Budowa białek
Białka powstają w wyniku polikondensacji-L-aminokwasów. Reakcja ta zachodzi przy udziale wyspecjalizowanych kompleksów enzymatycznych - rybosomów, we wszystkich komórkach organizmów żywych i jest określana mianem translacji.
Na podstawie kodu genetycznego są syntetyzowane polipeptydy o ściśle określonej sekwencji aminokwasów. W zależności od liczby aminokwasów, można wyróżnić dipeptydy, tripeptydy itd. Dla peptydów utworzonych z kilku do kilkunastu aminokwasów stosuje się ogólną nazwę - oligopeptydy, natomiast dla cząsteczek zbudowanych z kilkudziesięciu (do ok. 100) aminokwasów - polipeptydy. Białka to związki wielkocząsteczkowe (makromolekularne), których pojedyncze łańcuchy polipeptydowe mogą dochodzić do ponad 1000 cząsteczek aminokwasów.
Duże białka mogą zawierać kilka takich łańcuchów, a w przypadku białek złożonych - także elementy niebiałkowe (np.: reszty cukrowe, lipidowe lub jony metali). Peptydy są amidami utworzonymi w wyniku rekcji grup aminowych z grupami karboksylowymi aminokwasów, wiązanie chemiczne występujące w tych związkach jest określone mianem wiązania peptydowego. Wyróżniono dwa końce cząsteczki:
N-terminalny, ze względu na wolną grupę aminową (+H3N-), zapisywaną z lewej, oraz C-terminalną oznaczającą grupę karboksylową ( -COO- ), którą zapisuję się z prawej strony cząsteczki. Oba końce cząsteczki są reaktywne. Ułożenie poszczególnych aminokwasów w łańcuchu zapisuje się, stosując skróty trzy-, lub jednoliterowe. Wzór cząsteczki peptydu można zatem sobie wyobrazić jako łańcuch szeregowo ułożonych wiązań peptydowych, porozdzielanych "węzłami" atomów węgla, od których odchodzą boczne łańcuchy - reszty aminokwasowe
Właśnie te boczne odgałęzienia reszt aminokwasowych, dzięki swej różnorodności chemicznej decydują o reaktywności, kształcie i funkcji cząsteczki polipeptydu. Rodzaj i wzajemne powiązania aminokwasów wchodzących w skład łańcucha polipeptydowego decydują o charakterze, funkcji i właściwościach fizyko-chemicznych cząsteczki. Skomplikowaną
budowę białek opisuje się stosując umownie 4 poziomy organizacji strukturalnej cząsteczki, określane "rzędowością".
Oddziaływania reszt aminokwasowych pomiędzy sobą implikują powstanie struktur drugo-, trzecio- , a nawet czwartorzędowych - w przypadku białek składających się z kilku łańcuchów polipeptydowych. Długi łańcuch polipeptydowy
nie może występować w roztworze, w formie całkowicie rozciągniętej - ulega on pofałdowaniu. Proces fałdowania białek (ang. folding), czyli tworzenia struktur wyższego rzędu odgrywa ogromną rolę, gdyż przestrzenne ułożenie łańcucha polipeptydowego (jego konformacja) decyduje w znacznej mierze o funkcji białka w organizmie. Fałdowanie łańcucha polipeptydowego może zachodzić spontanicznie, natomiast w większości przypadków odbywa się przy udziale wyspecjalizowanych białek - czaperonów. Konformacja, w jakiej białko występuje i funkcjonuje w organizmie nosi nazwę konformacji natywnej. Proces, w którym zostaje zniszczona konformacja przestrzenna białka nazywamy denaturacją. Większość środków denaturujących uszkadza bezpowrotnie struktury wyższego rzędu, przy zachowaniu struktury pierwszorzędowej.
1. Struktura pierwszorzędowa - czyli najniższy poziom organizacji strukturalnej cząsteczki jest wyznaczona przez sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Jest ona uwarunkowana jeszcze zanim zostanie zsyntetyzowany łańcuch polipeptydowy, gdyż informacja o kolejności aminokwasów w cząsteczce białka jest zakodowana w DNA, w postaci sekwencji nukleotydowej. Dzięki procesom transkrypcji, a później translacji sekwencja nukleotydowa zostaje odczytana w trakcie syntezy odpowiedniego polipeptydu.
