Biotechnologia roślin - dziedzina nauki, która wykorzystuje procesy biologiczne do uzyskiwania różnorodnych

bioproduktów w warunkach laboratoryjnych.

Obejmuje różne subdyscypliny m.in.:

- kultury tkankowe (kultury In vitro)

- techniki wykorzystujące rekombinację DNA w celu uzyskania GMO na drodze transformacji genetycznej (transgeneza)

Roślinne kultury tkankowe- kultury In vitro

Aseptyczne kultury komórek, tkanek, organów i ich części wyizolowanych z roślin macierzystych prowadzone In vitro na syntetycznych pożywkach, w ściśle określonych pod względem fizycznym i chemicznym warunkach.

Cel prowadzenia kultur In vitro:

- masowe namnażanie roślin,

- uzyskiwanie, hodowla nowych odmian,

- pozyskiwanie cennych metabolitów (kultury zawiesinowe)

- badania podstawowe

W kulturach In vitro wyróżniamy 3 gr. czynników :

1. Warunki zewnętrzne (temp., oświetlenie, wilgotność)

2. Właściwości biochemiczno-fizjologiczne i genetyczne uprawianego obiektu.

3. Czynniki odżywcze i stymulatory oraz właściwości fizyczne podłoża- POŻYWKA

I Warunki zewnętrzne (temp., oświetlenie, wilgotność)

FITOTRON- zamknięte pomieszczenie

Optymalny wzrost 20-26^oC

II Właściwości biochemiczno-fizjologiczne i genetyczne uprawianego obiektu:

- obiektami używanymi w kulturze in vitro są

EKSPLANTATY- wyizolowane fragmenty roślin umieszczone na podłożu (pożywce) o odpowiednio dobranym składzie.

NAJLEPSZE TKANKI MERYSTEMATYCZNE

Podział eksplantatów:

1. Pierwotne

2. Wtórne

Pierwotne - eksplantat pobrany z warunków zewnętrznych.

Wtórny - pasażowany, przekładany z pożywki na pożywkę.

Eksplantaty:

- mogą być to:

• Nasiona, zarodki lub ich fragmenty

• Fragmenty siewek, liścieni, korzeni, pierwszych liści,

• Organy roślinne lub ich fragmenty

• Określona tkanka

• Pojedyncze komórki

• Protoplasty

- materiał na eksplantaty dobiera się w zależności od celu pracy.

Kondycja rośliny macierzystej - źródło eksplantatów (zdrowa, młoda, żywotna, cechować się intensywnym

wzrostem i rosnąć w optymalnych dla niej a jednocześnie kontrolowanych warunkach środowiskowych)

Wybór eksplantatu:

- wiek tkanek, organów z których są one wycinane (eksplantaty z młodych organów > potencjał rozwojowy)

- lokalizacja w roślinie

- wielkość,

- termin izolacji

- orientacja na pożywce

Dezynfekcja eksplantatu:

Usunięcie drobnoustrojów zasiedlających powierzchnię materiału roślinnego (bakterie, grzyby)

Podstawowe etapy dezynfekcji:

1. Umycie pod bieżącą wodą z dodatkiem detergentu

2. Dezynfekcja powierzchniowa w warunkach sterylnych przy użyciu m.in. wodnych roztworów alkoholu

etylowego, podchlorynu wapnia Ca(OCl)₂ lub sodu NaOCl, chlorku rtęci HgCl₂ (sublimatu)

W praktyce wykorzystuje się często gotowe preparaty handlowe zawierające związki chloru, np. ACE, Chlorox,

Domestos, rzadziej chlorominę. W szczególnych przypadkach dodatkowo stosujemy fungicydy: Benlate lub

antybiotyki, np. rifampicyna, streptomycyna oraz środki zmniejszające napięcie powierzchniowe i ułatwiające

penetrację powierzchni materiału roślinnego (płyn do mycia naczyń, preparat Treen)

3. Kilkakrotne przepłukanie autoklawową wodą destylowaną celem usunięcia roztworów dezynfekujących.

Patogenne mikroorganizmy endofityczne (wirusy, bakterie, grzyby)- kolonizują całe wnętrze rosliny (patogeny

systemiczne) lub tylko określone miejsca np. zranienia (patogeny lokalne)

ZWALCZANIE:

- metody chemiczne (chemioterapia, antybiotyki, fungicydy)

- metody fizyczne (termoterapia)

Zabiegi odkażające przeprowadza się przed pobraniem eksplantantu (traktuje się całą roślinę) i powtarza po izolacji eksplantatu.

Sterylizacja nie może osłabiać lub wyniszczać eksplantatu, ponieważ powoduje to jego zamieranie lub niezdolność regeneracji.

