Wykład I

,,Drobnoustroje przemysłowe: charakterystyka i źródła pozyskiwania”

Szczepy bywające w przyrodzie charakteryzują się zazwyczaj zbilansowanym metabolizmem i nie dochodzi tam do niekontrolowanej nadprodukcji któregoś z metabolitów. Szczepy takie nie mogą być stosowane w biotechnologii w procesach biosyntezy ponieważ znajdują w niej zastosowanie drobnoustroje, w których zakłócony został system regulacji syntezy określonych metabolitów. Szczepy takie przeszły etapy doskonalenia ich cech i prace te to głównie:

1)mutagenizacja pod wpływem określonych czynników fizycznych bądź chemicznych

2)manipulacje genetyczne (rekombinacja genetyczna)

Podstawowym źródłem pozyskiwania drobnoustrojów dla biotechnologii jest środowisko naturalne. Szacuje się, że zaledwie 1% drobnoustrojów bytujących w przyrodzie zostało do chwili obecnej wyizolowanych i zdiagnozowanych. Praktycznie więc przyroda stanowi niewyczerpalne źródło pozyskiwania szczepów dla biotechnologii. Podczas badań kultur ze środowiska naturalnego wyłania się szczepy tzw. Ewentualnie przydatne dla biotechnologii.

W biotechnologii wykorzystywane są również szczepy wyizolowane wprost ze środowiska naturalnego i szczepy te są stosowane do produkcji kiszonek, służą jako dodatek do napojów mlecznych (Actimel, Activia). Takie szczepy są również stosowane do produkcji liofilizowanych preparatów i używane są do regeneracji mikroflory przewodu pokarmowego po kuracji antybiotykowej.

Szczepy dla biotechnologii można też zakupić z odpowiedniej kolekcji branżowych i są to szczepy o wyraźnie zarysowanych uzdolnieniach metabolicznych. Wydajność syntezy określonych substancji z udziałem tych szczepów jest jednak zbyt niska by mogły one stanowić konkurencję dla analogicznych szczepów stosowanych aktualnie w przemyśle. Jednakże szczepy te są kupowane do laboratoriów i stanowią materiał wyjściowy do stosowania określonych cech technologicznych. Najcenniejsze szczepy można zakupić w formie licencji wraz z technologią. Ceny tych licencji są zwykle tak wysokie, że zakup takiej technologii staje się ryzykowny nie tylko ze względu na cenę ale i na możliwości zbytu ponieważ w kolejnych latach pojawią się doskonalsze odpowiedniki produktów dziś wytwarzanych.

W biotechnologii wykorzystywane są szczepy bezpieczne ze zdrowotnego punktu widzenia. Patogeny stosowane są jedynie w takich technologiach jak produkcja surowic czy szczepionek.

Główne kryteria oceny szczepów przemysłowych:

• Wydajność syntezy

• Szybkość wytwarzania produktu (chodzi tu o względy ekonomiczne)

• Czystość produktu (etap wyodrębniania i oczyszczania produktu jest zwykle bardzo kosztowny, tak więc obecność produktów towarzyszących może spowodować podwyższenie kosztów produktu głównego. Stąd wielką uwagę zwraca się na to, alby szczep produkcyjny w określonych, zoptymalizowanych warunkach hodowli nie gromadził produktów ubocznych).

• Szybkość wzrostu (*aspekt ekonomiczny-im szybciej tym taniej **aspekt czystości mikrobiologicznej- po zaszczepieniu istnieje ryzyko zakażeń)

• Niepatogenność (nie wolno jest stosować szczepów chorobotwórczych i wydzielających związki toksyczne. Nie gromadzenie substancji toksycznych Chodzi nie tylko o zabezpieczenie pracowników od produktu nieczyszczonego w odpowiednim stopniu, ale i niebezpieczeństwa związanego z przedostaniem się samego szczepu lub produkowanych przez niego związków toksycznych do ścieków.

• Stabilność genetyczna (podstawowe parametry hodowli: szybkość wzrostu, wydajność produkcji nie powinna się zmieniać w czasie w zbyt dużych granicach)

• Fagoodporność

• Wymagania pokarmowe (z technologicznego punktu widzenia ważne jest by produkował określony metabolit z zadowalającą wydajnością z prostych i tanich podłoży, Ważną cechą jest też stosunkowi duża tolerancja na zmiany stężenia określonych komponentów pożywki . W biotechnologii stosowane są podłoża przygotowane głównie w oparciu o surowce odpadowe przemysłu spożywczego i rolnego i każda partia tego typu surowca jest różna).

• Zapotrzebowanie na tlen (większość procesów biosyntezy odbywa się w warunkach tlenowych, a tlen jest zwykle najdroższą ,,pożywką” w tych procesach. Tak więc jeżeli uda nam się wyprodukować dany związek przy niższym natlenieniu to przyczynić się to może do uzyskania dużych oszczędności [w tym energetycznych])

• Łatwość (taniość) wydzielania produktów (brak niepożądanych cech technologicznych: pienienie, lepkość, flokulacja)

Wykład II

,, Metody przechowywania drobnoustrojów przemysłowych”

Jednym z najważniejszych kryteriów decydujących o wydajności procesów technologicznych jest zapewnienie stałej wysokiej aktywności metabolicznej drobnoustrojów produkcyjnych. Podstawowe cechy genetyczne, czystość mikrobiologiczna drobnoustrojów muszą być w sposób ciągły kontrolowane a stałość tę zabezpiecza stosowanie odpowiednich metod przechowywania szczepów.

Zasady przechowalnictwa:

• Podstawową zasadą postępowania w zakresie przechowywania drobnoustrojów jest ograniczenie liczby przesiewów, które stwarzają zagrożenie pojawiania się niekorzystnych mutacji spontanicznych (im większa liczna przesiewów tym większe prawdopodobieństwo występowania mutacji spontanicznej).