2. Struktura drugorzędowa - są to typy regularnego ułożenia głównego łańcucha polipeptydowego stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Struktura drugorzędowa jest uwarunkowana przede wszystkim właściwościami wiązania peptydowego. Jego rzeczywista struktura jest pośrednia pomiędzy dwoma formami ,
Konformacja głównego łańcucha jest w pełni określona, gdy dla każdej reszty aminokwasowej ustalono wartości kątów i . Reszta aminokwasowa w łańcuchu polipeptydowym nie może przyjmować dowolnej pary wartości i , gdyż pewne kombinacje tych wartości są całkowicie niemożliwe ze względu na zawadę przestrzenną pomiędzy grupami funkcyjnymi sąsiadujących aminokwasów. Odkryto dwa podstawowe, regularne układy drugorzędowe występujące powszechnie w strukturze białek. Są to struktury -helisy
i -harmonijki.
a.) Struktura -helisy, odkryta jako pierwsza, ma kształt cylindra. Ciasno spleciony łańcuch główny polipeptydu tworzy centralną część cylindra, natomiast boczne łańcuchy reszt aminokwasowych wystają na zewnątrz w ułożeniu helikalnym.
Helisa, podobnie jak każda śruba może być zarówno prawo, jak i lewoskrętna. W białkach występuje głównie struktura helisy prawoskrętnej. -Helisa charakteryzuje się także polarnością. Jej budowa sugeruje, że jest dipolem - wewnętrzny niepolarny rdzeń oraz polarne reszty aminokwasowe wystawione na zewnątrz cząsteczki.
b.) Struktura -harmonijki ( -kartki) - W odróżnieniu od cylindrycznej struktury
-helisy, cząsteczka polipeptydu przyjmuje kształt, prawie całkowicie rozciągnięty.
W uformowaniu struktury -harmonijki, może brać udział więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy. Odległość sąsiednich aminokwasów wzdłuż osi cząsteczki wynosi 0,35 nm (w -helisie - 0,15 nm). Harmonijkę stabilizują wiązania wodorowe pomiędzy grupami CO i NH, leżącymi w jednej płaszczyźnie obok siebie
i niekoniecznie pochodzących ze wspólnego łańcucha polipeptydowego.
c.) Istnieje także struktura trójniciowej helisy, występującej wyłącznie w białku powszechnie występującym u ssaków - kolagenie. Struktura ta składa się z trzech łańcuchów polipeptydowych o bardzo regularnej strukturze aminokwasowej. Często powtarzająca się sekwencja: glicyna-prolina-hydroksyprolina (nietypowy aminokwas) (zobacz i prorównaj: aminokwasy) warunkuje powstawanie struktury drugorzędowej.
d.)Motywy strukturalne, powstają wskutek asocjacji helis lub struktur, pełniąc kluczową rolę w procesie fałdowania się białka. Powodem, dla którego zachodzi to zjawisko, jest dążenie tych struktur do minimalizacji ekspozycji reszt hydrofobowych w kierunku wody, a także konieczność tworzenia wiązań wodorowych pomiędzy grupami hydrofilowymi (polarnymi) w celu stabilizacji struktur, kosztem dogodnego energetycznie oddziaływania z polarnym rozpuszczalnikiem - wodą. Najbardziej powszechnie występującym motywem , wśród białek jest motyw "szpilki do włosów" (ang. harpin loop). Ten motyw jest zbudowany z jednego łańcucha polipeptydowego, przyjmującego antyrównoległą strukturę typu -harmonijki. Struktura taka tworzy się dzięki tworzeniu się wiązań wodorowych pomiędzy grupą -CO reszty n aminokwasu, a grupą -NH reszty n + 3 aminokwasowej, powodując natychmiastowe odwrócenie się kierunku łańcucha i ułożenie antyrównoległe struktury -harmonijki.
3. Struktura trzeciorzędowa powstaje w wyniku oddziaływania poszczególnych reszt aminokwasowych pomiędzy sobą. Oprócz wiązań wodorowych
mogą zostać utworzone tzw. "mostki solne" - w reakcji pomiędzy grupami funkcyjnymi pochodzącymi od aminokwasów kwaśnych (Np.: kwas glutaminowy) i zasadowych (Np.: arginina). Bardzo charakterystycznym przykładem wiązań stabilizujących trzeciorzędową strukturę białek są tzw. "mostki dwusiarczkowi, powstające pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi (zobacz i porównaj: aminokwasy). Innymi możliwymi interakcjami pomiędzy grupami aminokwasowymi są oddziaływania apolarnych reszt będące przykładem oddziaływania tzw. sił van der Waalsa. Są to oddziaływania pomiędzy aminokwasami zawierającymi silnie hydrofobowe grupy funkcyjne.
Struktura czwartorzędowa jest charakterystyczna dla białek oligomerycznych. (zawierających kilka podjednostek). Podjednostki białek są to niezależnie sfałdowane łańcuchy polipeptydowe lub całe białka, będące tylko składnikiem dużego kompleksu białkowego. Podobny zestaw oddziaływań reszt aminokwasowych pomiędzy sobą
oraz z rozpuszczalnikiem jest charakterystyczny dla czynników stabilizujących strukturę czwartorzędową białek oligomerycznych. Często się zdarza, że powierzchnie styku poszczególnych podjednostek oligomeru zawierają dużą ilość aminokwasów hydrofobowych. Efektem tego jest "sklejenie" podjednostek i "uszczelnienie" przed wniknięciem rozpuszczalnika. Rozbicie podjednostek oznacza destabilizację dalszych struktur, gdyż jest to wysoce niekorzystne energetycznie ponieważ zachodzi kontakt
z polarnym rozpuszczalnikiem. Struktura czwartorzędowa staje się szczególnie trwała gdy podjednostki wiążą się "mostkami" dwusiarczkowymi lub solnymi.
