Katedra Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii

Otrzymywanie 1-fosforanu α-D-glukopiranozy przez fosforolizę skrobi

Prowadzący: mgr inż. Marta Grec

Miejsce ćwiczeń: sala 7

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest otrzymanie 1-fosforanu α -D-glukopiranozy w wyniku enzymatycznej fosforolizy skrobi

2. Wstęp teoretyczny

W organizmach zwierząt 1-fosforan α-D-glukopiranozy stanowi produkt pośredni
w metabolizmie glikogenu - zapasowej formy glukozy¹. Glikogen jest rozgałęzionym polimerem, złożonym z reszt glukozy. Większość reszt glukozy w glikogenie jest połączona wiązaniami α -1-4-glikozydowymi. Rozgałęzienia, występujące przeciętnie co dziesięć reszt glukozy, tworzone są przez wiązania α-1-6-glikozydowe.

Rozkład glikogenu przebiega w trzech etapach:

• Uwolnienie glukozo-1-fosforanu

• Przekształcenie glukozo-1-fosforanu w glukozo-6-fosforan

• Metabolizm glukozo-6-fosforanu (m.in. przetworzenie w wolną glukozę)

Ten trójetapowy proces wymaga wspólnego działania kilku enzymów. Pierwszy etap katalizuje fosforylaza glikogenowa.

Fosforylaza glikogenowa katalizuje odłączenie pojedynczej reszty glukozy z glikogenu przez dodanie do niej ortofosforanu (P_i). Reakcja ta prowadzi do powstania
1-fosforanu α-D-glukopiranozy. Rozszczepienie wiązania poprzez dodanie ortofosforanu nazywa się fosforolizą (Schemat 1).

Schemat 1

Fosforylaza glikogenowa katalizuje kolejne reakcje usuwania reszt glukozowych z nieredukującego końca cząsteczki glikogenu (końca z wolną grupą -OH przy C-4). Ortofosforan rozrywa wiązanie glikozydowe między węglem C-1 reszty końcowej a węglem C-4 reszty z nią sąsiadującej. Przy tym rozszczepieniu zostaje zachowana konfiguracja α przy węglu C-1.

Glukozo-1-fosforan uwalniany z glikogenu może być łatwo przekształcany przez fosfoglukomutazę do glukozo-6-fosforanu, który jest ważnym metabolitem pośrednim.

Fosforolityczne rozszczepienie glikogenu jest energetycznie korzystne, gdyż uwolniony cukier jest już zfosforylowany.

W roślinach występują główne dwie formy zapasowe cukrów: skrobia i sacharoza. Skrobia, podobnie jak glikogen (jej odpowiednik występujący u zwierząt), jest polimerem reszt glukozowych. Jest jednak mniej rozgałęziona niż glikogen.

1-Fosforan α-D-glukopiranozy powstaje zatem również w wyniku reakcji fosforolizy enzymatycznej skrobi (Schemat 2). Katalizatorem tej reakcji jest enzym: α-1,4-glukan: ortofosforan glukozylotransferazy (fosforylaza α -glukanowa).

Schemat 2

W procesie tym fosforylaza α-glukanowa odszczepia od końca łańcucha resztę glukozy i przenosi ją na fosforan nieorganiczny. Powstaje w ten sposób glukozo-1-fosforan, a łańcuch skrobiowy skraca się o jedną cząsteczkę. Zfosforylowana, tj. uaktywniona, glukoza może w takiej postaci ulegać dalszym przemianom.

3. Wykonanie ćwiczenia

Sprzęt:

- cylinder miarowy 250 ml

- kolumny szklane 5/60, 2× 2.5/46

- lejek zwykły i do sączenia pod próżnią

- zlewki i kolbki stożkowe

- sączki

- zestaw do sączenia pod próżnią

- pH-metr

- bagietka

Materiał i odczynniki:

- bufor fosforanowy (0,8M) o pH=6,7 (250 ml)

- skrobia rozpuszczalna

- tymol (5% r-r wodny)

- octan magnezu czterowodny

- 14% r-r amoniaku( 8N )

- Dowex 50 WX 8, 20-50 mesh, zdolność wymienna 1.9 mvala/ml

- Amberlyst A-26, 0.3-1.0 mm, zdolność wymienna 1.1 mvala/ml

- 5% roztwór HCl

- 5% roztwór NaOH

- 5% roztwór KOH

- metanol

• Przygotowanie buforu fosforanowego

Do kolby miarowej na 500 ml wsypać przez suchy lejek 27.8 g NaH₂PO₄ oraz 71.7 g Na₂HPO₄·12 H₂O, po czym po dodaniu 300 ml wody destylowanej ogrzać w łaźni wodnej do rozpuszczenia soli. Następnie zawartość kolby dopełnić wodą destylowaną do kreski.

