Rozdzial 2 Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych

Celem jest uzyskanie wysokocząsteczkowego DNA oczyszczonego z bialek i inhibitorów enzymów. Podstawa procesu jest wyciągnięcie DNA z jądra komórkowego a następnie oddzielenie tego DNA od pozostałego materialu jaki powstaje w czasie izolacji (np. fragmenty blon komórkowych, bialek znajdujących się w komórce).

Wybrane właściwości fizyczne i chemiczne kwasów nukleinowych:

Str. 17-18

Pobieranie materialu biologicznego:

Do izolowania NDA nadają się wszystkie komórki zawierająco jądro.

Warunki izolacji są zawsze dostosowane do typu komórek.

Najczęściej wykorzystujemy następujący material biologiczny:

1. PELNA krew obwodowa

2. komórki plynu owodniowego i kosmówki

3. hodowle fibroblastów

4. komórki nabłonka

5. cebulki wlosowe

Rzadziej:

1. plamy krwi

2. nasienia

3. fragmenty tkanek pobrane metodą biopsji cienkoiglowej

4. szpik kostny

Ilość materialu potrzebna do wykonania PELNYCH badań:

• 1 ml krwi obwodowej pobranej na EDTA-Na₂ - WERSENIAN DISODOWY, SÓL DISODOWA KWASY ETYLENODI AMINOOCTOWEGO (Zapobiega krzepnięciu - antykoagulant). Inne antykoagulanty mogą być stosowane jeśli nie zaklucą dalszej analizy (np. heparyna hamuje aktywność niektórych enzymów restrykcyjnych - omówione w dziale enzymy restrykcyjne)

• 25-30 mg tkanki

• 10 ml plynu owodniowego

Do przeprowadzenia reakcji PCR (sluży do zwielokrotnienia materialu badanego, omówiona dalej) wystarczy 50 ul krwi lub 10 ul nasienia.

Przechowywanie materialu:

Jeśli nie możliwy jest przeprowadzenie izolacji DNA zaraz po pobraniu próbki należy zabezpieczyć material:

• zamrożona tkanka (od -20 C do -80 C lub w ciekłym azocie -195 C)

• lizat (np. krew poddana dzialaniu czynnika powodującego lizę - rozpad komórek) w buforze do lizy w temp. -4 C przez kilka miesięcy. Do przesylki w temp pokojowej.

Przebieg procesu izolowania DNA:

Metody izolacji DNA różnią się sposobem ekstrakcji DNA, usuwania bialek oraz wytrącania DNA. Ogolny schemat przedstawia się następująco:

1. rozbiciu blon komórkowych i jądrowych za pomocą detergentu np. SDS - siarczan dodecylu sodu. Jest to etap lizy

2. trawieniu bialek za pomocą proteinazy K (zachowuje aktywność w obecności 1% SDS)

3. denaturacji - wytrącenie bialek

4. ekstrakcji DNA z użyciem fenolu

5. strąceniu DNA za pomoca alkoholu (np. izopropanol, etanol)

Poniżej pokazany jest dokładny przebieg izolacji DNA z krwi pelnej:

1. Użycie buforu do lizy krwinek czerwonych (+dokładne wymieszanie próbki i inkubacja w temp. pokojowej) - bony komórkowe czerwonych krwinek są niszczone

2. Wirowanie próbki - powoduje to, że lżejsze fragmenty bon komórkowych krwinek czerwonych ulożą się w górnej części probówki, cięższe - pozostale komórki znajdujące się w krwi pelnej (np. leukocyty) znajda się niżej.

Obraz rozkładu materialu w probówce po wirowaniu

3. Usunięcie pipetą automatyczną SUPERNATANTU (to co nad osadem). W sklad supernatantu wchodzą fragmenty bon komórkowych krwinek czerwonych. W probówce pozostają komórki zawierające jądro. Dzięki temu material jest już częściowo oczyszczony.

4. Dodanie odczynnika do lizy pozostałych komórek (wymieszać i inkubować) - blony komórkowe i jądrowe są niszczone. DNA jest `uwalniane'.

5. Dodanie odczynnika odbiałczającego - powoduje denaturację bialek (w sklad odczynnika może wchodzic np. fenol, chloroform. Można także wytrącać przez NaCl, LiCl)

6. Wirować - spowoduje to ułożenie się w górnej warstwie DNA (lżejsze) oraz denaturowanych bialek, fragmentów rozbitych blon komorkowych w dolnej warstwie - cięższe. Górna warstwa (DNA) będzie stanowić supernatant, dolna - osad.