Tworzenie nowych białek polega na składaniu genów kodujących struktury już istniejące. Utworzenie w pełni funkcjonalnego białka odbywa się w trakcie modyfikacji potranslacyjnej, w której są dodawane inne, niebiałkowe elementy struktury. W tym procesie formowany jest ostateczny kształt białka w wyniku jego przebudowy. Wszystkie te czynności nie przebiegają spontanicznie i są przeprowadzane dzięki wyspecjalizowanym enzymom. Jako przykład mogą posłużyć specyficzne białka - czaperony ("białka opiekuńcze"), które kontrolują proces właściwego fałdowania się łańcucha polipeptydowego.
Narzędzia |
Charakterystyka |
Przydatność |
Polimerazya |
enzymy uczestniczące w procesie replikacji DNA w komórkach |
pomnażanie ilości DNA (metoda PCR — reakcji łańcuchowej polimerazy) |
Enzymy restrykcyjne i ligazy |
enzymy funkcjonujące w komórkach w procesach naprawy DNA i podczas replikacji |
nacinanie nici DNA, jej rozcinanie na części (np. w celu wyizolowania genu), łączenie nici DNA (np. w celu zmodyfikowania wektora) |
Wektory |
odpowiednio spreparowane(zmodyfikowane) wirusy lub plazmidy, a także sztuczne chromosomy |
można do nich wbudować obcy DNA, a wektor wprowadzić do komórki gospodarza, gdzie ulegnie ekspresji, powieleniu lub wbuduje się do jej genomu |
cDNA |
dwuniciowy DNA otrzymany z RNAb za pomocą odwrotnej transkryptazy |
poszukiwanie genów kodujących znalezione w komórce białko; tworzenie genów eukariotycznych wolnych od intronów |
Banki genów |
zbiór cząsteczek zawierających różne fragmenty DNA (np. geny) |
identyfikacja wyizolowanych fragmentów DNA (np. przez sprawdzenie, z którą cząsteczką z banku najłatwiej ulegają hybrydyzacji) |
a Szczególnie często jest stosowana tzw. polimeraza taq (z Thermus aquaticus), wytrzymująca temperaturę 95oC; |
||
RESTRYKTAZY - tną DNA tworząc powtarzalny komplet fragmentów.
Restryktazy (inaczej enzymy restrykcyjne , endonukleazy restrykcyjne) - to enzymy izolowane z bakterii , zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA (z reguły są to sekwencje palindromowe) i do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w ściśle określonym miejscu , w obrębie lub okolicy sekwencji rozpoznawanej. Otrzymywane fragmenty DNA nie są losowe a w każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Z reguły różne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA. Istnieją jednak wyjątki - tzw. izoschizomery - enzymy izolowane z różnych organizmów ale rozpoznające te same sekwencje. Zdarza się także , że dwa enzymy wytwarzają takie same lepkie końce , mimo rozpoznawania różnych sekwencji DNA. Umożliwia to klonowanie DNA strawionego jednym enzymem w wektorze strawionym innym , dającym takie same lepkie końce.
Podział restryktaz według rodzaju wytwarzanych końców :
tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu
lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie , komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA , co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.
Podział restryktaz według rodzaju wytwarzanych końców :
tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu
lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie , komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA , co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.
Modyfikacje końców :
tępych , poprzez dołączenie adaptorów (krótkich fragmentów DNA zakończonych z jednej strony na tępo z drugiej na lepko , specyficznie dla danej restryktazy) lub linkerów (krótkich fragmentów DNA zawierających określone miejsce restrykcyjne , zakończonych na tępo) , przed dołączeniem tych ostatnich należy zmetylować genomowy DNA odpowiednią metylazą a po ligacji strawić DNA daną restryktazą uzyskując lepkie końce
lepkich , które mają cofniętą nić 3` Można je wypełnić przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy DNA E.coli i kompletu nukleotydów.
lepkich , które mają cofniętą nić 5` Można je wytępić obcinając wysunięty jednoniciowy odcinek DNA przy użyciu nukleazy S1 lub polimerazy I E.coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną 3`(R)5`.
Podział restryktaz według sekwencji rozpoznawanej :
czwórkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo - co 256 bp. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki.
szóstkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu nukleotydów. Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 bp w DNA , w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu , dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie.