Dobór substancji dezynfekujących, ich stężenie, czas działania i odczyn roztworu zależy od rodzaju materiału roślinnego - dóbr indywidualnych w zależności od potrzeb.

Laboratorium kultur In vitro

Szkło laboratoryjne jest sterylizowane przez ok. 20 min, w autoklawie przy 0,2MPa i temp. 134^oC

III Czynniki odżywcze i stymulatory oraz właściwości fizyczne podłoże - POŻYWKA

• Makroelementy

• Mikroelementy

• Witaminy

• Źródła węgla - cukier (sacharozę, maltoza, glukowa)

Pożywki zestalone są AGAREM lub AGAROZĄ pH=5-6

Warunki sterylizacji - AUTOKLAW; 20 min; temp. 121^oC, 0,1MPa

MAKROSKŁADNIKI

- pierwiastki: N, K, P, Ca, Mg, S dodawane są w stosunkowo dużej ilości w postaci soli nieorganicznych;

- niezbędne m.in. do:

- budowy białek strukturalnych i enzymatycznych

- budowy kwasów nukleinowych

- aktywacji procesów syntezy oraz prawidłowej gospodarki wodnej

- warunkują właściwą budowę i przepuszczalność błon

- działanie cytoszkieletu

- budowę chlorofilu

MIKROSKŁADNIKI

- pierwiastki: Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo, Al, J, Cl dodawane są do pożywek w postaci związków nieorganicznych w mniejszych ilościach,

- regulują one:

- metabolizm komórkowy

- różnicowanie się komórek

- pobieranie i transport wody oraz asymilantów

- wchodzą w skład białek strukturalnych i enzymatycznych

- są niezbędne do syntezy chlorofilu i prawidłowego funkcjonowania chloroplastów

WITAMINY

- są to związki organiczne, które w niewielkich ilościach katalizują lub pośredniczą w wielu reakcjach enzymatycznych komórek,

- do najczęściej używanych witamin należą:

- tiamina (B1)

- kw. nikotynowy (B3), PP

- pirydoksyna (B6)

- często także dodawany jest mio-inozytol (mezoinozytol) - prekursor witamin.

Inne witaminy (C i E) dodawane w określonych typach kultur odgrywają rolę przeciwutleniaczy (opóźniają utlenienie tkanek eksplantatu, zapobiegając ich brązowieniu)

ŹRÓDŁO WĘGLA

- węglowodany, źródło węgla, podstawowy składnik niezbędny do budowy związków organicznych. Pod tym względem komórki roślinne w kulturach In vitro są heterotrofami. Tylko nieliczne linie komórkowe na pożywkach pozostają autotroficzne, tzn. asymilują CO₂ w procesie fotosyntezy,

- w warunkach In vitro głównie wykorzystuje się disacharydy (sacharoza, maltoza) i monosacharydy (glukoza, fruktoza, galaktoza). Niekiedy stosuje się także inne żródła węgla, m.in. arabinozę, ksylozę czy rafinozę

- dobór odpowiedniego węglowodanu zależy od reakcji eksplantatu.

Dodatki do pożywek:

- aminokwasy (głównie glicyna)

- antybiotyki

- związki pochodzenia naturalnego np. ekstrakt drożdżowy- YE, mleczko kokosowe- CM, czyli płynne bielmo orzecha kokosowego, wyciągi z siewek,

- węgiel aktywowany- AC

absorbuje wydaliny i wydzieliny komórkowe z pożywki, mające negatywny wpływ na wzrost rozwój materiału roślinnego.

POŻYWKI (podział ze względu na zestaw subst. chemicznych)

Pożywki bogate - znajdują zastosowanie w kulturach protoplastów, komórek, merystemów, eksplantatów z różnych

organów roślinnych a także w kulturze kalusa. Przykłady:

MS- Murasnige'a i Skooga (1962)

B5- Gramborga i innych (1968)

Pożywki średnio bogate - zawierają zwykle o połowę mniejsze stężenie makroelementów, czasem również i witamin

od pożywek bogatych.

Pożywki ubogie - zawierają makroelementy w zwykle czterokrotnie niższym stężeniu aniżeli pożywki bogate oraz

różne kombinacje mikroelementów i witamin.

