INŻYNIERIA GENETYCZNA L

Przygotowanie komórek kompetentnych XL1-Blue

Komórki kompetentne - komórki zdolne przyjąć obce DNA.Ich przygotowanie - zamrażanie, szok cieplny.

• Bufor A - jony Mg

• Bufor B - jony Cl

• Bufor C - jony Ca, glicerol (20%)

Glicerol zwiększa gęstość, żeby białka bakteryjne i oddziaływania między białkami były bardziej stabilne. Glicerol chroni komórki - zapobiega lizie.

Jony są potrzebne do neutralizacji ładunku błony.
Temperatura - jej obniżanie powoduje, że błona jest bardziej przepuszczalna i sztywna. Podniesienie temperatury powoduje rozciąganie się błony, dzięki czemu może wejść DNA.

Błona komórkowa - fosfolipidy (P - ładunek ujemny)

Transformacja DNA - proces, dzięki któremu DNA jest wprowadzane do bakterii.

OD₆₀₀ - mówi o rozproszeniu światła. Jest to gęstość optyczna. (komórki kompetentne OD₆₀₀= 0,4-0,5)

Wykres wzrostu bakterii:

I - faza adaptacyjna (komórki nie dzielą się)

II - faza logarytmiczna (największy wzrost komórek)

III - faza stacjonarna (ilość komórek powstających i umierających jest taka sama)

IV - faza zamierania

X-Gal - pochodna laktozy. Β-galaktozydaza hydrolizuje X-Gal do galaktozy i glukozy.

Galaktoza daje kolor niebieski. Kolonie dobrze stransformowane widać na płytce jako kolonie niebieskie (rozkładają X-Gal)

transpozon - gen ruchomy

transformacja - u organizmów prokariotycznych

transfekcja - u organizmów eukartiotycznych

Metody wszczepiania genów do komórek eukariotycznych:

• Elektroporacja - poddawanie komórek działaniu pola elektrycznego, dzięki czemu tworzą się odwracalne pory.

• Mikroiniekcja - wszczepianie DNA, bombardowanie błony komórkowej w polu elektrycznym (błona komórkowa jest otoczona złotem lub wolframem).

• Liposomy - pęcherzyki lipidowe, które mogą powstawać w fosfolipidów, są to wodne przestrzenie ograniczone dwuwarstwą lipidową, mogą służyć do badania przepuszczalności błon czy do dostarczania komórkom różnych związków chemicznych

• Działanie dekstranem i fosforanem wapnia

• Transdukcja - wprowadzenie DNA do komórki bakteryjnej za pomocą bakteriofagów

• U roślin musimy zrobić protoplastyzację, żeby zniszczyć ścianę komórkową.

Plazmid - kolisty fragment DNA pełniący funkcje chromosomów pomocniczych; służą jako wektory do klonowania DNA w bakteriach.

Komórki bakteryjne zawierają DNA koliste, które łatwiej przenika i łatwiej się łączy. Komórka bakteryjna nie przyjęłaby DNA liniowego.

Enzymy restrykcyjne - białka pochodzące z bakterii, które wykorzystują te enzymy, by bronić się przed obcym DNA. Enzymy restrykcyjne nie tną DNA gospodarza ponieważ jest ono zmetylowane. Restryktazy generują lepkie końce.

• BamHI - rozpoznaje sekwencje G▼CCGC, tnie DNA tworząc lepkie końce

• EcoRI - tnie DNA tworząc lepkie końce, 5'-G▼AATTC-3', tnie tworząc 3 fragmenty

• HindIII - tnie tworząc 2 fragmenty

Metylazy - metylują w rozpoznawanej sekwencji 1 resztę DNA, dzięki czemu DNA bakteryjne nie jest cięte przez enzymy restrykcyjne

METYLACJA

• U prokariota

Rodzaj metylacji	Zasada metylowana	Rozpoznawane sekwencje
dam	A	GATC
dcm	C	CCAGG / CCTGG

dam - nie pokrywa miejsca metylacji

dcm - może pokrywać miejsce metylacji

• U eukariota

Rodzaj metylacji	Zasada metylowana	Rozpoznawane sekwencje
CpG	C	CpG

Metylacja ta służy do wybierania DNA, które ma być czynne restrykcyjnie.