ósemkowe , stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.
Zastosowania :
Konstrukcja map restrykcyjnych. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi , stosowanymi pojedynczo , w kombinacjach oraz w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu , można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA , na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach.
Wyróżnia się następujące typy enzymów restrykcyjnych:
Typ I
wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawierające aktywności metylazy i restryktazy. Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, w bliżej nieokreślonym miejscu. Z tego powodu nie mają większego zastosowania praktycznego.
Typ II
przecinają DNA w zdefiniowanym miejscu, w obszarze rozpoznawanej sekwencji lub w jej pobliżu. Składają się z pojedynczych polipeptydów. Rozpoznają sekwencje symetryczne.
Typ IIs
zbliżone do typu II, przecinają z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która jest asymetryczna.
Typ III
duże kompleksy, które wymagają dwóch sekwencji rozpoznawanych w pobliżu siebie. Bez znaczenia praktycznego.
Typ IV
zbliżone do typu II. Zawierają aktywność metylazy i restryktazy w tym samym polipeptydzie. Przecinają DNA w zdefiniowanym obszarze poza sekwencją rozpoznawania. Aktywności metylazy i restryktazy nie mogą działać równocześnie. Enzym "przełącza" się w zależności od substratu.
Pierwszym wyizolowanym enzymem restrykcyjnym był enzym EcoR I. Wyizolowany został z bakterii Escherichia coli szczepu RY13. EcoR I rozpoznaje następującą sekwencją DNA:
Plazmid pBR 322 jest wektorem bakteryjnym, czyli cząsteczką DNA mającą zdolność niezależnej od chromosomów replikacji w danym typie komórki, a równocześnie przenoszenia fragmentów obcego DNA "z zapewnieniem" - ich powielenia w tych komórkach i najczęściej wydatnej ekspresji zawartych w nich genów. Składa się z 4362 par nukleotydów.
Jego zasadniczymi komponentami są:
sekwencja ori (origin) - ponieważ pochodzi ona z naturalnie występującego plazmidu Col E1, zapewnia inicjację replikacji pBR 322 tylko w komorkach E. Coli,
oraz 2 geny markerowe:
amp' warunkujący oporność na ampicylinę,
tet' warunkujący oporność na tetracyklinę .
Jeżeli chodzi o miejsca restrykcyjne tego plazmidu jest ich dużo - bardzo ładna mapa restrykcyjna jest np. na str 165 "Genetyki molekularnej" Piotra Węgleńskiego ( PWN, Warszawa 1996 ).
Ograniczając się tylko do niektórych spośród "pojedynczych" - tzn. "utworzonych" przez restryktazy tnące pBR 322 tylko w jednym miejscu:
dla restryktazy EcoR I - takie miejsce znajduje się "na poziomie" 4284 nukleotydu, dla Cla I - 23-go, dla BamH I - 375, dla Sal I - 651, dla Pst I - 3607...
Natomiast zastosowanie pBR 322 wygląda następująco:
- przecięcie tego plazmidu w jednym z miejsc restrykcyjnych, przez odpowiednią restryktazę, umożliwia włączenie do niego fragmentu DNA. Odbywa się to przy udziale ligazy DNA mogącej połączyć ze sobą, za pomocą wiązań fosfodiestrowych, dowolne cząsteczki DNA.
- wprowadzenie (na drodze transformacji) tak zrekombinowanego wektora do komorek E. Coli wrażliwych na tetracyklinę i ampicylinę, umożliwia ekspresję w nich genów, zawartych w "dołączonym" do wektora DNA.
Plazmid Ti (pTi z ang. tumor inducing plasmid - dosł. plazmid indukujący guza) - jest to plazmid bakteryjny Agrobacterium tumefaciens. Plazmid ten jest często wykorzystywany w inżynierii genetycznej oraz w biotechnologii roślinnej do uzyskiwania organizmów transgenicznych.
Budowa kwasów nukleinowych
Kwasy nukleinowe występują w postaci jedno- lub dwuniciowych makrocząsteczek. Zarówno jedno- jak i dwuniciowe cząsteczki charakteryzują się wieloma wspólnymi cechami. Nić łańcucha polinukleotydowego to liniowy układ nukleozydów, połączonych ze sobą wiązaniami fosfodiestowymi pomiędzy 5' a 3' atomami węgla sąsiadujących reszt cukrowych.
W nukleotydach występuje preferencja do tworzenia wiązania N-glikozydowego typu anty.
Pojedynczy łańcuch polinukleotydowy składa się z rdzenia zbudowanego z reszt pentozofuranozowych połączonych "mostkami" fosfodiestrowymi oraz z zasad azotowychsterczących na boki od rdzenia.