7. 
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   Przenieść do nowej probówki za pomocą pipety automatycznej SUPERNATANT (DNA)

8. Wytrącić DNA za pomocą izopropanolu - dodajemy do probówki w której znajdują się tylko nici DNA. W probówce zauważymy nić DNA (cienka, poskręcana)

9. Odwirować. Na dnie probówki widoczna będzie biała plamka DNA.

10. Zlać supernatant przez delikatne odwrócenie probówki. Nie naruszać osadu (plamki DNA)

11. Przepłukać osad DNA 75% etanolem (2 razy. Nie wirować. Następuje zagęszczenie materialu DNA.

12. Resztki etanolu usunąć pipetą automatyczną. Nie naruszać osadu.

W ten sposób uzyskaliśmy oczyszczony DNA.

W celu ustalenia zawartości i czystości DNA musimy:

• rozpuścić DNA przez dodanie odpowiedniego buforu i pozostawienie próbki na 24h.

• oznaczyć zawartość i czystość DNA za pomocą specjalistycznej aparatury.

Przeczytać UWAGI na str. 32.

Do izolowania DNA z plemników (plamy nasienia, wymazy z dróg płciowych) stosuje się METODĘ PREFERENCYJNEJ LIZY. Dzięki temu możemy rozdzielić DNA wyizolowanego z dróg rodnych kobiety: odróżnić DNA pochodzące z plemników od DNA pochodzącego nabłonka pochwy. Metoda ta jest używana np. w kryminalistyce.

Chromatyna plemników jest odporna na Lizę z udziałem SDS (siarczan dodecylu sodu) i proteinazy K. Chromatyna komórek somatycznych nie wykazuje tej odporności - łatwa Liza pod wpływem SDS i proteinazy K.

Właściwość chromatyny plemników wynika z faktu, że w miejscu histonów występują liczne cysternowe protaminy. Reszty cysternowe tworzą dużą liczbę wiązań dwusiarczkowych, co zapewnia oporność na detergenty i egzogenne proteinazy.

Aby przełamać oporność chromatyny należy zastosować DITIOTREITOL, który redukuje wiązania dwusiarczkowe.

Aby odróżnić DNA plemników od DNA komórek somatycznych najpierw stosujemy SDS i proteinazę K - następuje rozbicie błon komórek somatycznych. Następnie oddzielić - przez wirowanie i odpipetowanie a następnie zastosowanie DITIOTREITOL'U.

W badaniach populacyjnych stosuje się inna technikę. Wykorzystuje ona detergenty (SDS, Tryton X-100) do rozbicia błon komórkowych komórkowych inaktywację nukleaz oraz sole chaotropowe (CHLOROWODOREK I IZOCYTRYNIAN GUANIDYNY). W obecności wspomnianych soli, DNA ulega absorpcji na cząsteczkach szkła lub krzemionki. Następnie DNA odpłukuje się z tych cząstek, nakładając na drobny filtr i wiruje.

Izolowanie RNA z materiału biologicznego:

RNA jest mniej stabilny niż DNA ponieważ posiada GRUPĘ HYDROKSYLOWĄ W POZYCJI 2' RYBOZY. Izolowanie jest bardziej wrażliwe na temperaturę.

Warunkiem uzyskania czystego, nienaruszonego RNA jest szybka dezaktywacja RYBONUKLEAZ. Są one stabilne i aktywne, występują we wszystkich komórkach i powodują DEGRADACJĘ RNA.

Do izolowania RNA potrzeba:

• odczynników zawierających DEPC - DIETYLOPIROWĘGLAN - hamuje aktywność rybonukleaz

• szkła wolnego od rybonukleaz

Wyróżniamy kilka metod izolowania (w zależności od rodzaju komórek, RNA jakie chcemy uzyskać):

1. Izolowanie specyficznego RNA poprzez frakcjonowanie (rozdzielenie na poszczególne rodzaje) całkowitego RNA komórki

2. Izolowanie specyficznego RNA z komórek, które syntezują w zwiekszonej ilości określony typ RNA

3. Izolowanie poli(A) RNA

4. Izolowanie RNA z rybosomów

5. Izolowanie RNA całkowitego, a następnie przepisanie go na cDNA za pomocą ODWROTNEJ TRANSKRYPTAZY. Następnie zwielokrotnienie materiału za pomocą PCR.