• Warunki przechowywania drobnoustrojów muszą być tak dobrane by następowała całkowita luba prawie całkowita inhibicja procesów metabolicznych w przechowywanym materiale. Ważne jest tutaj zastosowanie podłoży o tzw. Zrównoważonym składnie, w których źródła C, N, P, mikroelementów występują w odpowiednich proporcjach.

• Należy zachowywać jak najwyższą przeżywalność komórek. (komórki najcenniejsze z technologicznego punktu widzenia są słabsze i mniej odporne na trudne warunki środowiskowe).

• Do przechowywania powinny być stosowane proste podłoża zawierające tanie i dostępne składniki.

Zasady przechowywania:

1. Drobnoustroje zarodnikujące i przetrwalnikujące: najkorzystniejsza formą przechowywania są spory w hodowlach 1-2 tyg.

2. Drobnoustroje nie tworzące spor -komórki w późnej fazie stacjonarnej.

3. Ważne jest dobranie odpowiedniego składu podłoża do namnażania drobnoustrojów przed przechowywaniem ( po przechowywaniu również).

Podłoże I do przechowywania drobnoustrojów to podłoże minimalne uniemożliwjające zbyt obfity wzrost komórek.

Podłoże II stosowane po przechowywaniu do uaktywniania szczepu ma skład zdecydowanie bogatszy aniżeli podło0że minimalne.

Podstawowe metody przechowywania szczepów:

• Pasażowanie- okresowe przeszczepianie populacji drobnoustrojów na świeże podłoże; hodowle te prowadzone są najczęściej na skosach lub w podłożach płynnych, przechowywanie odbywa się w temp +4ºC rzadziej w temperaturze pokojowej. Niekiedy poleca się aby powierzchnię kultury pokryć warstwą płynnej jałowej parafiny uniemożliwiając w ten sposób dostęp powietrza do przechowywanych komórek.

• Przechowywanie komórek w stanie wysuszenia

1. suszenie można prowadzić pod normalnym ciśnieniem w temperaturze pokojowej- najczęściej metoda ta stosowana jest dla grzybów strzępkowych i promieniowców; powolne suszenie prowadzone jest w temp 25ºC (warunki zbliżone do naturalnych) do wysuszenia ,,na wiór”. Niekiedy wysuszone komórki bądź wysuszone zarodniki miesza się z sypkim materiałem: piaskiem, glebą o odczynie neutralnym, żelem silikonowym =>mieszanie wysuszonych komórek stosuje się w celu zabezpieczenia przed zwiększeniem ilości H₂O w otoczeniu komórek, które przy odpowiedniej wartości aw komórek mogłyby zacząć kiełkować i stać się aktywne.

2. Suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności środka pochłaniającego H₂O (P₂O₅)

3. Suszenie w wyniku sublimacji- liofilizacja, to najbardziej rozpowszechniona metoda przechowywania szczepów, liofilizaty mogą być deponowane w ciągu kilku lat bez przeszczepiania, metoda ta ma jednak kilka wad: wysoka cena, niska przeżywalność komórek =>i podczas liofilizacji i podczas przechowywania. W celu zwiększenia przeżywalności liofilizowanych komórek stosuje się następujące zabiegi:

• Do liofilizacji kieruje się zawiesinę o dużej gęstości komórek

• Stosuje się dodatki substancji ochronnych: dimetylosulfotlenu (DMSO) w stężeniu 5%, glicerol w stężeniu 10%, odtłuszczone mleko w stężeniu 20%, sacharoza w stężeniu 10-12%.

Proces liofilizacji jest dwuetapowy:

Etap I => zawiesinę komórek rozlewa się po 0,1 mm do maleńkich fiolek z miękkiego, cienkiego, szkła. Fiolka z zawiesiną jest zamrażana w mieszaninie z suchego lodu z metanolem (w praktyce z etanolem); fiolkę w tym czasie poddaje się ruchowi wirowemu przez co uzyskuje się odkładając skalę na ściankach fiolki cienką warstwę zamrożonej zawiesiny.

Etap II => następuje sublimacja H2O w warunkach podciśnienia poniżej 0,1 mm Hg; zaleca się żeby proces zamrażania przebiegał bardzo szybko (spadek rzędu 1000º na minutę) lub powoli (1º na minutę). W czasie sublimacji należy utrzymywać temperaturę -50ºC, w tym etapie stosowany jest środek suszący (P2O5).

Wszystkie operacje między etapem I i II powinny być prowadzone bardzo szybko w celu max ograniczenia dostępu tlenu.

Po zakończeniu liofilizacji fiolkę zatapia się pod próżnią, przechowuje w temp -12ºC; -18ºC lub w zamrażalniku. Poziom wilgotności w materiale wysuszonym nie powinien przekraczać 1%.

• Przechowywanie komórek w stanie zamrożenia

Temperatura poniżej -20ºC do -196ºC. Komórki powinny być szybko zamrażane aby nie powstawały duże kryształy które mogłyby rozerwać komórek i doprowadzić do jej śmierci (apoptazy).

Metoda uznawana aktualnie za najbardziej zabezpieczającą przeżywalność drobnoustrojów. Metoda kosztowna, ponieważ wymaga odpowiednich drogich urządzeń i instalacji z ciekłym azotem dla uzyskania głębokiego zamrożenia. Stosunkowo łatwo jest uzyska temp -20ºC jednakże z uwagi na tworzenie się mieszanin eutektycznych(?) temperatura ta nie jest zalecana, Korzystne jest natomiast zamrażanie poniżej -40ºC.

• Przechowywanie w temperaturze +4ºC zawiesiny komórek w H₂O destylowanej

Komórki przechowywane musza być wcześniej pozbawione składników podłoża i zawieszone w H₂O destylowanej. Zawiesinę komórek mieszczą się w małych najczęściej plastikowych ampułkach, do których wprowadza się po 1ml drobnoustrojów. Ampułki umieszcza się najczęściej w aluminiowym pojemniku umożliwiającym kontrolowane schładzanie 1º na minutę.