Wokół wiązania fosfodiestrowego może zachodzić rotacja jednoniciowej cząsteczki. Poszczególne "cegiełki" łańcucha różnią się od siebie zasadami azotowymi (Adenina, Tymina, Uracyl, Guanina i Cytozyna). Ze względu na liniową budowę łańcucha kwasu nukleinowego można wyróżnić jego 5' i 3' koniec.
Silne oddziaływania z rozpuszczalnikiem (wodą) sprawiają, że pojedyncze łańcuchy kwasu polinukleinowego tworzą bardziej złożone struktury. Poszczególne stopnie komplikacji konfiguracji przestrzennej kwasów nukleinowych zostały określone mianem ich rzędowości.
1. Kolejność (sekwencja) ułożenia zasad azotowych w łańcuchu kwasu nukleinowego determinuje strukturę pierwszorzędową. Dalsze struktury (drugo- i trzeciorzędowe) określają kształt przestrzenny makrocząsteczki.
2. Struktura drugorzędowa
Najważniejszym czynnikiem stabilizującym strukturę drugorzędową jest komplementarność zasad, czyli ich zdolność łączenia się w pary. Pary zasad są to takie kompleksy, w których zasada purynowa z jednego łańcucha cząsteczki łączy się z pirymidynową, z drugiego łańcucha, za pośrednictwem wiązań wodorowych. Adenina łączy się z tyminą lub uracylem za pomocą dwóch wiązań wodorowych, guanina zaś z cytozyną za pomocą trzech. Odpowiadające wzajemnie zasady azotowe nazywa się komplementarnymi. W dwuniciowej cząsteczce pierścienie par zasad azotowych leżą zasadniczo w jednej płaszczyźnie.
Oddziaływania tego rodzaju są możliwe w przypadku, gdy pewien fragment nici polinukleotydowej ustawi się dostatecznie blisko, równolegle i co najważniejsze przeciwbieżnie do drugiego odcinka, a odpowiednie zasady azotowe będą miały naprzeciwko siebie swojego komplementarnego partnera. Struktura taka jest tym stabilniejsza (w danych warunkach środowiska) im więcej par zasad
komplementuje (łączy się) ze sobą. Wiązania wodorowe są wiązaniami słabymi, lecz ich ilość na przestrzeni długiej makrocząsteczki powoduje, że oddziaływanie obu nici jest bardzo silne. Taka dwuniciowa cząsteczka przyjmuje szczególną konformację uwarunkowaną dodatkowymi oddziaływaniami z roztworem (środowiskiem). Obie nici są owinięte śrubowo wokół siebie tworząc strukturę helisy.
Pary zasad azotowych są hydrofobowe i znajdują się w środku heliksu, reszty cukrowe oraz fosforanowe tworzą hydrofilową "osłonkę" zewnętrzną.
3. Struktura trzeciorzędowa kwasów nukleinowych występuje w przypadku fałdowania się dwuniciowych odcinków cząsteczki. Może tworzyć struktury,
które odgrywają ważną rolę w procesie regulacji ekspresji informacji genetycznej. Np.: struktura "szpilki do włosów" - terminacja transkrypcji.
1. Budowa DNA
DNA - jest to angielski skrót od nazwy makrocząsteczki kwasu nukleinowego - deoxyribonucleic acid - po polsku kwas deoksyrybonukleinowy. Zbudowany jest z czterech rodzajów nukleozydów: deoksyadenozyny (dAMP), deoksyguanozyny (dGMP), deoksycytydyny (dCMP) oraz deoksytymidyny (dTMP). Cukrem występującym w tych deoksyrybonukleotydach jest deoksyryboza. Przedrostek deoksy- oznacza brak jednego z atomów tlenu zawartych w cząsteczce wyjściowej - rybozie. DNA występuje najczęściej w postaci dwuniciowej (dsDNA) i ma kształt helisy. Złożona jest z dwóch przeciwbieżnych i komplementarnych do siebie łańcuchów kwasu deoksyrybonukleinowego, skręconych wzdłuż osi helisy. Zasady purynowe i pirymidynowe znajdują się wewnątrz, a fosforany i reszty deoksyrybozy - na zewnątrz helisy. Płaszczyzny ułożenia pierścieni zasad są prostopadłe do osi helisy, natomiast płaszczyzny pierścieni cukrów są ułożone prostopadłe względem zasad. Dwa łańcuchy DNA łączą się sobą wiązaniami wodorowymi pomiędzy zasadami azotowymi, tworząc komplementarne pary.