POŻYWKI:

- Niezdefiniowane:

-ekstrakt drożdżowy

-mleko kokosowe

- Zdefiniowane:

-MS

-B5

POŻYWKI (podział ze względu na stopień zestalenia)

- Płynne:

- łatwość infekcji

+ kultury lepiej się rozwijają, łatwa wymiana na pożywkę o odmiennym składzie lub świeżą, łatwo przenikają substancje selekcjonujące

- Półpłynne

- Stałe - zestalone agarem lub agarozą

Pożywki:

-należy sporządzać wykorzystując wcześniej przygotowane stężenie roztwory poszczególnych związków. Roztwory te wykonuje się stosując odczynniki wysokiej klasy czystości podczas całej procedury,

- roztwory można przechowywać w niskiej temp. lub zmrożone przez kilka lub kilkadziesiąt dni,

- odczyn pożywki (pH) ustala się przed autoklawowaniem.

Kultury protoplastów

Protoplasty - to komórka roślinna, którą pozbawiono ściany komórkowej.

Żywy protoplast po przeniesieniu na odpowiednią pożywkę odtwarza ścianę komórkową i rozpoczyna podziały mitotyczne. Początkowo tworzą się małe agregaty komórek (mikrokalusy), a następnie, poprzez morfogenezę przybyszową, dochodzi do regeneracji roslin.

Protoplasty izoluje się przede wszystkim z:

- mezofilu liści,

- hipokotyli,

- liścieni,

- zawiesiny komórek pobranej z fazy wzrostu wykładniczego.

Izolowanie protoplastów:

Metody enzymatyczne - enzymy rozkładające ścianę komórkową, tj. celulozy, hemicelulozy, pektynazy. Wybrany

materiał roślinny inkubuje się w roztworze zawierającym oprócz mieszaniny enzymów także regulatory

ciśnienia osmotycznego (np. nuannitol, sorbitol, sacharozę) oraz sole mineralne i witaminy.

Izolację protoplastów prowadzi się zwykle w temp. od 25-28^oC przez 2-6 godzin w ciemności.

Ocena żywotności i liczebności protoplastów

Prawidłowo wyizolowane i żywe protoplasty mają kształt kulisty z wyraźnie widocznym ruchem cytoplazmy. Żywotność protoplastów sprowadza się barwnikami cytoplazmatycznymi barwiącymi tylko żywe lub tylko martwe protoplasty.

Oczyszczanie protoplastów - usunięcie mieszaniny enzymów oraz resztek nierozłożonych komórek czy tkanek

roślinnych. W tym celu protoplasty filtruje się przez sitka o bardzo małej średnicy oczek, a następnie wiruje,

np. w roztworze sacharozy. W tym wypadku żywe protoplasty zbierają się na powierzchni płynu, natomiast

martwe szczątki opadaja na dno.

Po odwirowaniu czyste protoplasty kilkakrotnie przepłukuje się pożywką i dopiero wówczas przenosi się na pożywki odpowiednie do dalszych etapów.

Kultury protoplastów

Założenie kultury wyizolowanych protoplastów. Czystą frakcję protoplastów zawiesza się w pożywce agarazowej lub w postaci cienkiej warstwy zawiesiny umieszcza się na powierzchni pożywki agarowej. Protoplasty odtworzą ściany komórkowe i w wyniku podziału powstaną mikrokalusy. Dalszy etap jest uzależniony od założonego celu (proliferacja kalusa, morfogeneza przybyszowa, regeneracja roślin).

WSZYSTKIE ETAPY PRACY WYMAGAJĄ ZACHOWANIA MAKSYMALNEJ STERYLNOŚCI, DOKŁADNOŚCI, DELIKATNOŚCI -zapewnienie żywotności protoplastów.

Kultury protoplastów prowadzi się m.in. celem:

- badań biochemiczno - fizjologicznych,

- selekcji

- modyfikacji genetycznych

- fuzjonowania (łączenia) z innymi protoplastami.

FUZJONOWANIE PROTOPLASTÓW

Fuzja- to łączenie się (zlewanie) protoplastów pochodzących z różnych komórek. W kulturach In vitro możliwe jest

przeprowadzanie fuzji pomiędzy protoplastami komórek somatycznych pochodzącymi od tej samej rośliny lub

różnych gatunków.

Fuzja In vitro HYBRYDYZACJA SOMATYCZNA - pozwala ominąć naturalne bariery (przed i pozyotyczne)

zapobiegając krzyżowaniu się roślin między gatunkami, rodzajami i rodzinami.

Cel fuzjonowania protoplastów:

- otrzymywanie mieszańców somatycznych, czyli komórek, zregenerowanych z nich roślin, które powstały w wyniku fuzji protoplastów komórek somatycznych pochodzących od różnych osobników odmiennych gatunków.

- ułatwia także różnorodne modyfikacje genetyczne roślin rozmnażanych wegetatywnie, roślin sterylnych, z naturalnym długim cyklem życiowym czy budowie mechanizmów infekcji wirusowej.