Rodzaje:

- podłoża minimalne zawierające jedynie składniki niezbędne do wzrostu szczepu.

- podłoża wzbogacone (stosowane w procesach biotechnologicznych) zawierające np. melasę, namok kukurydziany, serwatkę.

Surowce stosowane w biotechnologii:

Odpadowe surowce pochodzące z różnych gałęzi przemysłu.

Źródła C: melasa -50% zawartości sacharozy, 10-12% suchej masy zw N, 11-12% sole mineralne, witaminy (np. biotyna, tiamina, kwas pantotenowy, B6) a także aminokwasy (np. kwas glutaminowy). Melasę stosuję się do produkcji kwasów organicznych między innymi: kwasu cytrynowego i aminokwasów (lizyna, kwas glutaminowy)

W Europie stosowana jest melasa buraczana, w Azji i Ameryce melasa z trzciny cukrowej o nieco innym składzie.

Najważniejsze zadania przechowalnictwa:

• Niedopuszczenie do zakażeń

• Zapewnienie stabilności

• Stosunkowa duża przeżywalnośc

Podłoża do przechowywania to podłoża zrównoważone, czyli podłoże o odpowiednim stosunku C: N: P: mikro elementów i ma zapewniać dodatkowo utrzymanie szczepu w stanie uśpienia (czyli w stanie minimalnego metabolizmu).

Liofilizacja => szczep musi być pozbawiony wody do 99%

Wykład III

W biotechnologii stosuje się 3 rodzaje podłoży hodowlanych:

1)podłoża ściśle zdefiniowane (o ściśle zdefiniowanym składzie)

2)podłoża minimalne

3)podłoża produkcyjne, kompleksowe

Ad. 1)

Sa to podłoża stosowane w procesach laboratoryjnych, przygotowywane w oparciu o określone substancje przygotowane do celów mikrobiologicznych i są to np. ekstrakt drożdżowy, peptony (zestawy określonych peptydów). To samo dotyczy źródła węgla i jest glukoza, skrobia, brzeczka (Malt ekstrakt). W podłożach tych mogą być również stosowane dodatki określonych witamin, aminokwasów makro i mikro elementów.

Ad2)

W procesach nad optymalizacją procesów biotechnologicznych oraz w badaniach bądź fizjologia drobnoustrojów stosuję się tzw. Podłoża minimalne. Skład tych podłoży jest ściśle zdefiniowany a wszystkie składniki dodawane są w ilościach minimalnych. Skład tych podłoży opracowywany jest na bazie wybranych cukrów, aminokwasów, witamin, makro i mikro elementów.

Ad3)

Podłoża produkcyjne są stosowane w procesach biosyntezy różnego typu produktów muszą być przede wszystkim tanie. A więc bazą do ich przygotowania musza być odpadowe surowce przemysłu spożywczego, papierniczego czy odpadowe produkty ropopochodne.

Melasa to przede wszystkim źródła C

Serwatka _______//____________ N

Namok kukurydziany ____//_____ N i substancji wspomagających wzrost i biosyntezę wielu produktów.

Odpady przemysłu tłuszczowego one również wspomagają. Olej arachidowy, palmowy mogą spowodować wzrost produkcji wybranych metabolitów drugorzędowych.

MELAS

Jest to odpad po krystalizacji cukru. Zawartość sacharozy w tym odpadzie dochodzi do 80-85%. Zawartość suchej masy wynosi około 50%. Związków azotowych jest tam koło 5%, soli mineralnych do 10% liczne witaminy, biotyna, tiamina, kwas pantotenowy i pirydoksyna.

Na bazie melasy opracowane są podłoża do produkcji kwasu cytrynowego, alkoholu i produkcji drożdży spożywczych. Pokrewnymi substratami do melasy stosowanym w biotechnologii jest sok z trzciny cukrowej i hydrolizaty skrobiowe (są to produkty uboczne pozostające po wykrystalizowaniu glukozy z hydrolizatu skrobiowego uzyskanego w wyniku kwaśnej lub enzymatycznej hydrolizy skrobi ziemniaczanej.

Melasa zawiera również substancje niepotrzebne : betaina, kwasy lotne, związki wapniowe, koloidy pektyn, karmel, metale ciężkie (Pb, Cu, Fe) i zbyt duża ilość azotanów. Czasem są tam również pestycydy.

SERWATKA

Jest produktem odpadowym otrzymywanym z mleka podczas produkcji serów i twarogów po usunięciu kazeiny i tłuszczy. Podstawowymi jej składnikami są laktoza oraz wybrane aminokwasy i peptydy. Rozróżnia się tzw serwatkę słodką, kwaśną. Słodka powstaje z produkcji serów. Kwaśna przy produkcji twarogów. pH serwatki słodkiej => 6,2-6,5 a kwaśnej => 4,1-4,2

Serwatka wykorzystywana jest do produkcji drożdży paszowych i częściowo do produkcji etanolu. Dodatki serwatki są stosowane do produkcji penicyliny oraz do produkcji enzymów proteolitycznych przez szczepy z rodzaju Bacillus. Należy brać również pod uwagę to, że serwatka ulega bardzo łatwo zakażeniu w związku z tym nie jest chętnie stosowana w procesach biotechnologicznych, chyba, że została wcześniej poddana procesowi suszenia - jednak to zwiększa koszty surowca.

Wśród POLISACHARYDÓW największe znaczenie ma skrobia. Wprowadzana jest do podłoży hodowlanych jako skrobia ziemniaczana, kukurydziana, jęczmienna, pszenna, żytnia. Zwykle w surowych preparatach tych polisacharydów znajdują się niewielkie ilości witamin.

