MIKROBIOLOGIA laboratorium 9-10 Analiza mikrobiologiczna GLEBY, Studia, OŚ, Mikrobiologia


Temat 9: Analiza mikrobiologiczna gleby

Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

1.Gleba - to powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej skały, przekształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe. Gleba jest złożonym utworem umożliwiającym funkcjonowanie ekosystemów glebowych. W skład gleby wchodzą cząstki stałe mineralne i organiczne, powietrze i roztwór glebowy oraz bytujące w niej organizmy żywe - edafon. Proporcje poszczególnych składników w glebie utrzymują się mniej więcej na tym samym poziomie właściwym dla danej gleby.

2. Edafon glebowy

Ze względu na rozmiar organizmy żyjące w glebie można zaliczyć do trzech grup:

- Mikrobiota (niedostrzegalne gołym okiem)- wirusy, bakterie, grzyby, pierwotniaki, glony

- Mezobiota (0,2-2 mm) - wazonkowce, nicienie, ślimaki, owady bezskrzydłe, wije, roztocza i inne, małe rośliny,

- Makrobiota (>2 mm) - dżdżownice, krety, gryzonie np. myszy polne, większe owady, korzenie dużych roślin i drzew.

3. Charakterystyka mikroorganizmów glebowych.

Wirusy

Bakterie

Grzyby

Rola bakterii i grzybów

Flora glebowa (fitoedafon)

Fitoedafon stanowią głównie glony, oraz w mniejszym stopniu rośliny wyższe.

Glony stanowią główny składnik fitoedafonu. Najliczniej występują na powierzchni gleby; do głębszych warstw dostają się na skutek jej uprawy, przesiąkania wody, działalności zwierząt i zdolności migracji. Wyróżniamy zbiorowiska glonów żyjących na powierzchni gleby - epifitoedafon oraz w głębszych jej warstwach - endofitoedafon

Fauna glebowa

Mikrofauna glebowa reprezentowana jest przez pierwotniaki (Protozoa). Odżywiają się one głównie bakteriami, ich rola polega na selekcji i odmładzaniu populacji bakterii glebowych. Dominują wśród nich korzenionóżki (ameby) i wiciowce. Mezofaunę reprezentują nicienie, wazonkowce, ślimaki, owady, wije, roztocza i inne. Odżywiają się one martwą materią organiczną przyczyniając się do tworzenia próchnicy. Spośród makrofauny pewne znaczenie mają dżdżownice, krety, gryzonie, które rozdrabniają materiał glebowy i przenoszą go na znaczną głębokość. Najważniejszą rolę wśród bezkręgowców odgrywają w glebie dżdżownice, które odżywiają się martwą materią organiczną, pobierając ją wraz z mineralną częścią gleby. Niestrawione resztki zmieszane z glebą mineralną i metabolitami wydalają w postaci grudek (koprolitów), przyczyniając się w ten sposób do tworzenia korzystnej gruzełkowatej struktury gleby i do jej spulchniania. W ciągu roku dżdżownice mogą na hektarze przepuszczać przez swój przewód pokarmowy około 7 tys. kg gleby. Dzięki ruchliwości zwierząt gleba ulega ciągłemu mechanicznemu mieszaniu, co powoduje lepsze jej napowietrzenie, natlenienie i przepływ wody.

4. Podział mikroflory glebowej ze względu na pochodzenie

Mikroflora autochtoniczna

Mikroflorę gleby dzieli się na autochtoniczną i zymogeniczną. Drobnoustroje autochtoniczne czerpią energię z rozkładu materii organicznej powodując jej mineralizację. Przedstawicielami tej grupy w glebie są najczęściej drobnoustroje, dla których źródło węgla i energii stanowią substancje humusowe, tj. związki powstałe z rozkładu i przetworzenia materii organicznej pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Przedstawicielami tej grupy najczęściej tlenowe nieprzetrwalnikujące bakterie z rodzaju Arthrobacter oraz prątki z rodzaju Mycobacterium. Stałymi mieszkańcami gleby są także promieniowce z rodzaju Streptomyces i Nocardia oraz bakterie śluzowe (Myxobacteriales). Dla gleby, choć nie tylko dla niej, charakterystyczne są bakterie wiążące azot atmosferyczny, bakterie nitryfikacyjne. Pospolite są także tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus i beztlenowe z rodzaju Clostridium.

Mikroflora zymogeniczna

Drobnoustroje zymogeniczne wprowadzane są do gleb okresowo. Pochodzą one z wprowadzanych do gleb ścieków, odpadów komunalnych i przemysłowych oraz z odpadów powstających w hodowli zwierząt (np.obornik i gnojówka), to organizmy o dużych wymaganiach odżywczych, których rozwój uzależniony jest od dopływu świeżej, łatwo przyswajalnej materii organicznej. Bakterie zymogeniczne bytujące w glebie to głównie gramujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae oraz z rodzaju Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium.

W glebie zanieczyszczonej odchodami czy szczątkami zwierząt i roślin mogą występować drobnoustroje chorobotwórcze (patogenne). Spośród bakterii szczególnie niebezpieczne dla człowieka są pałeczki duru brzusznego z rodzaju Salmonella i pałeczki czerwonki - Shigella., beztlenowe laseczki wywołujące tężec - Clostridium tetani, zgorzel gazową - Clostridium perfringens, zatrucia pokarmowe - Clostridium botulinum oraz tlenowe laseczki wąglika - Bacillus anthracis, a także prątki - Mycobacterium tuberculosis.