• Przygotowanie roztworu skrobi

10 g skrobi rozpuszczalnej dodać powoli do 250 ml wrzącej wody, silnie przy tym mieszając zawartość zlewki bagietką szklaną. Po rozpuszczeniu skrobi roztwór chłodzić do temperatury pokojowej.

• Przygotowanie preparatu enzymatycznego.

Około 200g cienko obranych ze skórki ziemniaków przepuścić przez sokowirówkę lub utrzeć na tarce. Otrzymany sok wlać do cylindra, dodać wody do objętości 250 ml i pozostawić na około 15 do 20 minut, do opadnięcia ziarenek skrobi. Zlany znad osadu sok stosować jako źródło enzymu.

• Otrzymywanie 1-fosforanu α-D-glukopiranozy

Do zlewki na 800 ml wlać przygotowany roztwór skrobi, sok z ziemniaków i dodać 250 ml buforu fosforanowego oraz 0.5 ml 5% roztworu tymolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Dla przerwania reakcji inkubat podgrzać do temperatury 95° C na wrzącej łaźni wodnej i utrzymać w tej temperaturze przez 3 minuty, po czym chłodzić do temperatury pokojowej. Skoagulowane białko usunąć przez sączenie na lejku z sączkiem karbowanym (ustawić dwa zestawy). Do przesączu dodać 43g czterowodnego octanu magnezu, mieszając do momentu rozpuszczenia soli, po czym za pomocą 14% roztworu amoniaku ustawić pH roztworu na 8.5. Zobojętnianie wykonać mierząc zmiany pH za pomocą pehametru i używając do mieszania mieszadła magnetycznego (zużywa się orientacyjnie około 35 ml 14% roztworu amoniaku). Wytrącony osad fosforanu amonowo-magnezowego szybko opada na dno zlewki. Roztwór sączyć na lejku Buchnera. Przesącz poddać chromatografii kolumnowej na wymieniaczach jonowych. Po przepuszczeniu przesączu przez kationit, wyciek należy jak najszybciej przenieść na kolumnę anionitową ze względu na dużą labilność otrzymanego fosforanu
w środowisku kwaśnym.

• Przygotowanie kolumny kationitowej.

Przez kolumnę zawierającą 400ml kationitu przepuścić 1,5 dm³ 5% HCl w ciągu 45 minut,
a następnie przez około 1 godzinę przemywać kolumnę 3 dm³ wody destylowanej. Kiedy wyciek osiągnie pH~5.5 przez kolumnę przepuścić mieszaninę inkubacyjną z prędkością 50ml/min. Po naniesieniu całego roztworu, kolumnę przemyć 300 ml wody destylowanej utrzymując tą samą szybkość przepływu. Po wprowadzeniu inkubatu na kolumnę zacząć kontrolować pH wycieku. Gdy pH osiągnie wartość około 2.5 zacząć zbierać wyciek
w zlewkach w ilości po 50 ml. Wyciek kierować do przerobu na kolumnie anionitowej A-I.

• Przygotowanie kolumn anionitowych

Kolumnę anionitową, zawierającą 50ml anionitu, przemyć 1 godzinę 500 ml 5% NaOH,
a następnie przez 1 godzinę 2 dm³ wody destylowanej. Na tak przygotowana kolumnę wprowadzić wyciek z kolumny kationitowej, który przepuszcza się z szybkością 600 ml/godzinę, po czym z tą samą szybkością myć kolumnę wodą destylowaną dla usunięcia resztek skrobi. 1-Fosforan α-D-glukopiranozy wymyć z kolumny 200 ml 5% KOH. Należy zebrać 4 frakcje po 50 ml, które następnie rozcieńczyć metanolem w stosunku 3:1 (metanol:frakcja) i pozostawić w lodówce do wykrystalizowania fosforanu.

Otrzymane kryształy, które są dihydratem soli dipotasowej 1-fosforanu α -Dglukopiranozy, sączyć na lejku Buchnera. Otrzymany fosforan wysuszyć. Po wysuszeniu zważyć produkt celem określenia wydajności procesu.

[1] J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, PWN, Warszawa 2005

5

---