc-Carrillo wykorzystała naturalny mechanizm walki z bakteriami do zwalczania infekcji Campylobacter jejuni wśród drobiu. Badacze wyizolowali z odchodów zakażonych kurczaków wirusy bakteryjne atakujące bakterie Campylobacter. Wyizolowane bakteriofagi, infekujące Campylobacter jejuni, zostały przerobione na naturalny lek. Podawane kurczakom zmniejszyły w ciągu trzech dni ilość bakterii Campylobacter jejuni żyjących w jelitach kurczaków o 100 a nawet 100 tysięcy razy, zależnie od typu wykorzystanego wirusa i zastosowanej dawki.

Terapie stosuje się także do leczenia chorób bakteryjnych u bydła. Fagi, które są wysoko aktywne i lizujące in vitro a także przyłączają się do antygenu K1 szczepu E. coli są bardzo wydajnym sposobem w profilaktyce, a także leczeniu posocznicy i zapalenia mózgu lub opon mózgowych zarówno u bydła, jak także u kurczaków. Terapia fagami jest dużo bardziej efektywna i skuteczna niż antybiotyki. W ciągu 5 minut od wstrzyknięcia do mięśnia fagi są znajdowane we wszystkich badanych tkankach ( w mięśniach, krwi, śledzionie, wątrobie i mózgu). Przeprowadzono badania nad skutecznością terapii fagami u krów cierpiących na czerwonkę spowodowana przez toksyny produkowane przez E. coli. Osobniki, które zareagowały na leczenie fagami miały niższą ilość bakterii w odcinku żołądkowo-jelitowym i ciągle wydalały fagi dopóki toksyczna E. coli była obecna w organizmie.

Ponieważ zwierzęta są potencjalnie narażone na infekcje bakteryjne i mogą stać się ich rezerwuarem, co zagraża także zdrowiu ludzi, stosowanie terapii fagowej u zwierząt staje się coraz bardziej powszechne. Dotychczas fagi zastosowano z powodzeniem w leczeniu zakażeń:

3.2 Terapia bakteriofagami przeciw patogenom bakteryjnym w przemyśle

 Innym przykładem biokontroli jest wykorzystanie bakteriofagów w przemyśle, rozumiane jako redukcja ilości bakterii w produktach spożywczych. Duża ilość wyrobów (np. surowe mięso, drób, świeże owoce) charakteryzuje się minimalnym przetworzeniem. Wynika to częściowo z chęci uniknięcia zmian smaku, przez procesy takie jak np. gotowanie czy pasteryzacja a częściowo z konieczności zachowania oryginalnej tekstury. Negatywną stroną takiego postępowania jest fakt, iż produkty takie bardzo często infekowane są przez patogenne bakterie. Coraz bardziej popularne staje się stosowanie fagów przy produkcji takich artykułów, szczególnie gdy gotowanie lub inne zabijające patogeny procesy nie są stosowane przed zakupem wyrobu przez konsumenta.

Metoda ta jest bardzo prosta, tania a przede wszystkim bardzo skuteczna. Wynikiem tego jest coraz większe zainteresowanie zastosowaniem fagów w przemyśle produkującym nie termicznie przetworzone artykuły spożywcze Stosuje się ją w przetwórstwie takich produktów jak:

Wyniki zastosowania fagów w biokontroli rozwoju patogennych organizmów wymienionych wyżej, są bardzo obiecujące. We wszystkich przypadkach obserwuje się oczekiwany, znaczący spadek ilości bakterii.

Fagi znalazły także zastosowanie jako środek ograniczający tworzenie biofilmów w instalacjach przemysłowych zakładów produkujących żywność. Przeprowadzono między innymi badania nad biokontrolą L. monocytogenes, bardzo efektywnie tworzącej biofilmy w kanałach odpływowych, co utrudnia proces odkażania. Taki sposób użycia fagów, może okazać się również przydatny dla środowiska medycznego. Tworzenie przez bakterie biofilmów na powierzchniach takich instrumentów jak np. cewniki jest uciążliwym i częstym problemem

 