Ponadto do bakterii chorobotwórczych występujących w glebie zalicza się niektóre promieniowce wywołujące tzw. promienicę. Grzyby są przyczyną zakażeń skóry i tkanek wewnętrznych, a organizmy zwierzęce jak pierwotniaki i robaki - chorób głównie przewodu pokarmowego. Szczególną uwagę należy zwrócić na możliwość występowania w glebie jaj robaków pasożytniczych np. glisty ludzkiej. Jej jaja przechodzą w glebie okres dojrzewania i wykazują dużą odporność na działanie czynników zewnętrznych. Podobnie jak endospory bakterii, zarodniki grzybów i cysty pierwotniaków, mogą przez długi okres czasu bytować w glebie i stanowić zagrożenie dla człowieka.

5. Ocena jakości gleby za pomocą analizy mikrobiologiczno-helmintologicznej.

5.1. Analizę stosuje się do oceny:

Ponadto uzyskane wyniki mogą być przydatne do wyjaśnienia dróg zakażenia i określenia czasu przeżywalności mikroorganizmów chorobotwórczych w glebie. Są one również istotne z punktu widzenia możliwości zakażenia poprzez glebę wód gruntowych i powierzchniowych.

5.2. Zakres analizy mikrobiologicznej gleby pod względem sanitarnym powinien obejmować:

Stopień zanieczyszczenia gleby jajami robaków (helmintów) określa się w odniesieniu do 100 g gleby, uznając glebę za:

Ponadto badania uzupełnić można o oznaczenia:

5.3. Określenia stosowane w analizie mikrobiologiczno-helmintologicznej gleby:

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Analiza mikrobiologiczno-helmintologiczna gleby

Pobieranie próbek do badań:

  1. Przy wyborze miejsca pobrania próbek gleby konieczne jest posiadanie danych charakteryzujących:

  1. Słoje zawierające próbki gleby należy zamknąć korkami z waty i zaopatrzyć w etykiety uwzględniające:

Przechowywanie i przesyłanie próbek:

Badanie bakteriologiczne gleby należy wykonać w dniu pobierania próbek. W razie konieczności ich przechowywania oraz podczas transportu do laboratorium należy umieścić je w temperaturze ok. 40C na okres nie dłuższy niż 24 h.

Przygotowanie próbki do badań:

Przed posiewem należy:

Zadanie 1. Badanie „ogólnej” liczby bakterii saprofitycznych, przetrwalnikujących

oraz termofilnych

Badanie przeprowadza się metodą płytkową Kocha stosując posiew wgłębny próbek

na podłoże agarowe odżywcze. Badania obejmują określenie:

  1. „ogólnej” liczby bakterii na podłożu agarowym odżywczym - zwykłym, w temperaturze - 280C w czasie inkubacji - 48±2 h,

  2. liczby bakterii termofilnych - na podłożu agarowym odżywczym - 3 %, w temperaturze 550C, czas inkubacji-24±2 h.

  3. liczby bakterii wytwarzających przetrwalniki (sporowych) - na podłożu agarowym odżywczym - zwykłym, w temperaturze 280C, czas inkubacji-48±2 h,

Zadanie 2. Wykrywanie bakterii grupy coli i bakterii coli typu kałowego (Escherichia

coli)

Bakterie wykrywa się metodą fermentacyjną probówkową, opartą na zdolności tych

bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz widocznego

gazu.

  1. Oznaczenia bakterii grupy coli przeprowadza się w 3 etapach:

Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się:

Za wynik ujemny badania wstępnego przyjmuje się:

Za wynik wątpliwy badania wstępnego przyjmuje się:

Badanie potwierdzające wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

Badanie uzupełniające wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

Posiewy 10 cm3 próbki rozcieńczonej 10-1 należy wykonać na podłoże o stężeniu podwójnym, a posiewy 1 cm3 próbek z rozcieńczeń 10-1 - 10-6 na podłoże o stężeniu normalnym.

  1. Oznaczenia bakterii coli typu kałowego (termotolerancyjnych), pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) - przeprowadza się w 2 etapach:

Identyfikowanie bakterii jako Escherichia coli, wykonuje się zgodnie z metodyką stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

Zadanie 3. Wykrywanie bakterii Clostridium perfringens

Przeprowadza się je stosując posiew wgłębny próbek na podłoże siarczynowo-żelazowe

wg. Wilsona-Blaira w temperaturze 370C przez 18-24±2 h. (Wykrywanie bakterii

Clostridium perfringens można przeprowadzać również metodą hodowli na pożywce

stałej).

Zadanie 4. Oznaczanie bakterii z rodzaju Salmonella

Badanie przeprowadza się w 2 etapach:

Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się:

Za wynik ujemny badania wstępnego przyjmuje się :

Za wynik wątpliwy badania wstępnego przyjmuje się:

Za wynik dodatni badania potwierdzającego przyjmuje się:

- zmianę barwy dolnej części podłoża na żółtą, podczas gdy

powierzchnia skośna pozostaje bez zmian (czyli ma kolor czerwony

tak jak pożywka wyjściowa),

- ciemnienie (zaczernienie) podłoża wskazujące na wytworzenie się

siarkowodoru z równoczesnym rozmieszczaniem się tego gazu

wewnątrz podłoża w postaci baniek.

Zadanie 5. Wykrywanie żywych jaj robaków jelitowych i określenie stadium ich

rozwoju:

Wykrywanie żywych jaj pasożytów jelitowych wykonuje się w 3 etapach:



Wyszukiwarka