W biotechnologii wykorzystywane są również polisacharydy otrzymywane z wodorostów morskich pozyskiwanych ze środowiska naturalnego i są to substancje o nazwach: argininy, karageniany i agary.

Poza węglowodanami jako źródło węgla mogą być stosowane WĘGLOWODORY i ich pochodne (np. metanol, który jest stosowany głównie do biosyntezy białka paszowego, etanol stosuje się do produkcji kwasu octowego)

GLICEROL jest oleistą, rozpuszczalna w H₂O cieczą o słodkawym smaku i otrzymywany jest w wyniku hydrolizy tłuszczów. Powstaje też jako produkt uboczny podczas fermentacji etanolowej. Stosowany jest jako składnik podłoży do produkcji wybranych antybiotyków np. erytromycyny oraz do syntezy aminokwasów takich jak kwas glutaminowy i treonina oraz do syntezy wybranych enzymów.

TŁUSZCZE roślinne i zwierzęce stosuje się jako źródło C zwykle w połączeniu z sacharydami. Stosowane są jako dodatki w produkcji penicyliny, tetracykliny, aminokwasów, E-lizyny. Wśród węglowodorów zastosowanie znajdują głównie alkany. Poczynając od metanu, butanu. Kończąc na parafinach o długości łańcucha do C20. Węglowodory te stosowane są głównie do produkcji białka paszowego.

Surowce stanowiące źródło N dla drobnoustrojów.

W biomasie komórek 8-14% ich suchej masy stanowi N. Źródłem N w podłożach produkcyjnych jest najczęściej mąka sojowa, rzepakowa bądź kukurydziana. Mąka sojowa znajduje szerokie zastosowanie w syntezie streptomycyny, neomycyny, antymycyny oraz produkcji aminokwasów (kwasu glutaminowego).

W syntezie antybiotyków stosowana jest również mąka kukurydziana. Źródłem substancji azotowych może być również mączka rybna jest ona jednak rzadko stosowana w procesach biosyntezy najczęściej przy produkcji enzymów proteolitycznych.

Ogromne wykorzystanie w biotechnologii ma namok kukurydziany i jest to produkt uboczny powstający w procesie ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Zawiera cenne aminokwasy, witaminy i sole mineralne. Wada tego surowca są duże wahania składu hydrolizatu.

Namok kukurydziany stosowany jest zarówno w procesach syntezy antybiotyków jak i enzymów, aminokwasów. Ważnym surowcem jest autoliza drożdżowy oraz drożdże suszone ………… Produkty te są cennym surowcem aminokwasów, peptydów, witamin, sacharydów i soli mineralnych. Autolizaty te przygotowywane są zarówno z drożdży piwowarskich jak i piekarskich uzyskiwanych jako odpad przy produkcji piwa czy alkoholu etylowego.

Surowcami ważnymi dla biotechnologii są również celuloza i hemiceluloza. W biotechnologii służą głównie do produkcji białka paszowego i etanolu. Na użytek określonych technologii przygotowywane są hydrolizaty białkowe zarówno z białka zwierzęcego i roślinnego. Hydrolizat z mączki orzeszków ziemnych stosowany jest do produkcji L-lizyny. Zastosowanie znajduje również żelatyna, która jest ekstrahowana z kości i stawów zwierząt po uprzednim usunięciu kolagenozy. Ważnym i zwykle najdroższym ,,surowcem” w biotechnologii jest tlen. Większość procesów biotechnologicznych prowadzona jest w warunkach wysokiego natlenienia. Tlen słabo rozpuszcza się w H₂O i tylko w rozpuszczonej formie przyswajany jest przez drobnoustroje. Poziom natlenienia determinuje wydajność wielu produktów zarówno aminokwasów, kwasów organicznych, enzymów i witamin.

STYMULATORY WZROSTU

Rolę te pełnią zwykle grupy prostetyczne enzymów luz związki i zbliżonej strukturze do tych grup prostetycznych. Podstawową rolę mga pełnić również koenzymy. Zwykle substancje te trzeba doprowadzać z zewnątrz.

WITAMINY- w metabolizmie drobnoustrojów największe znaczenie mają witaminy z grupy B- biotyna i tiamina. W surowcach takich jak melasa występuje zwykle niedobór biotyny i jej ilość jest zwykle uzupełniana, podobnie konieczne są dodatki biotyny do produkcji aminokwasów (lizyny, kwasu glutaminowego). Czasami konieczny jest dodatek wybranych ściśle określonych aminokwasów oraz związków purynowych i pirymidynowych. Związki te biorą udział w przekazywaniu informacji genetycznej i ich niedoborów może obniżyć wydajność wielu procesów. Dobrym źródłem tych substancji jest suszona krew i mięso.

WYKŁAD IV

PRODUKCJA BIAŁKA MIKROBIOLOGICZNEGO

Deficyt białka w systemie spowodował podjęcie intensywnych badań nad syntezą białka drobnoustrojowego ( określa się je SCP single cel protein)Głównym argumentem przemawiającym za produkcja białka mikrobiol. jest to, że jego produkcja trwa kolka dni a synteza a białka roślinnego czy zwierzęcego kilka miesięcy a nawet lat. Drugim argumentem jest to, że jest to białko o bardzoe wysokiej wartości , klasyfikowane jest tuż za białkiem zwierzęcym a przed białkiem roślinnym. Może być produkowane z róznego typu surowców, poczynając od odpadów przemysłowych, rolno-spożywczych na ropie naftowej kończąc.

Czas podwajania masy u różnych organizmów:

Bakterie i drożdże Algi Trawa i niektóre rośliny Kurczaki Świnie Bydło (młode) Człowiek (młody)

20-120 min 2-6 h 1-2 tyg 2-4 tyg 4-6 tyg 1-2 m-cy 3-6 m-cy

Surowce z których otrzymuje się białko mikrobiologiczne:

Białko mikrobiologiczne możemy uzyskiwać z bakterii, drożdży, grzybów strzępkowych.

