Grupa nr: 23 Zespół nr: 1	Ćwiczenie nr 2 Chromatografia cieczowa	Data wykonania: 23.04.2009r.
Butlak Lidia Chmielarczyk Karolina Tylek Sylwia Wybraniec Barbara			Ocena:

1. Wstęp teoretyczny:

Zapewnia ona możliwość identyfikacji substancji oraz ich ilościowej analizy, nawet w niskich stężeniach w obecności innych związków. Możliwość rozdzielania chromatograficznego substancji wynika z faktu, że poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi między dwie niemieszjące się fazy, przy czym jedna z tych faz jest ruchowa (tzw. eluent), a druga stanowi nieruchome wypełnienie kolumny chromatograficznej (faza stacjonarna).

2. Cel ćwiczenia:

Analiza ilościowa próbki fluoranten - fluoren (ft-fl) oraz analiza jakościowa mieszaniny węglowodorów aromatycznych metodą HPLC na odwróconej fazie.

3. Warunki analizy:

Chromatograf	Aparat do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) firmy Knauer (Niemcy)
Faza ruchoma	alkohol metylowy/eter diizopropylowy/ 10% (v/v) H3PO4/ H2O = 1000mL/ 40mL/5mL/800mL
Ilość wstrzykiwanej próbki	około 30 µL
Wielkość przepływu	0,5 mL/min
Długość fali (detektor)	360 nm
Temperatura kolumny (programowana przez 10 - 15 minut)	30°
Dane rejestrowane przy pomocy komputera w programie „Chroma”

4. Roztwory:

• ft-fl 50 [µg/ml]

• ft-fl 25 [µg/ml]

• ft-fl 5 [µg/ml]

• piren

• fluoranten

• fluoren

• naftalen

• zadanie

5. Opis wykonania doświadczenia:

Próbka o objętości około 30 µL dozowana jest do aparatu poprzez septum dozownika przy pomocy mikrostrzykawki.

Analizę ilościową wykonujemy przez wyznaczenie krzywych kalibracyjnych dla każdego stężenia ft-fl.

Analizę jakościową badanej próbki wykonujemy porównując czasy retencji pików w badanej próbce z czasami retencji wzorców. W naszej HPLC roztworami wzorców są: piren, fluoranten, fluoren, naftalen. Po każdej analizie starannie przemywamy mikrostrzykawkę roztworem metanolu. Wykonujemy po 1 analizie każdego z roztworów wzorcowych, zadania oraz próbek używanych w analizie ilościowej.

6. Analiza ilościowa mieszaniny fluoranten - fluoren. Pomiary wykonane dla roztworów próbek w temperaturze 30°:

PRÓBKA (ok. 30 µL)	Stężenie [µg/ml]	Czas retencji tR [min]	Powierzchnia piku [µV /100min]	Wysokość piku [µV]	Szerokość piku w połowie wysokości [min]
fluoren	50	2,337	14114973	721008	0,187
fluoranten			3,653	101188802	410230	0,235
fluoren		25	2,518	3246560	184193	0,168
fluoranten			3,823	2228542	96225	0,222
fluoren		5	2,642	1750748	92983	0,180
fluoranten			3,940	1150273	49069	0,225

Na podstawie otrzymanych wartości sporządzono wykresy krzywych kalibracyjnych S = f(C) odpowiednio dla FLUORANTENU i FLUORENU.

S - powierzchnia piku [µV /100min]

C - stężenie badanej próbki [µg/ml]

7. Pomiary wykonane dla roztworów wzorców w temperaturze 30°:

PRÓBKA (ok. 30 µL)	Stężenie [µg/ml]	Czas retencji tR [min]	Czas retencji zredukowany t′R = tR - tM [min]	Powierzchnia piku [µV /100min]	Wysokość piku [µV]	Szerokość piku [min]
piren	50	4,477	3,477	9927654	369452	0,257
fluoranten	50	3,918	2,918	7060089	293125	0,233
fluoren	50	2,628	1,628	5998098	274754	0,205
naftalen	50	2,668	1,668	1309160	77424	0,167

t_M = 1,00 min

8. Pomiary wykonane dla roztworu zadania w temperaturze 30°:

PRÓBKA (ok. 30 µL)	Czas retencji [min]	Czas retencji zredukowany t′R = tR - tM [min]	Powierzchnia piku [µV /100min]	Wysokość piku [µV]	Szerokość piku „wh” [min]	Liczba półek teoretycznych [s^2/cm^2]	Współczynnik retencji „k”
ZADANIE	2,632	1,632	1384461	73030	0,182	1159	1,632
		3,902	2,902	1387170	57616	0,235	1527	2,902
		4,447	2,447	1769403	69951	0,248	1781	2,447

9. Obliczenia:

t_M = 1,00 [min]

1. obliczenie współczynników retencji „k” dla roztworów wzorcowych:

k =
=



Związek	k
piren	3,477
fluoranten	2,918
fluoren	1,628
naftalen	1,668

2. selektywność i rozdzielczość dla pików z analizy wzorców piren i fluoren:




α =


α =





3. Obliczenie stężenia próbki:





[µg/ml]

Jako powierzchnię próbki wpisałyśmy średnią wartość z powierzchni wszystkich pików wykrytych w zadaniu. Podobnie jeżeli chodzi o powierzchnię wzorca.

W ZADANIU wykryto obecność trzech pików, których czasy retencji po porównaniu z czasami retencji pików pochodzących z roztworów wzorcowych są do siebie zbliżone (podobne). Te związki to:

• fluoren

• fluoranten

• piren

10. WNIOSKI:

W pierwszej części ćwiczenia dokonałyśmy analizy ilościowej roztworów FLUORANTENU - FLUORENU o stężeniach odpowiednio 50 - 25 - 5 µg/ml dzięki czemu mogłyśmy narysować wykresy krzywych kalibracyjnych dla tych roztworów. Po analizie wykresów możemy stwierdzić, że powierzchnie pików poszczególnych związków są proporcjonalne do stężenia składnika w badanych próbkach, powierzchnie pików maleją wraz ze wzrostem stężenia.

Dokonując analizy jakościowej poszczególnych substancji wzorcowych porównałyśmy otrzymane wyniki i określiłyśmy skład badanej próbki, w skład której wchodzą: fluoren, fluoranten, piren. Stężenie badanej przez nas próbki po dokonaniu stosowych obliczeń wynosi 10 [µg/ml].

---