6. Najnowsze technologie izolowanie RNA wykorzystują selektywne wiązanie RNA do żelu krzemionkowego krzemionkowego środowisku specyficznego WYSOKOJONOWEGO BUFORU. Zapewnia to selektywność wiązania RNA a nawet jego typu (mRNA czy tRNA)

Proces izolowania RNA:

1. Próbki biologiczne (bakterie, komórki roślinne/zwierzęce) podlegają Lizie.

2. Homogenizujemy je w buforze DENATURUJĄCYM zawierającym GITC - izotiocyjanian guanidyny, który jednocześnie inaktywuje rybonukleazy (funkcja jak DEPC)

3. Lizat pełny rozfrakcjonowany nanosi się na MINI KOLUMNĘ, gdzie następuje selektywna i specyficzna absorpcja RNA do filtru krzemionkowego

Schemat mini kolumny

4. Przemycie kolumny i usunięcie ewentualnych zanieczyszczeń, które pozostały w kolumnie (białko, DNA). W kolumnie pozostaje jedynie RNA osadzone na filtrze krzemionkowym.

5. Przemycie czystego RNA wodą - eluacja.

Przechowywanie RNA:

Wyizolowany całkowity RNA można przechowywać w temp. -20 C lub -70 C przez okres 1 roku.

Analiza chemiczna preparatów DNA i RNA:

Po wyizolowaniu i oczyszczeniu DNA/RNA możemy przeprowadzić ich analizę. Opiera się ona na przeprowadzeniu pomiarów spektrofotometrycznych - tu wykorzystujemy charakterystyczne pochłanianie światła w zakresie światła widzialnego (400-750 nm), bliskiego nadfioletu (200-300 nm) i bliskiej podczerwieni.

Wiązania chemiczne:

1. pojedyncze pochłaniają promieniowanie o dł. fali 100-200 nm

2. podwójne pochłaniają promieniowanie o dł. fali 200-300 nm

Kwasy nukleinowe oraz produkty ich metabolizmu i hydrolizy pochłaniają światło nadfioletowe w zakresie fal 250-280 nm. Właściwość taką posiadają wszystkie związki zawierające układ purynowy i pirymidynowy. W pierścieniach tych występują wiązania podwójne sprzężone i heteroatomy. Grupa fosforowa i cukrowa nie wpływają na intensywność i charakter pochłaniania. Charakterystyki spektralne DNA i RNA są podobna. Maksimum pochłaniania występuje przy dł. fali 260 nm;

Minimum przy 230 i 290 nm.

1. Ustalanie czystości kwasów nukleinowych w preparacie:

1. Oznaczamy stosunek absorbancji dla danej próbki przy dł. fali 260 (A₂₆₀) i 280 (A₂₈₀)

A₂₆₀/ A₂₈₀

• A₂₆₀/ A₂₈₀ = 1,8-2,0 - PREPARAT DOBRZE OCZYSZCZONY

• A₂₆₀/ A₂₈₀ = 1,5 - ŚWIADCZY TO, ŻE PREPARAT ZAWIERA 50% BIAŁEK I 50% RNA LUB DNA

2. Badamy stężenie:

• fosforu

• azotu

DLA CZYSTYCH PREPARATÓW STOSUNEK ZAWARTOŚCI AZOTU DO FOSFORU WYNOSI 1,60-1,70

N/P = OD 1,60 DO 1,70

2. Określanie stężenia kwasów nukleinowych w preparacie:

Stężenie DNA i RNA można określić 2 sposobami:

1. Pomiar absorbcji światła UV (ultrafiolet)

Do pomiaru spektrofotometrycznego preparaty powinny być rozcieńczone wodą destylowaną lub buforem TE.

Odczytujemy wartości absorbcji dla 260, 280 i 320 nm.

Można także wykonać pomiar w zakresie od 200-320 nm.

Na podstawie badań ustalono, że spektrofotometr przy wykorzystaniu fali o długości 260 nm wyświetli wartość 1,000 dla: (ABSORBANCJA PRZY 260 NM = 1,000 dla: )

• Dwuniciowego DNA o stężeniu 50 ug/ml lub

• Jednolicowego DNA o stężeniu 33 ug/ml lub

• RNA o stężeniu 40 ug/ml

(Czyli jeśli w naszej próbce badanej będzie 2niciowe DNA o stężeniu 50 ug/ml albo 1niciowe DNA o stężeniu 33 ug/ml lub RNA o stężeniu 40 ug/ml, przy długości światła 260 nm wartość absorbancji zawsze wyniesie 1,000)

Wykorzystując powyższą zależność możemy obliczyć stężenie odpowiednio:

• Dwuniciowego DNA

(A₂₆₀ - A₂₈₀ ) x 50 x rozcieńczenie = stężenie [ug/ml]

• Jednoniciowego DNA

(A₂₆₀ - A₂₈₀ ) x 33 x rozcieńczenie = stężenie [ug/ml]

• RNA

(A₂₆₀ - A₂₈₀ ) x 40 x rozcieńczenie = stężenie [ug/ml]

Na wartość absorbancji oprócz DNA czy RNA mają wpływ także inne substancje. Należy więc sprawdzić, jak dużo `śmieci' jest w naszej próbce przez wykonanie odczytu absorbancji przy kilku długościach fal. Różne substancje mają maksimum absorbancji przy charakterystycznej dla siebie długości fali:

Długość fali (nm)	Substancja
230 260 280 320	EDTA, etanol, polisacharydy DNA, RNA Białka Drobiny komórkowe

Stwierdzając dużą absorbancję przy 230/280/320 możemy odpowiednio wywnioskować, co zanieczyszcza naszą próbkę.

