Ćwiczenie I

Wyznaczanie energii aktywacji i krzywych progresji

Zadanie 1: Wyznaczanie energii aktywacji dla reakcji hydrolizy (inwersji) sacharozy

Sacharoza, czyli α-D-glukopiranozydo-β-D-fruktofuranozyd jest dwucukrem, który z powodu obecności formy furanozowej fruktozy w cząsteczce bardzo łatwo hydrolizuje nawet pod wpływem rozcieńczonych kwasów. Podczas hydrolizy dochodzi do odwrócenia kąta skręcania światła spolaryzowanego. W efekcie z prawoskrętnej sacharozy powstaje mieszanina lewoskrętnej fruktozy (lewulozy) i prawoskrętnej glukozy (dekstrozy) o dominującej skręcalności w lewo. Przebieg reakcji hydrolizy sacharozy z zaznaczeniem kątów skręcania światła spolaryzowanego przedstawiono na poniższym schemacie.

C₁₂H₂₂O₁₁ + H₂O → C₆H₁₂O₆ + C₆H₁₂O₆

[α]²⁰_D = + 66^o [α]²⁰_D = + 52,7^o [α]²⁰_D = - 92^o

Proces hydrolizy sacharozy może zachodzić, jak już wspomniano, pod wpływem nawet rozcieńczonych kwasów, ale także może być katalizowany swoiście przez β-D-fruktofuranozydazę (EC 3.2.1.26) zwaną również inwertazą lub sacharazą. Enzymatyczna hydroliza sacharozy jest powszechnie stosowana w produkcji cukierniczej, do przygotowywania syropów cukru inwertowanego używanego do wyrobu sztucznego miodu, cukierków, marmolad, konfitur, likierków, itp.

a) Hydroliza kwasowa

Do trzech probówek (dwie próby właściwe, jedna kontrola) rozlać po 5 cm³ 1% sacharozy. Jedną probówkę umieścić w łaźni wodnej w temp. 30^oC, drugą w łaźni w temp. 40^oC i dogrzewać ok. 5 min. Po dogrzaniu dodać do obu probówek po 1 cm³ 2,5% kwasu solnego (stoper!), wymieszać i pozostawić w łaźni przez 20 min. Przerwać reakcję hydrolizy (inwersji) dodając po 0,45 cm³ mieszaniny zobojętniającej (21,3 g Na₂CO₃ + 2,5 g NaHCO₃ / 100 cm³) mieszać do całkowitego wypienienia i ostudzić. Do trzeciej probówki - kontroli dodać najpierw mieszaniny zobojętniającej a potem kwasu (nie zachodzi reakcja hydrolizy). Roztwory z każdej probówki rozcieńczyć 10 razy wodą destylowaną, a następnie z każdego roztworu pobrać 1 cm³ i przenieść do nowych probówek.

Oznaczanie ilości cukrów redukujących metodą Somogyi - Nelsona

Z wzorcowego roztworu glukozy 10 mg % sporządzić wzorce o stężeniu glukozy równym:
0 (woda), 2,5 mg%, 5 mg%, 7,5 mg%, 10 mg% tzn.: do kolejnych probówek odmierzyć:

0,0 - - 1,00 cm³ wody

2,5 mg% - 0,25 cm³ glukozy + 0,75 cm³ wody

5,0 mg% - 0,50 cm³ glukozy + 0,50 cm³ wody

7,5 mg% - 0,75 cm³ glukozy + 0,25 cm³ wody

10 mg% - 1,00 cm³ glukozy -

Do każdej probówki (właściwe, kontrole i wzorce) dodać po 1 cm³ odczynnika miedziowego Somogyi, zamieszać i wstawić na wrzącą łaźnię wodną, gotować 10 min. Ostudzić i dodać po 1 cm³ odczynnika arsenomolibdenowego Nelsona. Mieszać otwarte probówki do całkowitego wypienienia i rozpuszczenia tlenku miedzi (I). Dopełnić wodą do 10 cm³, zatkać korkiem i wymieszać. Zmierzyć ekstynkcję przy długości fali równej 500 nm. Sporządzić krzywą wzorcową i odczytać stężenie monosacharydów w badanych próbach.

b) Hydroliza enzymatyczna

Do trzech probówek (dwie próby właściwe, jedna kontrola) odmierzyć po 0,5 cm³ 2% roztworu sacharozy w 0,1 M buforze octanowym o pH 5,0. Jedną probówkę umieścić w łaźni wodnej w temp. 30⁰C, drugą w łaźni w temp. 40⁰C i dogrzewać ok. 2 min. Po dogrzaniu dodać do obu probówek 0,5 cm³ roztworu inwertazy o stężeniu 0,0125 mg% (stoper!), zamieszać i pozostawić w łaźniach przez 20 min. Przerwać reakcję dodając do probówek po 1 cm³ odczynnika miedziowego Somogyi. Do trzeciej probówki - kontroli, pozostawionej w pokojowej temperaturze, dodać najpierw 1 cm³ odczynnika Somogyi a potem 0,5 cm³ roztworu inwertazy. Wszystkie probówki wstawić na wrzącą łaźnię wodną i gotować 10 min. Ostudzić i dodać po 1 cm³ odczynnika arsenomolibdenowego Nelsona. Mieszać otwarte probówki do całkowitego wypienienia i rozpuszczenia tlenku miedzi (I). Dopełnić wodą do 10 cm³, zatkać korkiem i wymieszać. Zmierzyć ekstynkcję przy długości fali równej 500 nm i odczytać z krzywej wzorcowej odpowiadające jej stężenie monosacharydów.