• Grzyby strzępkowe: odpady celulozowe i skrobiowe

• Drożdże: serwatka, melasa, ługi sulfidowe, ropa naftowa, u-parafiny

• Bakterie (metylotrofy): metan, metanol, etanol

Wśród bakterii dużym zainteresowaniem cieszą się bakterie metylotroficzne wykorzystujące jako źródło C i energii metan lub metanol.

Szerokie spektrum substratów wykorzystują drożdże i są to takie surowce jak: melasa, serwatka, u-parafiny, ług posiarczynowy (odpad przy produkcji papieru)

Grzyby pleśniowe hoduje się w pożywkach zawierających odpady skrobiowe, celulozowe. Do produkcji białka mikrobiologicznego wykorzystuje się też glony posiadające zdolność czerpania energii słonecznej i wykorzystywania CO₂ jako źródła C. Wśród glonów na szczególną uwagę zasługuje glon o nazwie chlorella u których 20% energii czerpane jest ze światła słonecznego, podczas gdy u typowych roślin lądowych udział energii słonecznej wynosi około 2%.

Produkcja SCP jest przykładem procesu biosyntezy typu I według podziału Gadena

Produkt powstaje równocześnie z przyrostem biomasy!

Jeżeli zatem przyczyniamy się do jak najlepszego wzrostu bakterii (zapewniamy najbardziej optymalne warunki wzrostu) to uzyskujemy największe ilości produktu o najlepszej jakości. Gdy proces nie przebiega w warunkach optymalnych (tzn. przy niedoborze jakichś substratów niezbędnych dla drobnoustroju) to podczas biosyntezy drobnoustroje mogą uruchamiać dodatkowe poboczne szlaki metaboliczne i syntetyzować niepożądane substancje dostające się do produktu (np. toksyny czy substancje powodujące alergie)

Podstawowym wskaźnikiem dla technologa jest to, by proces biosyntezy prowadzony był w warunkach optymalnych! Chodzi o prowadzenie hodowli w odpowiednich dla danego drobnoustroju stężeniach C, N, P itp. Oraz optymalne pH, temperatura, potencjał Osydo-redukcyjny.

Zmiana warunków może powodowa, że przy mniej korzystnych parametrach mogą gromadzić się substancje toksyczne i alergizujące.

SCHEMAT I

Etapy produkcji SCP.

1. przygotowanie podłoża hodowlanego (odpowiedni skład)

2. Hodowla drobnoustrojów (do produkcji SCP wykorzystuje się drobnoustroje należące do grupy całkowicie bezpiecznych- drobnoustroje z gr I)

3. Namnażanie biomasy (warunki hodowli optymalne)

4. Oddzielenie biomasy, przemycie komórek

5. Wstępne usunięcie kwasów nukleinowych (przy diecie bogatej w kw. Nukleinowe tworzy się kwas moczowy słabo rozpuszczalny, który odkłada się w nerkach i stawach wywołując bolesne stany chorobowe, w diecie dorosłego człowieka ilość kw. Nukleinowych Ne powinna przekraczać 2g. Natomiast zawartość kwasów w SCP sięgać może kilkunastu %. Kwasy nukleinowe usuwa się traktując komórki HCL lub enzymami -odpowiednimi preparatami enzymatycznymi)

6. Dezintegracja komórek (ściany komórkowe drobnoustrojów są często trudno przyswajalne przez organizmy o prostej budowie żołądka-łatwiej u przeżuwaczy)

7. Fluoranie(?) i wytrącanie białka wewnątrzkomórkowego.

8. Suszenie, aromatyzowanie, standaryzacja, upostaciowienie produktu

O wartości odżywczej SCP decyduje skład aminokwasów białka oraz towarzyszące substancje tj. Sacharydy, lipidy, witaminy, makro i mikro elementy. Jeżeli chodzi o skład produktu to różni się on bardzo w zależności od tego, czy otrzymany produkt uzyskany był z drożdży czy bakterii i tak, jeżeli chodzi o zawartośc różnych substancji odżywczych:

Białka	Drożdże	Bakterie
Białko Kw. Nukleinowe Lipidy Sacharydy	50% 6,5% 10% 26%	~77% 16,5% 5,5% 10%

Bakterie namnażają się szybciej niż drożdże.

SCP zawiera cenne aminokwasy tj> Ile, Tyr, treoninę, tryptofan, lizynę .Szczególnie ważna jest zawartość lizyny, ponieważ występuje ona w niewielkich ilościach w białku roślinnym.

Podstawowe zalety produkcji SCP:

• Tania produkcja

• Szybka i efektywna

• Dobry skład aminokwasów w produkcie

• Wysoka wartość odżywcza

• Możliwość szerokiego wykorzystywania produkcji (dodatek do pasz i zywności)

Wady produkcji SCP:

• Brak specjalistycznej kadry biotechnologicznej w krajach III świata

• Możliwość odczynu alergicznego

• Niestrawne ściany komórkowe

• Zbyt duże stężenie kwasów nukleinowych!!!

PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO (produkcja o największej skali)

Niemal cała światowa produkcja kwasu cytrynowego opiera się na metodach biotechnologicznych a głównym drobnoustrojem wykorzystywanym do jego produkcji jest grzyb strzępkowy: Aspergillus Niger Podstawowym surowcem dla produkcji tego kwasu jest sacharoza.

Inne organizmy produkujące kwas cytrynowy:

Drożdże Candida z parafiny

Drożdże Yarowia z glukozy

Produkcja odbywa się 3 metodami:

1. metoda powierzchniowa

2. metoda wgłębna

3. metoda solid state SSF

Ad1)

Proces biosyntezy prowadzony jest w b. dużych komorach, gdzie zamieszczone są od podłogi do sufitu stelarze z zamontowanymi na nich tacami ze stali kwasoodpornej (wysokość tac 12-15 cm)

Komory te mają układ do sterylizacji przegrzana parą oraz systemy dostarczania pożywek i ich odprowadzania. Dodatkowo znajduje się tam również system umożliwiający zaszczepienie podłoża aerozolem zarodników Aspergillus Niger.