Postać DNA w organizmie
W organizmach, DNA rzadko występuje w postaci liniowych odcinków o wolnych końcach. U organizmów prokariotycznych chromosomowy, a także plazmidowy DNA, występuje w postaci kolistej. W komórkach eukariotycznych chromosomowy DNA jest zorganizowany w postaci domen w kształcie pętli, których podstawy są unieruchomione przez białka wchodzące w skład chromosomu. Cząsteczka DNA, pod wpływem powstających w niej, wewnętrznych napięć torsyjnych może ulegać dodatkowemu zwinięciu. Napięcia są spowodowane rozluźnieniem lub kondensacją struktury helisy i brakiem możliwości neutralizacji przez obrót wokół wolnych końców, wokół osi podłużnej helisy. W długich cząsteczkach DNA napięcia powstają w wyniku lokalnych procesów związanych z naprawą, replikacją [1] lub transkrypcją. Przy tych procesach następuje rozplecenie helisy, w wyniku czego po obu stronach miejsca rozplecenia następuje kondensacja struktury heliksu. Kondensacja wywołuje dążenie DNA do neutralizacji napięć wewnętrznych, przez miejscowe zwinięcie cząsteczki.
Superskręcenie cząsteczek jest właściwością topologiczną, którą można opisać posługując się terminami z dziedziny topologii. Za topologiczną przyjmuje się taką właściwość DNA, która nie ulega zmianie pod wpływem odkształceń ciągłych - zachowujących integralność szkieletu cząsteczki. Będą to takie odkształcenia konformacyjne, które powstają w wyniku łączenia się cząsteczki z białkami, lub innymi ligandami, a także powstające w wyniku działania ciepła. Przecięcie jednej z nici DNA - a więc zakłócenie szkieletu, spowoduje zmianę właściwości topologicznej. Kolista cząsteczka superhelikalna jest opisana dwoma parametrami. Tw, czyli liczba skrętów opisuje ile razy kolisty DNA został skręcony wokół osi helisy. Parametr ten przyjmuję wartość ujemną, gdy w stosunku do formy zrelaksowanej (naturalnej) cząsteczka jest rozkręcona, gdy natomiast DNA ulega skręceniu - dodatnią. Wr, czyli liczba zwojów - opisuje, ile razy kolista cząsteczka DNA krzyżuje się ze sobą. Wprowadzenie trzech dodatkowych skrętów (stworzenie napięć torsyjnych) powoduj, że wartość Tw = 3, przy założeniu, że cząsteczka leży płasko i nie krzyżuje się ze sobą Wr = 0.
RNA - (ang. ribonucleic acid) Struktura kwasu rybonukleinowego różni się
od DNA. Jednostką cukrową w RNA jest ryboza, a nie deoksyryboza jak w przypadku DNA. Kwas rybonukleinowy, zatem, zbudowany jest z czterech rodzajów nukleozydów: adenozyny (AMP), guanozyny (GMP), cytydyny (CMP) oraz uracylu (UMP). Istotną różnicą jest to, że jedną z czterech zasad jest uracyl zamiast tyminy. Uracyl paruje komplementarnie z adeniną, tworząc dwa wiązania wodorowe, różniąc się od tyminy występowaniem grupy metylowej. Cząsteczki RNA występują w formie jedno- i dwuniciowej. Cząsteczki dwuniciowego RNA (dsRNA) nie mogą tworzyć tak regularnej struktury jak w przypadku B-DNA, ze względu na występowanie grupy hydroksylowej przy 2 atomie węgla rybozy.
Rodzaje RNA
Wyróżnia się kilka rodzajów RNA. DNA zawiera w sobie informację o każdym z rodzajów RNA (z pominięciem wirusów). W procesie transkrypcji (syntezy RNA) są tworzone prekursory poszczególnych klas RNA (preRNA), które ulegają później obróbkom potranskrypcyjnym. Istnieją trzy podstawowe grupy RNA - informacyjny RNA (mRNA), transportujący RNA (tRNA) oraz rybosomalny (rRNA), wszystkie wiążą się z procesem ekspresji informacji genetycznej.
a.) mRNA - (ang. messenger RNA) - jest pojedynczą cząsteczką RNA (ssRNA), która jest nośnikiem informacji genetycznej, zawartej w postaci sekwencji zasad azotowych w cząsteczce. Na jej podstawie polimeryzowane są aminokwasy wg określonej kolejności - dzięki temu procesowi powstaje produkt końcowy ekspresji informacji genetycznej - białko. Bezpośredni produkt transkrypcji - prekursorowy RNA ("pierwotny transkrypt") podlega późniejszym obróbkom potranskrypcyjnym. Szczególnie w przypadku organizmów Eukariotycznych (jądrowych) w procesie splicingu, (wycinania intronów) są wycinane niekodujące części RNA oraz dołączane elementy stabilizujące - od końca 5' "czapeczkę" (ang. cap - będącą zmodyfikowanym nukleotydem guanylowym) oraz na 3' końcu - "ogon poli-(A)" zawierający 200-250 nukleotydów adenylowych. Taka operacja zapobiega degradacji mRNA przez enzymy tnące łańcuch kwasu rybonukleinowego - RNA-zy.