Obliczenia: obliczyć energię aktywacji dla obu katalizowanych reakcji wg poniższych zasad.

Wyznaczanie energii aktywacji

Energia aktywacji G_a jest wielkością, która obok K_m i k_cat charakteryzuje właściwości katalityczne enzymu. G_a wyznacza się z szybkości początkowej reakcji oznaczonej w różnych temperaturach. Z danych doświadczalnych sporządza się wykres Arrheniusa, na którym log v₀ odkłada się jako funkcję odwrotności temperatury bezwzględnej T. Zależność log v₀ od 1/T jest prostoliniowa.

Rysunek 1. Krzywe Arrheniusa odpowiadające różnym energiom aktywacji.
a = 20,9 kJ /mol (5 kcal/mol); b = 41,8 kJ /mol (10 kcal/mol); c = 62,7 kJ /mol (15 kcal/mol).

Nachylenie krzywej Arrheniusa w stosunku do osi odciętych jest miarą energii aktywacji. Można ją obliczyć ze wzoru:

G_a= 2,3 ^. R ^.

w którym: R = stała gazowa wynoszącą 8,3170 J/(1^ox mol) tj. 1,9869 cal/(1^ox mol)

T = temperatura wyrażona w stopniach Kelwina.

Zadanie 2: Wyznaczanie krzywej progresji dla rozkładu sacharozy przez inwertazę

Krzywe progresji to krzywe przedstawiające zależność ilości przetworzonego substratu, lub częściej, utworzonego produktu, od czasu trwania reakcji. Obrazują one przebieg reakcji enzymatycznej w obecności enzymu w stałym stężeniu i wybranym stężeniu początkowym substratu. Krzywe progresji sporządza się w celu wyznaczenia szybkości początkowej reakcji enzymatycznej, która jest miarą aktywności enzymu. Szybkość reakcji jest równa tangensowi kąta nachylenia krzywej progresji, można, więc ją wyliczyć ze stosunku P₁/t₁, gdzie P₁ to ilość wytworzonego produktu w czasie t₁.

Postępowanie:

Do kolbki stożkowej odmierzyć 50 cm³ 0,1% roztworu sacharozy w 0,1 M buforze octanowym o pH 5,0. Kolbkę umieścić w łaźni wodnej w temp. 40⁰C na ok. 10 min. W tym czasie przygotować na statywie 16 probówek do każdej rozlać po 1 cm³ odczynnika Somogyi + 0,9 cm³ wody.

Z roztworu wzorcowego glukozy 10,0 mg% sporządzić serię wzorców o stężeniach:
0 (woda), 2,5 mg%, 5,0 mg%, 7,5 mg% i 10,0 mg% jak w poprzednim doświadczeniu.

Do kolbki stożkowej z ogrzanym roztworem sacharozy dodać 1 cm³ roztworu inwertazy o stężeniu 6,25 mg% (stoper!), zamknąć korkiem, wymieszać i pozostawić w łaźni. Od momentu dodania enzymu najpierw co 2 minuty (od 2 do 20 minuty), potem w 25, 30, 35, 40, 50 i 60 minucie odbierać z kolbki po 0,1 cm³ roztworu i przenosić do przygotowanych wcześniej probówek z odczynnikiem Somogyi.

Po wymieszaniu wszystkie probówki (16 odebranych prób i wzorce) umieścić we wrzącej łaźni wodnej i gotować 10 minut, ostudzić, dodać po 1 cm³ odczynnika arsenomolibdenowego, dokładnie wymieszać i dopełnić do 10 cm³. Odczytać ekstynkcję przy długości fali równej 500 nm. Sporządzić krzywą wzorcową i odczytać z niej stężenie wytworzonych cukrów w kolejno pobieranych próbach. Sporządzić wykres zależności stężenia cukrów od czasu trwania hydrolizy. Przeliczyć stężenie cukrów na ich ilość w badanej próbce. Wyniki przedstawić w tabelce i na rysunku.

minuty inwersji	ekstynkcja	stężenie glukozy	ilość glukozy	V reakcji
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
25
30
35
40
50
60

Literatura: Witwicki J, Ardelt W. Elementy enzymologii. Rozdział 3 i podrozdziały od 1.1 do 1.4.

cukier inwertowany [α]²⁰_D = -20,5^o

---