Ad2)

Stosuje się tu typowe bioreaktory wyposażone w mieszadła turbinowe i efektywne systemy napowietrzające zapewniające dobre rozprowadzenie pęcherzyków powietrza w bioreaktorze. W technologiach tych stosuje się tez bioreaktory wieżowe, w których nie ma mieszadła- powietrze przepływając przez reaktor powoduje mieszanie płynów.

Kwasy organiczne:

Przemysł spożywczy: dodatek do żywności

Przemysł chemiczny: kosmetyki, środki grzybobójcze, żywice, polimery, farmaceutyki

Są to metabolity pierwotne:

Kwas cytrynowy (Aspergillus Niger, Candida)

Kwas glukonowy (Aspergillus Niger, Acetobacter suboxydans)

Kwas mlekowy (Lactobacillus)

Kwas α-ketoglutarowy (Candida, Aerobacter, lab)

Kwas malonowy (Leuconostock (?), Candida, lab)

Kwas itakonowy (Aspergillus itaconius, Aspergillus terreus)

Kwas octowy (Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum)

Kwas itakonowy=> przemysł tworzyw sztucznych

Kwas cytrynowy (pośrednik cyklu Krebsa)

Kwas 2-hydroksy-1,2,3-trikarboksylopropanowy

Metabolit powstający w ramach cyklu kwasów trikarboksylowych.

• Pierwsza produkcja jego mikrobiologicznej syntezy została uruchomiona w 1023 roku

• Wytwarzany w ilościach około 1 mln ton na rok

99%synteza mikrobiologiczna + z soku cytrynowego (7-9% kwasu w soku)

Zastosowania:

• 60% przemysł spożywczy -smak, konserwacja

• 10% farmacja - stabilizator cytr-Fe

• 20% przemysł chemiczny- przeciw pienieniu, zmiękczacz (dzięki wiązaniu się z jonami metalu) przemysł detergentów (zastąpienie PolyP)

Przemysł produkujący kwas cytrynowy:

Surowce: A. Niger- tanie źródło węglowodanów mono i polisacharydy (melasa) Candida Cn- alkany

Typy fermentacji: proces tlenowy

Metoda:

• Powierzchniowa (20%) 8-14 dni

1. podłoże ciekłe, najstarsza metoda

2. podłoże stałe, zwilżane (solid state) 7-9 dni

• wgłębna (80%) 6-9 dni

a) okresowa (en, wiedza, korozja/cena, wydajność)

b) ciągła (Candida lypalityca, n-alkany)

Kwas cytrynowy jest to metabolit powstający w centrum najważniejszych szlaków metabolicznych i bardzo trudnoa jest dobrze kontrolować proces wytwarzania kwasu cytrynowego , gdyż łatwo przejść do slaków pobocznych.

Parametry wpływające na wydajność:

1)

2)

3)

4)

5)

WykładV

Metoda powierzchniowa produkcji kwasu cytrynowego:

Zbiornik z malasą => zbiornik w którym przygotowywane jest podłoże hodowlane (mieszanie składników)

• Sterylizacja składników=> komory z tacami ze stali kwasoodpornej na które wprowadza się sterylne podłoże (komora pełni funkcję fermentora)

• Do komory wprowadzane inokulum w postaci powietrza (?) powietrze wlotowe ……… aerozolu są rozprowadzane i otworami wylotowymi …………………na tace, na których odprowadzane jest powietrze ma przebiegać hodowla. (??????)

• Po zakończeniu hodowli=> spływ do którego wprowadza się biomasę i ciecz pohodowlaną( oddzielenie biomasy i produktu od cieczy pohodowlanej), Wprowadza się parę przegrzaną w celu stabilizacji materiału biologicznego.

• Wydzielanie produktu

Podstawowym mankamentem hodowli powierzchniowej jest to, że grzybnia która wyrosła w postaci kożucha na powierzchni podłoża ma w zależności od warstwy zróżnicowany dostęp do źródła C i tlenu.=> warstwy wierzchnie grzybni są odpowiednio natlenione nie mają jednak dostatecznego dostępu do źródła C, warstwy dolne przylegające do podłoża mają odpowiedni dostęp do źródła C i deficyt tlenu. Wiele energii przekazywane jest grzybni na transport substancji odżywczych do kolejnych warstw grzybni oraz na dyfuzję tworzonego kwasu cytrynowego do pożywki.

Jak wspomniano wcześniej podstawowym surowcem stosowanym w hodowli okresowej jest melasa- zawiera ona stosunkowo duże ilości kwasów lotnych i jonów metali ciężkich, komponenty te mogą wpływać negatywnie na wzrost grzybni, gdyż mogą powodować opóźnienie wzrostu i zatapianie kożucha grzybni. W celu zredukowania negatywnego wpływu jonów metali ciężkich do melasy dodaje się ściśle określone drobne ……………………….. dawki żelazocyjanku K, który wiąże jony metalu ciężkich w kompleksy i te, jako trudno rozpuszczalne, wytrącają się i osadzają na dnie tacy do hodowli. Tak więc grzybnia rozwijająca się na powierzchni praktycznie nie podlega negatywnemu oddziaływaniu spowodowanym obecnością tych jonów.

Wydajności kwasu cytrynowego produkowanego metodą powierzchniową dochodzą do 70-80%. Proces jest dobrze poznany, zasady doboru surowca wnikliwie opracowane, tak więc metoda ta w dalszym ciągu jest stosowana.

Produkcja kwasu cytrynowego metodą wgłębną.