Etapy fuzji protoplastów:

- bezpośredni kontakt błon protoplastów (neutralizacja ujemnego ładunku powierzchniowego błon),

- czasowa destabilizacja błon (zmiana przepuszczalności, pofałdowanie)

- wytworzenia połączeń (tzw. mosty błonowe lub molekularne) między cytoplazmami stykających się protoplastów.

- zlewa się cytoplazmy wraz z organellami

- odtwarzanie i otoczenie produktu fuzji, wspólną błoną komórkową.

W wyniku fuzji protoplastów powstają:

- Heterokariany - po połączeniu komórek somatycznych pochodzących od różnych osobników (różnych

komponentów fuzji) powstaje hybrydowy mieszaniec jądrowy.

- Homokariany - efekt połączenia protoplastów tego samego komponentu fuzji.

Ostatecznie po fuzji mogą powstać następujące kombinacje połączeń:

- symetryczny mieszaniec jądrowy - ma kompletne jądra obu komponentów (powst. stosunkowo rzadko)

- asymetryczny mieszaniec jądrowy - powstaje w wyniku eliminacji chromosomów lub ich fragmentów,

Asymetria może być:

- swoista (dotyczy tylko 1 genomu)

- nieswoista (dotyczy obu jąder)

- cybrydy - mieszańce cytoplazmatyczne, zawierające jądro tylko 1 osobnika, a cytoplazmę drugiego lub jądra tylko 1 osobnika, a cytoplazmę drugiego lub jądra jednego, a cytoplazma obu osobników użytych do fuzji.

Metody fuzji:

- F. chemiczna - stymulatorem procesu jest glikol polietylenowy (PEG) w połączeniu z dużym stężeniem jonów

wapnia oraz dimetylosulfotlenku (DMSO). Po krótkiej inkubacji w mieszaninie, protoplasty przemywa się

roztworem zawierającym jony wapnia i wprowadza pożywkę, następuje odtworzenie ściany komórkowej oraz

kolejne fazy rozwoju komórek.

- F. fizyczna - (elektrofuzja) wykorzystuje impulsy elektryczne do łączenia się w naczyniu pomiędzy 2 elektrodami.

• w 1 etapie, pod wpływem prądu zmiennego protoplasty ustawiają się wzdłuż lini pola elekt./magnet. tworząc charakterystyczne sznury, a ich błony stykają się ze sobą.

• w 2 etapie, w wyniku krótkotrwałego impulsu prądu stałego następuje elektroporacja błon.

Metody otrzymywania roślin haploidalnych (1n):

1. Eliminacja chromosomów w zarodkach powstałych w wyniku krzyżowań międzygatunkowych lub międzyrodzajowych (powszechnie stosowana u zbóż)

2. Androgeneza - sporofityczny rozwój gametofitu męskiego:

1. kultury pylnikowe

2. kultury izolowanych mikrospor

3. Gynogeneza - sporofityczny rozwój z haploidalnych komórek woreczka zalążkowego:

1. kultury niezapylonych zalążków i zalążni

2. kultury zapylonych zalążków i zalążni.

Kultury mikrospor i pylników:

Kultury te pozwalają uzyskiwać rośliny haploidalne (mające genetyczną liczbę chromosomów w komórkach somatycznych). Eksplantami są izolowane pojedyncze jednojądrowe makrospory lub całe pylniki, zawierające mikrospory.

Proces uzyskiwania roślin haploidalnych z mikrospor i pylników określa się jako ANDROGENEZĘ IN VITRO:

- po przeniesieniu na pożywkę eksplantaty rozwijają się bezpośrednio w haploidalne zarodki przybyszowe (zarodki

gametyczne ) lub kalus haploidalny. Z zarodków rozwijają się rośliny, natomiast z kalusa mogą powstać zarówno

przybyszowe zarodki jak i zawiązki pędów czy korzeni,

- rośliny haploidalne są niepłodne, zatem ich zestaw chromosomów musi być podwojony (np. kolchicyną). W

Rezultacie powstają podwójne haploidy -DH, płodne rośliny będące ho zygotami.

Największą odmiennością do ankogenezy charakterystyczne są gatunki należące do rodzin: Solanaceae, Poaceae, Brassicaceae (ok. 240 gat.)

Kolchicyna - niszczy wrzeciono przy podziałach mejotycznych.

Oceny stopnia ploidalności można dokonać na podstawie:

- liczby chromosomów w komórkach,

- pomiaru niektórych cech morfologicznych i cytologicznych (dł. aparatów szparkowych, liczba chloroplastów w kom. szparkowych, wielkość ziaren pyłku)

- zawartość DNA jądrowego i plastydowego.