3.4 Terapia bakteriofagami przeciw infekcją bakteryjnym u ludzi

Bakterie odporne na prawie wszystkie dostępne antybiotyki powodują coraz częściej poważne problemy. Wzrasta strach przed powrotem do ery przed antybiotykami - ery nieuleczalnych chorób i epidemii. Jednym z przykładów jest kolonizacja drogi żołądkowo-jelitowej przez wankomycyno-odporne Enterococcus faecium (VRE), endemiczna w wielu szpitalach. Taka kolonizacja usposabia/wytwarza skłonność osób do bakteremii VRE i/lub zapalenia wsierdzia a u pacjentów z upośledzonym systemem immunologicznym stanowi poważne zagrożenie. Pomimo ze firmy farmaceutyczne intensywnie pracują nad nowymi lekami, nie wynaleziono juz od ponad 30 lat żadnej nowej klasy antybiotyków. Powstanie antybiotykoopornych szczepów bakterii zmusiło naukowców do poszukiwania alternatywnych antybakteryjnych terapii, jak np. zdolność bakteriofagów w leczeniu zakażeń bakteryjnych. Po raz pierwszy zaobserwowano bakteriolityczna aktywność fagów w 1896 roku. M.E Hankin zauważył znaczne antybakteryjne działanie wód dwóch indyjskich rzek Gangesu i Jamuny przeciw VibrioCholorae.

Ze względu na wykładniczy wskaźnik samoreplikacji fagów, przeważnie już mała dawka wirusa jest wystarczająca dla leczenia infekcji bakteryjnych. Bakteriofagi mogą wnikać głęboko do miejsca infekcji i zniszczyć wszystkie rozwijające się tam komórki bakterii. Antybiotyki, z drugiej strony, często spotykają trudności w penetracji miejsc infekcji, co sprawia ze dostarczanie leku do wszystkich bakterii staje się znaczącą przeszkodą. Ta przeszkoda rzadko pojawia się w przypadku użycia fagów. W dodatku fagi poprzez fakt ze są samoreplikujące są również samolimitujące. Kiedy wszystkie bakterie są juz zainfekowane bakteriofagami ich liczba zaczyna spadać wraz z liczba bakteriofagów. Fagi wymagają do egzystencji komórki gospodarza a jej brak powoduje ich szybka śmierć.

Przygotowanie fagów jest bardzo proste i może być prowadzone w niemal każdej standardowej pożywce. Fagi mogą być trzymane przez długi okres czasu a koszty ich produkcji są bardzo niskie. Obecnie terapie fagami stosuje się w leczeniu pooparzeniowych infekcji bakteryjnych, które są głównym powikłaniem szczególnie w przypadku poważnych poparzeń trzeciego stopnia. Nie dłużej niż po 24 godzinach poparzeni pacjenci mogą zacząć cierpieć na zakażenia opurnistycznymi bakteriami. Jako alternatywa dla antybiotyków w leczeniu pooparzeniowych infekcji bakteryjnych fagi były stosowane w wielu częściach świata jak np. w Tbilisi w Gruzji oraz w Polsce. Dziś są dużo bardziej popularne.

Wyniki pokazują również ze terapia fagami jest w 80% skuteczna w przypadku zakażeń Enterococcus a w 90% w przypadku Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae.

Pseudomonas aeruginosa jest najczęściej występującą bakteria w przypadku infekcji pooparzeniowych i notorycznie odporną na różnorodne antybiotyki. Dla zwiększenia efektywności terapii stosuje się koktajle złożone z wielu gatunków fagów, co minimalizuje rozwiniecie odporności bakterii na danego faga. Koktajl taki używany jest w postaci aeorezolu lub w postaci roztworu. Leczenie polega na spryskiwaniu/przemywaniu potencjalnego miejsca infekcji. Roztwory z fagami mogą znaleźć również zastosowanie jako środki dezynfekujące do mycia powierzchni i instrumentów w salach operacyjnych, a także mogą być stosowane miejscowo u pacjentów przed operacja.