Hodowla odbywa się najczęściej w typowym bioreaktorze wyposażonym w mieszadło turbinowe i efektywny system dostarczania powietrza i dokładnego rozpraszania w fermentorze. Grzybnia A. Niger w warunkach hodowli wgłębnej rośnie w postaci ,,pulpy) luźnych strzępek grzybni lub w postaci kuleczek, które określa się jako ,,pellets” (kłębuszki) i zalecane jest by średnica tej kuleczki wynosiła 0,5-1,5 mm. Szczepy A. Niger są selekcjonowane do tej produkcji nie tylko pod katem wydajności ale i formy wzrostu w warunkach wgłębnych. Zdolność do tworzenia pellets o wyżej wymienionych rozmiarach stanowi bardzo korzystną cechę technologiczna.

Wzrost grzybni w postaci luźnych strzępek (pulpa)jest niewskazany, ponieważ zawiesina tak uformowanej grzybni przestaje mieć właściwości płynu Newtonowskiego i jej lepkość staje się funkcją szybkości ………………………, więc podczas mieszania pulpy grzybni lepkość płynu jest niska w pobliżu łopatek mieszadła i wysoka na obrzeżach fermentora. Dobremu mieszaniu podlegają jedynie strzępki znajdujące się w pobliżu mieszadła, a na obrzeżach mogą powstać strefy martwe, do których nie będzie docierać tlen a i transport pożywek będzie niewystarczający (obecna tam grzybnia ulegnie autolizie)

Niewskazane jest również by pellets osiągały średnicę > 2,5-3 mm. Najstarsze strzępki zlokalizowane sa we wnętrzu kuleczki w ze względu na duże jej rozmiary transport pożywek i tlenu do tych najstarszych strzępek znajdujących się w centrum kuleczek jest utrudniony, co powoduje autolizę tych strzępek.

Następnym mankamentem hodowli wgłębnej jest to, że często nie może być w niej wykorzystywana melasa gdyż przy tej formie hodowli grzybnia ma bezpośredni kontakt z czynnikami toksycznymi znajdującymi się w melasie i używanie żelazocyjanku K jako czynnika neutralizującego wpływ jonów metali ciężkich jest nieskuteczne. W hodowli wgłębnej stosuje się więc jako podstawowy surowiec cukier biały lub syropy glukozowe, czyli odpady z produkcji glukozy ze skrobi ziemniaczanej.

Produkcja kwasu cytrynowego metoda wgłębna w obecności różnych substratów:

Substrat	Początkowe stęż. cukru w podłożu	Czas trwania fermentacji	Wydajność kwasu cytrynowego
Cukier biały	15-20%	120h	90%
Cukier surowy	15-18%	140h	85%
Cukrowniczy sok gęsty	12-15%	145h	80%
Melasa buraczana	12-15%	150h	80%
Skrobia ziemniaczana	15-18%	160h	85%
Syrop skrobiowy	12-18%	160h	85%

Przebieg biosyntezy kwasy cytrynowego z udziałem A. Niger. (na egzamin!!!)

Źródło N najczęściej NH₄NO₃ = komponent trudno przyswajalny

||

Komponent łatwiej przyswajalny

Wykład VI

Uwarunkowania biosyntezy kwasu cytrynowego

• Uwarunkowania metaboliczne

• Uwarunkowania technologiczne

Schemat:

1. PEP karboksylaza

2. PEP karboksykinaza

3. PEP karboksytransfosforylaza

4. Karboksylaza pirogronianowa

5. Enzym jabłczany

6. Cykl gliksalanowy

Od trzeciego dnia na grzybni pojawiają się zarodniki, w których jest duża zawartość glicerolu.

Gromadzony w sporach glicerol hamuje działanie dehydrogenazy izocytrynianowej w mitochondriom.

• Po fazie wzrostu naturalne odłączenie cyklu TCH przez obniżenie aktywności dehydrogenazy izocytynianowej i akonitazy (enzymy po izocytrynianie w TCH)

• Nagromadzenie 2,6-difosfofruktozy (glikoliza)

• Uruchomienie szlaków pomocniczych (anaplerostycznych) prowadzących do tworzenia szczawiooctanu.

Drogi tworzenia szczawiooctanu:

1) karboksylaza pirogronianowa Mg²⁺ , K⁺




2) karboksylaza fosfoenolopirogronianowa Mg²⁺, Mn²⁺, NH₄⁺, K⁺




• Cykl glikosalowy: rozpad izocytrynianu C6 na bursztynian (C4) i glioksalan (C2). Glioksalan z aceto CoH tworzy szczawiooctan

Pożywka do produkcji kwasu cytrynowego zawiera zwykle źródło węgla w wysokim stężeniu dochodzącym do 20%, stężenie źródła N w tym podłożu jest relatywnie niskie i wynosi kilka w z litrze i jest to zwykle mieszanina jonów NH₄⁺ i NO₃^- (jony amonowe łatwiej przyswajalne a azotany trudniej). W podłożach tych limituje się stężenie jonów Fe, Mn, Mg jakos czynników związanych układem oddechowym, oraz jonów fosforanowych jakos podstawowego nośnika energii. Przy tak skomponowanym składzie podłoża w 2 dobie hodowli zaczyna brakować komponentów do kontynuacji intensywnego wzrostu, stąd grzybnia zaczyna szukać alternatywnych rozwiązań dla kontynuacji funkcji życiowych. W miarę biegu hodowli uaktywnieniu ulega glikoliza przy jednoczesnym ograniczeniu funkcji HMP; w czasie wzrostu grzybni szlak EMP jest dwa razy bardziej aktywny niż szlak HMP, w fazie produkcji nasila się relatywnie aktywność szlaku EMP.

