Data wykonania: 21.11.2007
Wydział: Chemiczny
Kierunek: BIOTECHNOLOGIA
„Wyznaczanie toksyczności za pomocą testu TTC”
Sławomir Szczotka
Damian Loska
1. Materiały i odczynniki:
16 probówek
roztwór Na2SO3
roztwór TTC
substancja toksyczna - rezorcyna o stęż. 3%
woda
osad czynny
2. Cel ćwiczenia:
Określenie stopnia toksyczności substancji toksycznej (rezorcyna).
3. Przebieg ćwiczenia:
Do oznakowanych szesnastu próbówek wprowadziliśmy zgodnie z poniższą tabelką następujące objętości (w ml) reagentów
Reagent |
Próbówki |
|||||||
|
1 i 2 |
3 i 4 |
5 i 6 |
7 i 8 |
9 i 10 |
11 i 12 |
13 i 14 |
15 i 16 |
Na2SO3 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
Roztwór TTC |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
Substancja toksyczna |
0 |
0,1 |
0,2 |
0,3 |
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1 |
Woda |
1 |
0,9 |
0,8 |
0,7 |
0,6 |
0,4 |
0,2 |
0 |
Osad czynny |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
Następnie probówki inkubowano w ciemności ok. 40 min. Po inkubacji probówki zwirowano, odrzucono supernatant, dodano do każdej po 6 ml metanolu, dzięki któremu przerwano reakcję enzymatyczną i zamieszano. Następnie ponownie odwirowano. Kolejno zmierzono ekstynkcję cieczy znad osadu.
4. Wyniki pomiarów:
Probówki |
Ekstynkcja 1 |
Ekstynkcja 2 |
Średnia ekstynkcja |
1 |
0,810 |
0,827 |
0,819 |
2 |
0,805 |
0,775 |
0,790 |
4 |
0,508 |
0,492 |
0,500 |
5 |
0,320 |
0,355 |
0,338 |
6 |
0,290 |
0,282 |
0,286 |
7 |
0,182 |
0,190 |
0,186 |
8 |
0,121 |
0,122 |
0,122 |
5. Obliczenia i wykresy:
Uwaga: wyniki wszystkich obliczeń zostały przedstawione w tabelce poniżej wzorów
a) obliczenie stężenia TF:
Stężenie TF wyliczamy z krzywej kalibracyjnej Spekola A:
y = 21,332x - 0,0579
Zatem: TF= 21,332 * E - 0,0579 [mg TF / dm3]
b) obliczenie aktywności dehydrogenaz (AD):
Wyliczamy ją ze wzoru:
AD = TF /t [mg TF /dm3 *h]
przy czym: t - czas inkubacji próby w [h]
Zatem żeby policzyć AD we właściwej jednostce musimy odpowiednio przekształcić wzór:
AD = 3600*TF /t [mg TF /dm3 *h]
c) obliczenie stopnia toksyczności (ST):
Stopień toksyczności wyliczamy ze wzoru:
ST = [(AD0-ADT)/AD0] *100%
Przy czym:
AD0 - AD bez substancji toksycznej (w pierwszej parze probówek)
ADT - AD z substancją toksyczną (dla par probówek 2-8)
d) obliczenie stężenia rezorcyny (CT):
Stężenie obliczamy ze wzoru:
CT = 3% * v /10 ml [%]
gdzie v - to objętość dodanej 3% rezorcyny
Lp. |
Ekstynkcja |
y = TF |
AD |
ADuśr |
CT |
ST |
1/CT |
1/ST |
1. |
0,810 |
17,213 |
25,82 |
26,09 |
|
|
|
|
2. |
0,827 |
17,575 |
26,36 |
|
|
|
|
|
3. |
0,805 |
17,106 |
25,66 |
25,18 |
0,03 |
3,49 |
33,33 |
0,29 |
4. |
0,775 |
16,467 |
24,70 |
|
|
|
|
|
7. |
0,508 |
10,774 |
16,16 |
15,90 |
0,09 |
39,04 |
11,11 |
0,03 |
8. |
0,492 |
10,433 |
15,65 |
|
|
|
|
|
9. |
0,320 |
6,765 |
10,15 |
10,39 |
0,12 |
60,19 |
8,33 |
0,02 |
10. |
0,335 |
7,085 |
10,63 |
|
|
|
|
|
11. |
0,290 |
6,125 |
9,19 |
9,06 |
0,18 |
65,27 |
5,56 |
0,02 |
12. |
0,282 |
5,955 |
8,93 |
|
|
|
|
|
13. |
0,182 |
3,823 |
5,73 |
5,86 |
0,24 |
77,53 |
4,17 |
0,01 |
14. |
0,190 |
3,993 |
5,99 |
|
|
|
|
|
15. |
0,121 |
2,522 |
3,78 |
3,80 |
0,3 |
85,44 |
3,33 |
0,01 |
16. |
0,122 |
2,543 |
3,82 |
|
|
|
|
|
e) Robimy wykres Lineweavera - Burka
W tym celu obliczamy wartości 1/ CT i 1/ST.
f) Na podstawie równania regresji liniowej wyznaczamy stałe STmax oraz K
Równanie regresji liniowej przedstawia się wzorem: y = 0,0095x+0,043
-1/K to takie x dla którego y=0
Czyli: K = 0,0095/ 0,043
K= 0,2209300232
1/STmax to taka wartość y gdy x=0
Czyli: STmax = 1/ 0,043
STmax = 23,25581395
Ponieważ stopień toksyczności jest większy niż 100% przyjmujemy wartość stopnia toksyczności równą 100%
g) Sporządzono tabelkę wg wzoru na ST= STmax* CT/(K+CT)
ST |
CT |
11,96 |
0,03 |
21,36 |
0,06 |
28,95 |
0,09 |
35,20 |
0,12 |
40,44 |
0,15 |
44,90 |
0,18 |
48,73 |
0,21 |
52,07 |
0,24 |
55,00 |
0,27 |
57,59 |
0,3 |
59,90 |
0,33 |
61,97 |
0,36 |
63,84 |
0,39 |
65,53 |
0,42 |
67,07 |
0,45 |
68,48 |
0,48 |
h) narysowanie wykresu funkcji ST= STmax*CT/(K+CT) (typowego Michaelisa-Menten)
Na wykresie dodatkowo zaznaczono drugą serię (kreska grubsza), punkty ST i CT z poprzedniej pierwszej tabeli.
Wnioski:
Z powodu błędu w trakcie dodawania reagentów do próbówek musieliśmy odrzucić probówkę 5 i 6 gdyż pomylono się w dodawaniu rezorcyny i przez to nie można było odczytać ich dobrej ekstynkcji.
Linia trendu poprowadzona przez punkty pomiarowe na wykresie drugim jest mniej więcej równoległa do wyliczonej krzywej.
Podczas obliczeń STmax przekroczyło 100%. Nie jest to spowodowane błędem wyliczeń, lecz jest to efekt zbyt dużego stężenia substratu.
Wszelkie różnice pomiędzy wartościami ekstynkcji są związane zapewne z błędami popełnionymi podczas wykonywania ćwiczenia (zabrudzona kuweta itp. )
Wyszukiwarka