W Polsce i na terenach dawnego Związku Radzieckiego leczenie fagami ma już długoletnią tradycję, ale jego skuteczność była rzadko potwierdzona badaniami. Istnieją sporadyczne doniesienia w prasie rosyjskojęzycznej dotyczące zastosowania wirusów bakteryjnych w terapii zakażeń ropnych. Nieco więcej prac opublikowali badacze polscy. Ślopek i wsp. leczyli 138 pacjentów z sepsą bakteriofagami, z czego większość stanowiły przewlekłe zakażenia bakteriami opornymi na antybiotyki. W 129 przypadkach (93,5%) uzyskano bardzo dobre wyniki, a w 9 (6,5%) stwierdzono częściową poprawę . Z kolei dr Weber-Dąbrowska i wsp. w latach dziewięćdziesiątych przebadali 1307 pacjentów z ropnymi zakażeniami wywołanymi przez bakterie oporne na tradycyjną terapię antybiotykową. U pacjentów tych zastosowano leczenie bakteriofagami. W 1123 przypadkach (85,9%) stwierdzono całkowite wyleczenie. W 134 przypadkach (10,9%) zaobserwowano częściową poprawę, a tylko w 50 przypadkach (3,8%) terapia bakteriofagami nie przyniosła rezultatu. Wyniki tych prac wskazują na potencjalną skuteczność bakteriofagów w leczeniu infekcji bakteryjnych, również tych, które są oporne na tradycyjną terapię wspomaganą antybiotykami.

Bardzo dobre wyniki w terapeutycznym wykorzystaniu fagów odnosi Eliava Institute Tbilisi w Gruzji. Z powodzeniem przeprowadza się tam terapie fagami takich schorzeń jak ropne zapalenia szpiku kostnego, zakażenia ran odleżynowych i pooparzeniowych czy zakażenia różnego typu owrzodzeń.

3.5 Wzajemne oddzialywania pomiedzy bakteriofagami a komórkami ssaków

Podczas gdy zdolność bakteriofagów do infekowania bakterii jest znana od czasów ich odkrycia, wiedza na temat interakcji fagów z komórkami ssaków jest bardzo ograniczona. Faktycznie, fagi są uważane za niemające wrodzonego tropizmu dla tych komórek. Tropizm ten można jednak zaobserwować stosując fuzje białek fagowych z receptorami komórkowymi ssaków. W ten sposób powstały miedzy innymi wektory fagowe, przystosowane do przenoszenia genów.

Fagi są najbardziej rozpowszechniona forma życia na Ziemi, będącą praktycznie wszechobecną. Są one spożywane wraz z pokarmem, a niektóre źródła wody mogą zawierać do 10 9 (biliona) wirionów na mililitr. Merril wykrył fagi w zwierzęcej surowicy i zasugerował, że powinno rozpocząć się badania nad wzajemnymi oddziaływaniami fagów i komórek ssaków. Co więcej somatyczne kolifagi są wykrywane w 68% a fagi B. fragilis w 11 % wydalin zdrowych ludzi, podczas gdy fagi Enterococcus faecalis mogą być obecne w ludzkiej ślinie, co sugeruje ich role w ustnym ekosystemie.

Od kiedy odkryto jak znaczące mogą być fagi w naszym środowisku zaczęto zastanawiać się czy ciało człowieka może je rozpoznać i uruchomić przeciw nim odpowiedz immunologiczną. Rzeczywiście zwiększona liczba przeciwciał przeciw fagom Staphylococcus może być wykryta u 10% zdrowych i 44% zainfekowanych gronkowcem osób ( u osób z ostra infekcja ilość przeciwciał może być nawet ok. 4 razy większa). Podczas powtórnego zakażenia obserwuje się spadek miana. Dane te sugerują, że naturalnie występujące fagi mogą indukować odporność humoralna.

Przeciwciała antyfagowe znajdywane są również w surowicy osób poddanych terapii bakteriofagami. Ponadto, humoralna odpowiedz in vivo na faga phi X174 była używana przez ponad 30 lat w immunologii klinicznej jako miara zależnej od limfocytów T H produkcji przeciwciał. In vitro, anty-phi X174 przeciwciała są produkowane przez limfocyty immunizowane fagami. Sugeruje to ze ludzie są zdolni do odpowiedzi immunologicznej na bakteriofagi, co wydaje się być jednak nieszkodliwe. Hipotezę ta potwierdzaja badania Wengera, ktory badał in vitro wplyw fagów na limfocyty ludzkie i embrioniczne komórki nerek. Badania te nie udowodnily żadnych szkodliwych dzialan fagów.