DNA niezmetylowane - ulega ekspresji

DNA zmetylowane - nieaktywne

Ligaza DNA - łączy końce DNA w regionach dwuniciowych. Enzym ten katalizuje tworzenie się wiązania fosfodiestrowego między grupą 3'-OH jednego końca nici DNA i grupą 5'-fosforanową na końcu drugiej nici. Do przeprowadzanie tej reakcji potrzebne jest źródło energii:

• u eukariotów i archeonów - ATP

• u bakterii - NAD⁺


Znaczenie markerów genetycznych:

• endA1 - mutacja genu endonukleazy A (endonukleaza A tnie DNA) specyficznej dla DNA, zwiększająca wydajność i jakość izolowanych plazmidów (chodzi o to, żeby nasze plazmidy nie były rozcinane)

• lacI^q - zdolność do nadprodukcji lac represora hamującego transkrypjcę z promotorów zawierających lac operator (bo nie chcemy, żeby komórka sama transkrybowała laktozę)

• recA1 - niezdolność do rekombinacji DNA; zwiększa stabilność niektórych insertów podczas propagacji wektorów (chodzi o to, żeby nasze plazmidy nie były rozcinane)

• Tc^R - obecność genu tet, nadającego oporność na terracyklinę (tertacyklina jest markerem selekcyjnym, nietranformowane komórki nie wyrosną na płytce gdy jest ona obecna w podłożu)

Operon laktozowy:


Enzym I - β-galaktozydaza

Enzym II - permeaza

Enzym III - acetylotransferaza

Aktywność enzymów restrykcyjnych zależy od:

• czystości DNA - zanieczyszczenia DNA wpływające na aktywność enzymu: białka, fenol, chloroform, etanol, EDTA, SDS, wysokie stężenie soli

• temperatura i czas inkubacji

• dobór buforu

* Mg²⁺ - niezbędne do aktywności enzymu

* Tris-HCl - utrzymanie odpowiedniego pH

*Kcl/NaCl - odpowiednia siła jonowa

*BSA - stabilizacja cząsteczek białkowych, zapobieganie adhezji enzymów do probówki

*Triton X-100 - detergent, stabilizacja białek

Aktywność gwiezdna - tzw. „rozluźniona” specyficzność enzymu będąca skutkiem nie optymalnych warunków:

• za duże stężenie glicerolu

• zbyt wysokie pH

• jeden kofaktor (Mn jest zastąpiony innym)

• za długa inkubacja

• zła temperatura

• za duża ilość enzymu lub substratu

• zbyt niska siła jonowa

Metody inaktywacji enzymu:

• elektroforeza

• termicznie - 80°C, 30 minut ← podstawowy sposób

• chemicznie (EDTA, fenol, chloroform, EtOH)

Jednostka aktywności - taka ilość enzymu, która trawi całkowicie 1 μg charakterystycznego substratu testowego przez 1h w optymalnych warunkach podanych przez producenta.

Elektroforeza preparatywna - oczyszczenie pożądanego DNA z innych pasm DNA

Po ligacji:

• wysiewamy pożądane DNA na bakterie

1) DNA superskręcone → najbardziej niebezpieczne

2) wektor + insert

3) wektor bez insertu → niebezpieczne

4) DNA liniowe

• wycinami DNA z żelu

Elektroforeza: _DNA

• agaroza = galaktoza D + galaktoza L |+| ← |-| (bo DNA ma ładunek|-|)

• rozdział molekuł w polu elektrycznym następuje na podstawie ich wielkości, kształtu i ładunku. DNA przemieszcza się w polu elektrycznym od ujemnej elektrody katody (-) do dodatniej elektrody anody (+).