b.) tRNA - zwany transferowym RNA, związany z enzymem - syntetazą aminoacylo-tRNA, służy do odczytywania kodu genetycznego i transportu odpowiednich aminokwasów do - rybosomu, w trakcie procesu translacji. Cząsteczki tRNA zbudowane są z ok. 75 nukleotydów, podobnie jak mRNA wytwarzane są one w wyniku obróbki cząsteczki pierwotnego transkryptu. W skład cząsteczki wchodzą również zmodyfikowane zasady azotowe (np.: dihydrourydyna, pseudourydyna). W każdej komórce znajduje się przynajmniej 20 rodzajów cząsteczek tRNA i przynajmniej jedna odpowiada swoistemu aminokwasowi. Cząsteczki tRNA posiadają cztery dwuniciowe obszary pozwalające wytworzyć drugorzędową strukturę podobną do liścia koniczyny. W cząsteczce tRNA można wyróżnić 4 główne ramiona. Ramię akceptorowe składa się z szypuły utworzonej ze sparowanych zasad, które kończy się sekwencją CCA (5'-3'). Grupa 3'-hydroksylowa reszty adenylowej wiąże się z grupą karboksylową odpowiednich dla danej cząsteczki tRNA aminokwasów wiązaniem estrowym. Pozostałe ramiona posiadają szypuły ze sparowanych zasad i na końcu pętle zawierające zasady niesparowane. Pętla ramienia antykodonowego posiada sekwencję antykodonową, decydującą o specyficzności cząsteczki tRNA w procesie translacji. Sekwencja antykodonowa rozpoznaje komplementarny tryplet nukleotydów tworzących kodon, na cząsteczce mRNA - w taki sposób następuje odczyt informacji genetycznej. Ramiona DHU i T C zostały nazwane od sekwencji, w których występują nietypowe nukleotydy wchodzących w skład ich końcowych pętli.
c.) rRNA , czyli rybosomalne RNA - to grupa kwasów rybonukleinowych wchodzących w skład rybosomu, a więc kompleksu enzymatycznego odpowiedzialnego za syntezę polipeptydu - translację. Odkryto kilka klas rRNA, które w większości przypadków przyjmują złożoną strukturę drugorzędową łącząc się z polipeptydami wchodzącymi w skład poszczególnych podjednostek rybosomu. Przykładem może posłużyć 16S rRNA, które rozpoznaje miejsce "start" w cząsteczce mRNA, natomiast 23S rRNA oddziałuje z ramieniem akceptorowym cząsteczki tRNA. Inne cząsteczki L7 i L12 rRNA, wchodzące w skład rybosomu posiadają zdolności autokatalityczne - mogą prowadzić reakcje enzymatyczne nawet bez udziału innych białek oraz rRNA rybosomu.
Właściwości fizyko-chemiczne kwasów nukleinowych
Kwasy nukleinowe rozpuszczają się w wodzie w środowisku zasadowym i obojętnym, natomiast ulegają wytrąceniu z roztworu w środowisku kwaśnym (poniżej wartości pH=5). Powyżej wartości pH=7 ich makrocząsteczki obdarzone są silnym ładunkiem ujemnym, na skutek całkowitej dysocjacji reszt fos foranowych. W polu elektrycznym (elektroforezie) migrują w kierunku elektrody dodatniej. Zniszczenie struktury drugorzędowej (denaturacja) zachodzi podczas działania wysokiej temperatury, działaniu mocnych kwasów i z asad oraz rozpuszczalników organicznych. Denaturację wywołują także inne substancje, takie jak mocznik, formamid, czy formaldehyd. Termiczna denaturacja w przebiega skokowo i jest uzależniona od stosunku par G-C do A-T(U) (związane jest to z różnicą w ilością wiązań wodorowych pomiędzy zasadami komplementarnymi). Temperatura ta jest charakterystyczna dla cząsteczek dwuniciowych - w szczególności DNA i jest określana mianem temperat ury topnienia. Stopniowe obniżanie temperatury prowadzi do renaturacji - odtworzenia struktury dwuniciowej. Całkowita hydroliza (rozpad pod wpływem wody) kwasów nukleinowych zachodzi w środowisku silnie kwaśnym, przy czym hydroliza RNA jest również możliw a w środowisku zasadowym.
Klonowanie jest to technika, która służy do powielania fragmentów DNA, które dają się wyizolować w bardzo małych ilościach. Fragment obcego DNA, który zostaje wprowadzony do komórki gospodarza z wektorem i ulega replikacji a więc namnaża się wraz z komórkami swojego gospodarza. Metody te są wykorzystywane do uzyskiwania zwielokrotnionej liczby genetycznie identycznych komórek, zarodków lub organizmów roślinnych czy zwierzęcych i nazwane są klonowaniem. Są to również metody otrzymywania identycznych kopii genów i konstrukcji genowych. Najlepiej opracowane jest klonowanie drobnoustrojów i jest ono równoznaczne z klonowaniem komórek. Polega ono ma namnażaniu przez podziały mitotyczne specjalnie wybranych komórek bakteryjnych w odpowiednich pożywkach.