Wiadomo tez ze ekspresja genów eukariotycznych wlaczonych w genom fagowy jest mozliwa jako efekt inzynierii genetycznej (uzywanie bakteriofagów jako wektorów). Np. fag lambda został użyty w celu komplementacji wrodzonego braku enzymów w ludzkich fibroblastach. Wiele przedsiewziec tego rodzaju użycia wektorów pokazuje zdolnosc fagów do internalizacji z komórkami eukariotycznymi, ale żadna amplifikacja fagów ani zniszczenie komórek nie zostala zaobserwowana. Nic tez nie wskazuje na to żeby fagi byly szkodliwe dla badanych komórek.

Fagi posiadaja zdolnosc do łączenia się z komórkami ssaków, ponadto znana jest preferencyjna akumulacja wirionow w tkankach nowotworowych i inhibicja ich wzrostu. Naukowcy sugeruja rowniez ze fagi T2 wiaza się do leukocytów, a nawet posiadaja zdolnosc przylaczania się do błony limfocytarnej. Nie wiadomo jeszcze poprzez jakie receptory może zachodzic to wiązanie. Wirusy (HIV, HPEV1 i hantawirus) uzywaja integryn (najczesciej β3) w celu zwiazania się z komórką. Co wiecej wiazanie adenowirusów rowniez zachodzi poprzez integryny, co może swiadczyc o podobnym mechanizmie u fagów. Niemniej jednak bakteriofagi mogą uzywac takze innych receptorów. Sugeruje się np., że fag CD26 jest ściśle związany z wnikaniem do komórek wirusa HIV. Patrząc dalej nie-integrynowe receptory DC- SIGN na komórkach dendrytycznych mogą przyłączać i transmitować wirusa HIV do wieku rodzajów komórek receptoro-pozytywnych. W dodatku glikoproteinowa otoczka B wirusa CMV jest również ligandem dla tych receptorów. Wykazano również ze podobnie wiążą się takie wirusy jak Ebola, rozszerzając infekcje na makrofagi i komórki śródbłonka.

Ostatnio zaproponowano hipotezę, że wirusy oddziaływają na makrofagi i limfocyty aktywując je a następnie używają ich jako „połączeń” z receptorami. Dlatego można oczekiwać ze naturalnie wystepujace fagi mogą uzywac podobnych mechanizmów do interakcji z komórkami eukariotycznymi. Niektóre bakteriofagi jak np. (T4 kolifagi) ekspresjonują sekwencję Lys-Arg-Gly (KGD) wiążącą β3 integryny (głównie αIIbβ3). Dlatego mogą się one wiązać do β3+ komórek (płytki krwi, monocyty, niektóre limfocyty i komórki nowotworowe) i regulowac ich aktywnosc poprzez inhibicje funkcjii

integryn. Jesli fagi naprawde uzywaja receptorów komorkowych do przylaczania do komórek eukariotycznych, odpowiedni ligand powinien znajdowac się na powierzchni fagów. W rzeczywistości sekwencja KGD obecna jest wewnątrz białka gp24 znajdującego się na główce niektórych fagów (np. T4). Sekwencja ta jest rozpoznawana przez główną integrynę płytek krwi αIIbβ3 (receptor dla fibrynogenu, czynnika von Willebranda i niektórych pozakomórkowych białek matrix). Integryny mogą być rowniez ekspresjonowane przez monocyty β3+ i αvβ3+, a także przez komórki nowotworowe gdzie wydaja się być zwiazane ze zdolnoscia do wzrostu i tworzenia przerzutów.