1. Elektroforeza i porównanie wyniku z preparatem o znanym stężeniu

Metoda ta jest rzadziej stosowana, ale w odróżnieniu od metody spektrofotometrycznej pozawala także ocenić JAKOŚĆ PREPARATU.

Wykonujemy elektroforezę próbki badanej i porównujemy ją z wynikiem elektroforezy dla próbki o znanym stężeniu.

Plusem tej metody jest to, że możemy mieć niewielką ilość materiału.

Do wybarwienia stosujemy BROMEK ETYDYNY.

Po przeprowadzeniu elektroforezy i wybarwieniu OCENĘ JAKOŚCI przeprowadzamy w TRANSILUMINATORZE, który emituje promieniowanie o dł. fali 312 nm. Oceny dokonujemy na podstawie porównania markera wielkości z naszym DNA.

Prawidłowo wyizolowany DNA ma postać ZWARTEGO PRĄŻKA o wielkości około 50 kpz (50 000 pz) bez widocznych smug.

Obecność smug oznacza degradację DNA.

Metody elektroforetyczne:

Elektroforezę stosujemy do:

• Rozdziału

• Analizy - np. w sekwencjonowaniu

• Oczyszczania

kwasów nukleinowych.

Cechy kwasów nukleinowych wykorzystywane w elektroforezie:

1. DNA i RNA posiadają ujemny ładunek, spowodowany obecnością reszt fosforanowych. Dlatego w polu elektrycznym przesuwają się w kierunku anody, czyli do „+”.

Szybkość wędrowania cząsteczek w polu elektrycznym zależy od:

• Wielkości (masy) i kształtu cząsteczki - na żelu natywnym (opisane poniżej)

• Wielkości (masy) - na żelu denaturującym (opisane poniżej)

• Stężenia żelu agarozowego/poliakrylamidowego - Żel tworzy `sito'. Wzrost stężenia zwalnia migrację (sito robi się gęstsze, zmniejszają się pory)

• Natężenia pola elektrycznego, składu i siły jonowej buforu

Szybciej poruszają się cząsteczki DNA o mniejszej masie (zajmują położenie dalej od miejsca nałożenia próbki);

Wolniej -cząsteczki DNA o większej masie (zajmują położenie bliżej od miejsca nałożenia próbki).

WIELKOŚĆ - Ruchliwość elektroforetyczna jest odwrotnie proporcjonalna do log dziesiętnego liczby par zasad.

KSZTAŁT - najszybciej forma zamknięta (kolista), najwolniej forma liniowa

2. W żelu agarozowym ruchliwość elektroforetyczna DNA jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy cząsteczkowej

• Wielkość fragmentu można badanego można obliczyć przez wcześniejsze wykalibrowanie żelu fragmentami DNA o znanej wielkości. Następnie wykreśla się wykres zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy od logarytmu masy cząsteczkowej.

Schemat elektroforezy

Wyróżniamy dwa rodzaje żeli różniących się między sobą czułością oraz specyfiką zastosowania:

1. Agarozowy

2. Poliakrylamidowy

Każdy z nich może być albo natywny albo denaturujący.

Ad. 1 - Żel agarozowy

Ten rodzaj żelu wykorzystuje się do rozdziału DNA o wielkości 200 pz (par zasad) i większe.

Im mniejsze cząsteczki chcemy rozdzielać, tym większe stężenie żelu stosujemy (tworzymy gęstsze sito) np. 0,5-0,7% dla cząsteczek 10000-20000 pz a 1,4-2,0% dla cząsteczek 200-2000 pz.

Ad.2 - Żel poliakrylamidowy

Do rozdziału cząsteczek DNA o wielkości mniejszej od 200 pz.

Wykorzystywany do PCR-HD, PCR-SSCP, PCR-DGGE (opisane w Poszukiwanie nowych zmian sekwencji nukleotydów - Przesiewowe techniki identyfikacji zmian sekwencji nukleotydów)

Żel ten używany jest także do rozdziału jednoniciowego dna np. przy SEKWENCJONOWANIU.