Obecnie stosowane metody klonowania obejmują:
Metoda podziału bliźniaczego, czyli podział wczesnego embrionu, w wyniku którego powstają dwa embriony identyczne genetycznie. Polega ona na mikrochirurgicznym przecięciu zarodka, gdy znajduje się on w stadium od dwóch do ośmiu komórek. Na początku rozwoju embrionalnego komórki posiadają zdolności multipotencjalne, to znaczy, że mogą przejmować i zastępować funkcje brakujących komórek, włącznie z odbudowaniem brakujących. W ten sposób można otrzymać jednojajowe bliźniaki, które posiadają identyczną strukturę białkową oraz te same cechy dziedziczenia. W tym przypadku bliźnięta są dla siebie klonami
Metoda izolacji blastomerów, czyli wyizolowywanie komórek embrionu dających początek nowym organizmom. Ta technika klonowania zarodków zwierzęcych została opracowana pod koniec lat 70. XX wieku. Przy jej wykorzystaniu uzyskiwano bliźnięta, trojaczki, a nawet czasami czworaczki i pięcioraczki. Mimo możliwości uzyskania identycznych genetycznie wieloraczków, metoda ta nie zyskała jednak praktycznego znaczenia i nie wyszła poza stadium eksperymentalne.
Metoda agregacji blastomerów, czyli wyizolowywanie komórek embrionu i umieszczanie ich w otoczeniu blastomerów pochodzących z innych osobników.
Metoda transferu jąder komórkowych, czyli umieszczenie w niezapłodnionej komórce jajowej jądra komórkowego pochodzącego:
z embrionu
z komórki ciała dorosłego osobnika
Odbywa się ten proces w następujących fazach:
przygotowanie jądra komórki somatycznej, które będzie sterowało rozwojem komórki jajowej
przygotowanie komórki jajowej - wypreparowanie jądra komórkowego
wszczepienie jądra komórki somatycznej w miejsce jądra komórki jajowej (rozpoczyna się rozwój powstałej w ten sposób zygoty);
przeniesienie embrionu do narządów rodnych
Jest to metoda pozwalająca na uzyskanie u ssaków klonów liczących znacznie więcej osobników, niż przy wykorzystaniu poprzednich metod. Polega na przeszczepieniu jąder komórek zarodkowych, w którym wykorzystano jądra komórek somatycznych do dojrzałego oocytu, rzadziej zygoty, wcześniej poddanych zabiegowi usunięcia własnego materiału genetycznego. Innym wariantem klonowania, na drodze transplantacji jąder komórkowych, jest klonowanie z zastosowaniem pierwotnych komórek zarodkowych. Jest to metoda, która, przynajmniej teoretycznie,
WEKTORY EKSPRESYJNE :
Zawierają odpowiednio usytuowany silny promotor umożliwiający ekspresję na wysokim poziomie białka , którego gen znajduje się na tym wektorze.
1. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawierające silne , regulowane promotory. Taki silny , regulowany promotor powoduje , że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę. Przykładem może być promotor laktozowy. Transkrypcję wzmaga się przez dodanie do pożywki IPTG (analog laktozy).
2. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawierające promotor późnych białek faga T7. Promotor genu RNA polimerazy faga T7 to specyficzna sekwencja 23 bp. System ten jest dość skomplikowany. Składa się z dwóch elementów. W zrekombinowanych komórkach E.coli , zawierających gen kodujący T7 RNA polimerazę wstawiony za promotorem laktozowym zachodzi synteza dużej ilości RNA polimerazy gdy do pożywki dodane jest IPTG. Komórki te są transformowane wektorem plazmidowym , który niesie kopię promotora T7 i cDNA genu kodującego wybrane białko. RNA polimeraza wiąże się z promotorem T7 na wektorze plazmidowym co katalizuje transkrypcję wstawionego cDNA.
3. Istnieją także eukariotyczne systemy ekspresyjne. Jest to szczególnie istotne gdy chcemy otrzymać aktywne białko , w którym prawidłowo zostały przeprowadzone modyfikacje posttranslacyjne.
mutageneza ukierunkowana, technika → inżynierii genetycznej prowadząca do sztucznego wywoływania → mutacji w ściśle określonym miejscu genomu; zaprogramowaną mutację określonego genu przeprowadza się stosując przynajmniej jedną z trzech podstawowych metod zmian bezpośrednich DNA: insercję, delecję lub substytucję nukleotydów; w zależności od stosowanych metod wyróżnia się mutagenezę sterowaną oligonukleotydami, kasetową, insercyjną i inne.