Czynniki wpływające na ruchliwość DNA kolistego/liniowego w żelu agarozowym:

• długość cząsteczki DNA - im dłuższa tym wolniej migruje V=1/[log(bp)]

• konformacja

* koliste superskręcone - najszybciej

*koliste - średnia prędkość

* liniowe - najwolniej

• bromek etydyny - wchodzi między pary zasad (interkaluje)

* kolisty ujemnie superskręcony - bromek etydyny dodaje skręty dodatnie

7 (-) superskręconych → 7 (+) superskręconych prędkość nie zmienia się

1 (-) superskręconych → 3 (+) superskręconych prędkość zwiększa się

6 (-) superskręconych → 3 (+) superskręconych prędkość zmniejsza się

* liniowy

bromek etydyny wysłuża i usztywnia DNA, co zmniejsza prędkość

• napięcie - im większe tym szybciej migrują, ale spada rozdzielczość

• stężenie agarozy - im bardziej stężona tylko wolniej migrują, ale jest lepsza rozdzielczość

• bufor (siła jonowa)

ELEKTROFOREZA SDS-PAGE → Elektroforeza w warunkach denaturujących (bo jest SDS)

SDS- Sodium Dodecyl Sulfate

żele:

• 12%- żel dolny, rozdzielający

• 4% - żel górny, zagęszczający

MIX = akryloamid + bisakryloamid

Bufory: UPPER

LOWER

	Górny [ml]	Dolny [ml]
MIX	0,933	4,00
UPPER	1,75	-
LOWER	-	2,5
SDS 10% [μl]	70	100
H2O	4,205	3,340

Bufor Tris- pH=6,8

SDS- rozfałdowanie białek, nadanie im ładunku ujemnego (-)

β-merkaptoetanol - denaturuje wiązania disiarczkowe (dodaje się go, ponieważ po lizie komórek mogą powstać mostki disiarczkowe, które są niepożądane)

Glicerol - zagęszcza próbkę, stabilizuje białka

Błękit bromofenolowy - wiąże się z białkiem, zabarwia je (żeby było je widać)

Gdy nasze białko jest przed dodaniem SDS częściowo bardzo sfałdowane, denaturyzujemy je w 90°C.




Polimeryzacja żelu poliakrylamidowego

• APS - nadsiarczam amonu (NH₄)₂S₂O_8, ryboflawina

• TEMED - N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina;

T= ((masa akrylamidu [g] + masa bisakrylamidu [g]) / obj. Całkowita [ml]) * 100%

C= (masa bisakrylamidu / (masa akrylamidu [g] + masa bisakrylamidu [g]) ) * 100%

Układ nieciągły wg Laemlli'ego

Bufor do elektroforezy (przy elektrodach) pH=8,3, zawiera glizynę

Im mniejsza cząsteczka tym szybciej porusza się w żelu.

Skład żelu:

• HCl → jony Cl^- migrują najszybciej

• glicyna - mogruje wolno




GRADIENT pH → pH rośnie, bo HCl wędruje w dół-glicyna zmienia stopień uprotonowania (glicyna z jonu obojnaczego przechodzi w jon glicynianowy), zaczyna migrować szybciej i „spycha” białka w dół „zbijając” je, żeby tworzyły cienką warstwę.

W żelu rozdzielającym glicyna zagęszcza, wyprzedza białka.

Wybarwianie żelu ( np. barwnikiem Coomassie)

• metanol - rozpuszcza barwnik i wytrąca białka

• kwas octowy - wiąże się z białkiem i utrwala je w żelu

Kolor białka zależy od jego pI (punktu izoelektrycznego) oraz od modyfikacji chemicznych np. glikozylacji czy fosforylacji.

EcRDBD - wiąze DNA, zawiera palce cynkowe, 8 cystein, brak wiązań disiarczkowych.

---