Otrzymujemy przez polimeryzację akrylamidu przez dodanei bis-akrylamidu. Powstają wiązania poprzeczne.

Zmieniając stosunek stężeń akrylamidu do bis-akryulamidu można regulować sieciowanie.

Do reakcji polimeryzacji konieczna jest obecność katalizatora - nadsiarczan amonowy lub potasowy, oraz związku inicjującego reakcję - TEMED (tetrametyloetylenodiamina).

Zasada doboru stężeń do wielkości rozdzielanych fragmentów jest taka sama jak dla żelu agarozowego.

Żel denaturujący

Ruchliwość elektroforetyczna jednoniciowych cząsteczek zależy jedynie od WIELKOŚCI (MASY).

Zastosowanie tego rodzaju żelu ma szczególne znaczenie w rozdziale jednoniciowego RNA, który tworzy miejscami struktury dwuniciowe. Żel denaturujący powoduje rozplecenie nici i rozdział w postaci cząsteczek jednoniciowych.

Żele denaturujące pozwalają wyeliminować więc różnice wywołane różną konformacją.

Żel natywny

Migracja w żelu zależy od WIELKOŚCI (MASY) oraz KSZTAŁTU (struktura przestrzenna).

Cząsteczki mogą mieć różną masę, różne struktury przestrzenne a zachowanie podczas elektroforezy takie samo - ta sama prędkość, przebyta odległość.

Barwienie kwasów nukleinowych:

Po wykonaniu elektroforezy należy zastosować barwienie, by uwidocznić DNA/RNA

1. Powszechną metodą jest użycie BROMKU ETYDYNY, który łatwo interkaluje w cząsteczki kwasów nukleinowych. Powstałe połączenie wykazuje maksymalną fluorescencję przy dł. fali wzbudzenia (taka, która generowana jest przez lampę) 302 lub 312 nm.

Fluorescencja kompleksu bromek etydyny-DNA jest 10 razy większa niż samego bromku i jej maksimum emisji występuje w paśmie światła czerwonego czerwonego dł. fali 590 nm (to czym `świeci' napromieniowana wcześniej próbka za pomocą fali 302 lub 312 nm generowanej z lampy).

Bromek etydyny dodaje się bezpośrednio do żelu lub wybarwia się żel barwnikiem po ukończeniu elektroforezy.

Bromek etydyny wykrywa kilka nanogramów DNA. Wbudowuje się znacznie wydajniej w 2niciowy DNA niż w 1niciowy, stąd mniejsza czułość w przypadku analizy 1niciowego DNA.

2. Barwienie SREBREM jest czulsze i umożliwia wykrycie 1-10 pg DNA na 1 mm².

Jest to technika fotochemiczna.

Do barwienia stosuje się AZOTAN SREBRA.

Metaliczne srebro wiąże się z DNA tworząc nierozpuszczalne sole.

Kolejnym etapem jest odpłukanie niezwiązanego srebra.

Następnie redukuje się srebro związane z DNA za pomocą węglanu sodowego i formaldehydu (lub tiosiarczanu sodu).

Zredukowane srebro ma kolor BRĄZOWY i DNA jest widoczne w postaci brązowych prążków.

Z tak wybarwionego żelu można ekstrahować (`wyciągnąć') DNA do dalszych badań - np. do sekwencjonowania.

Wadą tej metody jest duża wrażliwość na zanieczyszczenia nieorganiczne.

„Srebrzenie” wykorzystuje się głównie na żelach poliakrylamidowych, ponieważ uzyskuje się znacznie większą czułość niż w przypadku żeli agarozowych.

Detekcja (wykrywanie) kwasów nukleinowych:

Do wykrywania kwasów nukleinowych wykorzystujemy znakowanie radioizotopami lub znacznikami fluorescencyjnymi.

W pliku `Skrpyt - Rozdzial 2 - PCR' dalsza część do ćwiczeń nr 2.

Fragmenty blon komórkowych krwinek czerwonych po wirowaniu

Pozostale komórki krwi w tym np. leukocyty - zawierają jadro komórkowe

SUPERNATANT

OSAD

Nici DNA (supernatant)

Denaturowane bialka (osad)

Żel

Wykalibrowany żel do elektroforezy.

[Da]-jednostka masy;

można także kalibrować według ilości par zasad (pz)

Kierunek elektroforezy

100 Da

90 Da

80 Da

70 Da

60 Da

50 Da

40 Da

30 Da

20 Da

10 Da

Filtr krzemionkowy

Obudowa kolumny

RNA

Pozostałe fragmenty komórek

Lizat

---