EMP-

HMP- cykl monofosforanowy

Podczas produkcji kwasu cytrynowego następuje obniżenie aktywności hydratazy akonitanowej w wyniku niedoboru jonów Fe. (ogranicza to możliwości rozkładu cytrynianu w ramach cyklu Krebsa) zniesiona jest inhibicja fosfofruktokinazy przez cytrynian

(u szczepów dzikich funkcjonuje mechanizm silnego hamowania tego enzymu przez cytrynian, aktywatorem fosfofruktokinazy u szczepów dzikich są jony amonowe a procesów syntezy kwasu cytrynowego jest deficyt tych jonów- dlatego ważne jest aby strosowany mutant miał ten mechanizm regulacji zniesiony)

Ograniczenie dawki Mn w podłożu powoduje, ze w komórce zwiększa się stężenie jonów amonowych, a jak powiedziano wcześniej NH₄⁺ znosi hamowanie fosfofruktokinazy przez cytrynian.

Po zakończeniu fermentacji płyn hodowlany w którym jest pełna pula kwasu cytrynowego zastaje oddzielony od grzybni. Grzybnia przegrzana i z całości płynu wyodrębniany jest kwas cytrynowy

Pierwszym etapem wyodrębniania jest dodawanie do roztworów CaCo₃ co powoduje wytrącenie nierozpuszczalnych soli: cytrynian Ca. Osad oddziela się od rozpuszcza dosając stężonego kwasu H₂SO₄. W tych warunkach wytrąca się gips CaSO₄ a kwas cytrynowy przechodzi do roztworu.

Roztwór ten poddaje się zatężaniu a następnie kwas cytrynowy ulega krystalizacji. Metoda ta jest bardzo uciążliwa z punktu widzenia ochrony środowiska, ze względu na gromadzenie ogromnych ilości produktów odpadowych np. gipsu. Operacje z H₂SO₄ są również niedogodnym elementem tego procesu. Alternatywna metodą oczyszczania jest metoda tzw. zmodyfikowana

Zmodyfikowana:

Fermentacja

↓

Oddzielenie grzybni

↓

Wytrącenie białka (koagulanty)

↓

Filtracja I (osadzanie białka, ziemia okrzemkowa, tkaniny)

↓

Zagęszczanie I (do około 25%)

↓

Klarowanie (koagulanty, węgiel aktywny)

↓

Filtracja II (ziemia okrzemkowa, tkaniny)

↓

Oczyszczanie na jonitach (kationity, anionity)

↓

Zagęszczanie II

50% ↓ ↓~75%

Rozlewnia kwasu krystalizacja

Cytrynowego ↓

Krystaliczny kwas cytrynowy

PRODUKCJA ANTYBIOTYKÓW

Antybiotyki- związki naturalne wytwarzane przez drobnoustroje i organizmy wyższe, też półsyntetyczne pochodne tych związków naturalnych; najważniejszą cechą antybiotyków jest to, że w małym stężeniu często <1mg/ml działają hamująco lub bójczo na wybrane grupy drobnoustrojów.

Zjawisko antybiozy odkrył A Fleming w 1929r.

I fabryka penicyliny powstała w 1942 roku w USA i uruchomiona została przez Wajsmana.

Kryteria klasyfikacji antybiotyków:

=>Budowa chemiczne antybiotyku:

• Antybiotyki β-laktamowe (penicylina)

• Antybiotyki polipeptydowe

• Antybiotyki aninoglikozydowe

• Tetracykliny

• Antybiotyki makrolidowe

• Antybiotyki polifenolowe

• Chloramfenikol

=>ze względu na mechanizm działania

• Zakłócające syntezę ściany komórkowej (penicyliny, cefalosporyny, bacytracyna, cykloseryna)

• Zakłócające funkcjonowanie membrany cytoplazmatycznej (granicyzyna, polimyksyna)

• Hamujące synteze kwasów nukleinowych (na poziomie transkrypcji)

• Zakłócające translację, czyli synteze białka na rybosomach (erytromycyna, tetracyklin, chloramfenikol, streptomycyna)

• Zakłócające procesy energetyczne (autymycyna)

=> ze względu na zakres działania

• Antybiotyki o szerokim zakresie działania (szerokie spektrum antybiotyku) (penicyliny, cefalosporyny, tetracykliny)

• Antybiotyki działające na bakterie gram+ (penicylina, cykloseryna)

• Antybiotyki działające na bakterie gram - (penicylina, kolestyna)

• Antybiotyki przeciw prątkom gruźlicy (gentamycyna, wiromycyna)

• Antybiotyki przeciwgrzybowe (nystatyna)

• Antybiotyki przeciw nowotworowe

Głównym producentem antybiotyków są promieniowce Streptomyces, antybiotyki produkowane są również przez grzyby Penicillinum i bakterie: główne szczepy Bacillus (bacytracyna)

Drobnoustroje przemysłowe: charakterystyka i źródła pozyskiwania

Główne kryteria oceny szczepów przemysłowych

Metody przechowywania drobnoustrojów przemysłowych

Zasady przechowywalnictwa

ZASADY PRZECHOWYWANIA

Podstawowe metody przechowywania szczepów

Surowce stosowane w biotechnologii

Rodzaje podłoży

MELAS

SERWATKA

POLISACHARYDY

WĘGLOWODORY

GLICEROL

TŁUSZCZE

STYMULATORY WZR

WITAMINY

PRODUKCJA BIAŁKA MIKROBIOLOGICZNEGO

Etapy produkcji SCP

Wady i zalety produkcji SCP

PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO

Metoda powierzchniowa produkcji kwasu cytrynowego

Produkcja kwasu cytrynowego metodą wgłębną

UWARUNKOWANIA(METABOLICZNE I TECHNOLOGICZNE) BIOSYNTEZY KWASU CYTRYNOWEGO

METODY OCZYSZCZANIA KWASU CYTRYNOWEGO

Drogi tworzenia szczawiooctanu

PRODUKCJA ANTYBIOTYKÓW

KRYTERIA KLASYFIKACJI ANTYBIOTYKÓW

BIOSYNTEZA PENICYLINY

17

---