Ogólnie mowiac fagi posiadaja zdolnosc do wiazania się do komórek ekspreskonujących integryny αIIbβ3 i prawdopodobnie αvβ3. Ostatnio dowiedziono ze ligand CD40 (CD40L, CD154), znany jako zdolny do aktywacji śródbłonka i stymulujący stan zapalny posiada sekwencje KGD, pozwalającą mu na wiązanie αIIbβ3 i aktywacje płytek krwi. CD40L jest istotnym składnikiem procesu aktywacji limfocytów B i T a zaburzenia w oddziaływaniu CD40-CD40L hamuje odrzucanie przeszczepów, choroby autoimmunizacyjne oraz miażdżycę tętnic i angiogenezę. Fagi KGD+ mogą wspolzawodniczyc z CD40L w wiazaniu do integryn β3 na powierzchni plytek krwii i limfocytów, co powstrzymuje ich dalsza aktywacje. Poprzez wiazanie αIIbβ3 na zaktywowanych limfocytach T fagi te mogą pokrywać ich powierzchnie (tzw opsonizacja fagami) oslabiajac ich naturalne funkcje i prawdopodobnie eliminacje z obiegu. Wiazanie do trombocytów, komórek monocytopodobnych i limfocytów może rowniez wyjasnic zjawisko, dlaczego endogenne fagi wywieraja słabe antybakteryjne dzialanie in vivo, podczas gdy w badaniach in vitro przeciw tym samym bakteriom są bardziej wirulentne. Z jednej strony takie wiazanie może znaczaco zmniejszyć dostępność fagów oraz dynamiczne oddziaływania pomiędzy fagami a bakteriami in vivo. Z drugiej wiązanie do trombocytów, płytek i komórek limfoidalnych wyjaśnia, dlaczego fagi są bardzo szybko usuwane z krwi przez śledzionę. Jeśli rzeczywiście fagi mogą wiązać się do komórek ssaków i być może wpływać na funkcje integryny β3 in vivo, może to zrewolucjonizować obecne zrozumienie ich właściwości biologicznych. W skutek tego fagi być może nie będą już tylko rozpatrywane jako wyłącznie wirusy bakteryjne, a ich właściwości będą mogły być zastosowane nie tylko jako czynniki antybakteryjne, ale także jako potencjalne leczenie chorób sercowo-naczyniowych i autoimmunologicznych a także znajda zastosowanie w transplantologii. Również jako potencjalne blokery aktywności integryny β3 w komórkach nowotworowych, powstrzymujące ich wzrost i metastazę znajdą być może zastosowanie w leczeniu nowotworów.

 3.6 Zalety stosowania bakteriofagów.

 Terapia fagami ma specyficzne korzyści w porównaniu z użyciem chemicznych środków antybakteryjnych. Pierwszą zaletą jest fakt, iż bakteriofagi nie są małymi (w porównaniu ze związkami chemicznymi) cząsteczkami zdolnymi do modyfikacji a przez to do niszczenia metabolizmu użytkownika. Swoje dobroczynne działanie wywierają poprzez interakcje z bakteriami. Ponadto fagi mają zdolność samoreplikacji. Zatem raz podana porcja fagów może samoamplifikować w trakcie leczenia, przyczyniając się do wzrostu jego efektywności. Trzecią zaletą jest fakt, iż replikacja w bakterii powoduje uwolnienie fagów potomnych w samym miejscu infekcji. Już jedna sukcesywnie zakażona bakteria powoduje lepszą penetracje i ułatwia fagom znalezienie kolejnych potencjalnych gospodarzy, co w porównaniu ze specyficznością związków chemicznych przynosi dużo lepsze rezultaty.

Podczas gdy bakterie mogą łatwo mutować i przez to nabierać odporności, wszechobecność i różnorodność fagów w przyrodzie, różniących się zakresem gospodarzy zapewnia ogromną liczbę alternatywnych wirusów zdolnych do zakażenia bakterii. Poza tym ewolucja bakteriofagów przebiega relatywnie szybciej .Ponadto możliwe jest stosowanie mieszanek wielu fagów, co stanowi ekwiwalent wielolekowej terapii. Powoduje to, iż odporność jest eliminowane już na samym początku leczenia. Rzadko spotykana oporność bakterii na fagi jest kolejną ich zaletą w porównaniu z antybiotykami. Pozatym izolacja nowych fagów przeciw odpornym bakteriom trwa dni lub tygodnie (przy bardzo niewielkich kosztach). Natomiast produkcja nowych antybiotyków, zajmuje lata i pochłania ogromne środki finansowe.

Następna zaleta wynika z wąskiego spektrum aktywności bakteriofagów, szczególnie w porównaniu z antybiotykami. Fagi nie tylko są monowalentne, co przejawia się w tendencji do zakażania tylko jednego gatunku lub nawet malej liczby szczepów wewnątrz niego. Nawet jeśli poszczególne fagi są poliwalentne i przez to zdolne do infekowania wielu rodzajów bakterii, nie wpływa to jednak na przebieg infekcji danego gatunku. Cechy te pozwalają na zmniejszenie prawdopodobieństwa nadkażenia i innych problemów związanych z redukcją normalnej flory bakteryjnej, co często pojawia się w wyniku stosowania chemicznych środków antybakteryjnych. Terapia fagami pozwala uniknąć takich skutków ubocznych jak grzybice czy biegunki, będących wynikiem stosowania antybiotyków.

Produkcja bakteriofagów charakteryzuje się bardzo niskimi kosztami. Bakterie infekowane przez fagi mogą być hodowane w konwencjonalny sposób. Po przeprowadzeniu lizy określonych mikroorganizmów ( co pozwala także na ich identyfikację i izolację), bakteriofagi mogą być oczyszczone przez zastosowanie filtrów membranowych, wirowanie i inne standardowe metody. Preparaty zawierające fagi charakteryzują się wysoką stabilnościa i mogą być składowane przez dlugi okres czasu.

3.7 Ograniczenia terapii i sposoby ich obejścia

Jak widać istnieje wiele zalet terapii fagami, ale nie zawsze są one wystarczające, aby stanowiła ona alternatywną metodę dla obecnych standardów leczenia. Istnieje bowiem wiele przeszkód uniemożliwiających powszechne stosowanie fagów. W szczególności fagi kodują geny toksyn bakteryjnych, czyli w przebiegu lizogenii mogą przekształcić nieszkodliwe bakterie w patogeny. Ponieważ nie wszystkie bakteryjne czynniki powodujące ich zjadliwość są poznane wykazanie niezdolności fagów do zwiększania patogenności bakterii podczas infekcji nie jest znikomym problem. Próbą rozwiązania tego zjawiska jest unikanie stosowania fagów zdolnych do lizogenii lub nawet tych, które posiadają geny odpowiedzialne za tą właściwość. Możliwe jest także rozwiązanie polegające na stosowaniu fagów o w pełni poznanych właściwościach wraz z fagami, które nie są poznane, ale nie posiadają i zdolności do replikacji, lecz służą jako wektory dla dostarczania genów kodujących czynniki antybakteryjne. Prowadzi to jednak do zawężenia ilości dostępnych dla terapii fagów i dodatkowo do eliminacji korzyści z wykładniczej natury namnażania wirionów, związanego z penetracją przez fagi kolonii bakteryjnych. Rezultatem tego jest spadek efektywności terapii.

Pomocna okazuje się tutaj inżynieria genetyczna, mogąca dostarczyć jako platformy dobrze poznanego faga (np. λ),a następnie dzięki manipulacjom genetycznym rozszerzyć np. jego zakres gospodarzy. Nie wszystkie bowiem patogeny bakteryjne posiadają dobrze poznane fagi, mogące być wykorzystane w terapii. Patrząc jednak dalej, taka platforma może osłabić zalety terapii, głównie te wynikające z możliwości typowania fagów specyficznych względem poszczególnych szczepów bakterii.

Inne problemy, które można napotkać w trakcie potencjalnego wdrażania terapii to przewlekle infekcje ogólnoustrojowe i brak wsparcia dla terapii przez lokalne laboratoria. Znaczy to że, podczas gdy zawężone spektrum aktywności przypisanej fagom, mimo że jest niewątpliwą korzyścią terapii, jest również problemem związanym z efektywna identyfikacją danego patogenu, szczególnie z perspektywy jego wrażliwości na fagi. Alternatywnie można by sporządzać mieszanki fagów, działające na szerokie spektrum bakterii. Prawdopodobnie jednak skomplikowałoby to proces terapii i odsunęło ją od korzyści pierwotnie z niej wynikających. Idealnym rozwiązaniem byłby system, w którym jedno z miejscowych laboratoriów nie tylko identyfikowałoby bakterie, ale i również określało spektrum ich wrażliwości na fagi, tak jak robi się to w przypadku określania spektrum wrażliwości na antybiotyki.

Inną wadą jest to, że będąc obcym dla organizmu fagi są z niego bardzo szybko usuwane i nie maja dostatecznej ilości czasu by dotrzeć i zabić wszystkie infekujące bakterie. Problem ten próbuje się rozwiązać przez tzw. „seryjne pasażowanie”, mające na celu wyizolowanie długo krążących w organizmie szczepów. Fagi powstałe w wyniku tego procesu charakteryzują się znacznie wyższą efektywnością niż ich dzikie odpowiedniki .


Wyszukiwarka