Z kalusa poploidalnego powstają:

- korzenie przybyszowe

- pędy przybyszowe

- kalus menorfogenny

- genetyczne zarodki przybyszowe.

Kultury niezapłodnionych zalążków lub całych zalążni:

- kultury tego typu są wykorzystywane do uzyskania roślin haploidalnych,

- po przełożeniu na pożywki w zalążkach lub zalążniach dochodzi do rozwoju niezapłodnionej komórki jajowej, synergidy lub antypody w haploidalny zarodek genetyczny lub haploidalny kalus, który następnie jest zdolny do wytworzenia zawiązków pędu czy korzeni.

Proces regeneracji roślin z haploidalnych komórek woreczka zalążkowego określa się jako ginogenezę In vitro (uzyskano u 16 gat.). Również w tym wypadku konieczne jest podwojenie liczby chromosomów, aby otrzymać płodne rośliny homozygotyczne DH.

Hormonami roślinnymi - określa się endogenne subst. organiczne transportowane w roślinie od miejsca wytworzenia do miejsca, gdzie ich niewielka ilość wywiera swoiste efekty fizjologiczne.

Warunkiem odpowiedzi (reakcji) komórki na sygnał (cząsteczkę hormonu) jest obecność w niej swoistego białka receptorowego, które wiąże dany hormon w sposób specyficzny i odwracalny.

Każdy regulator wzrostu i rozwoju ma szeroki zakres oddziaływania na rośliny, zależy od stężenia oraz współczynnika z innymi substancjami Endo- i egzogennymi.

Oddziaływanie to na eksplantaty roślinne In vitro można scharakteryzować następująco:

1. Te same regulatory roślinne mogą:

1. Działać różnie nie tylko na eksplantaty z grup oddalonych taksonomicznie, ale także na odmiany i klony tego samego gatunku,

2. Działać niejednakowo na eksplantaty z tej samej rośliny, ale pochodzące z różnych tkanek i organów,

3. Działać odmiennie nawet na eksplantaty z tej samej części rośliny, jeśli pobrano je z różnych etapach rozwoju osobniczego.

2. Kolejne podanie różnych regulatorów daje odmienny efekt niż podanie ich równocześnie.

3. Wzrastająca koncentracja regulatora może wywołać nasilanie się jakiegoś efektu, a po przekroczeniu progu ilościowego może spowodować zmianę efektu.

4. Różne regulatory, także z różnych grup, mogą powodować taką samą reakcję morfologenetyczną eksplantatów pobranych z różnych grup taksonomicznych.

5. Reakcja eksplantatu na regulatory roślinne jest w znacznym stopniu modyfikowana przez środowisko, np. zawartość składników mineralnych i organicznych w pożywce, cechy fizyczne pożywki, skład atmosfery w naczyniu, temp. czy oświetlenie.

6. Działanie regulatorów roślinnych zależy od wielu kultur, ponieważ wraz z liczbą pasaży zmienia się wrażliwość eksplantatu na regulatory, co jest wynikiem zmniejszającej się ekspresji niektórych genów lub akumulacji niektórych metabolitów.

7. Reakcja morfogenetyczna eksplantatu na regulatory rozwoju następuje po różnym okresie, a długość okresu oczekiwania na reakcję jest zależna od stężenia i rodzaju regulatora, rodzaju eksplantatu, jego początkowej wrażliwości i innych czynników.

8. Większość regulatorów rozwoju nie pozostaje w komórkach i tkankach w postaci, w jakiej została podana do pożywki, ale przynajmniej częściowo jest metabolizowana do form nieaktywnych fizjologicznie.

Fitohormony Cd.

Do roślinnych regulatorów wzrostu i rozwoju stosowanych w kulturach In vitro należą następujące hormony:

• Auksyny

• Cytokininy

• Gibereliny

• Kw. abscysynowy

• Etylen

AUKSYNY:

• syntetyzowane są przede wszystkim w młodych częściach roślin, wierzchołkach pędów, młodych liściach i owocach;

• stymuluje wzrost wydłużeni owy komórek, tworzenie korzeni, indukują powstawanie owoców partenokarpicznych, uczestniczą w regulacji dominacji wierzchołkowej;

• w kulturach In vitro auksyny inicjują podziały komórkowe, w konsekwencji dochodzi do wytworzenia kalusa, powodują również elongację komórek oraz stymulują tworzenie korzeni, a także indukują somatyczną embriogenezę;

• w kulturach In vitro wykorzystywane są zarówno auksyny występujące naturalnie jak i syntetycznie.

1. Naturalne:

IAA - kw. indolilo-3-octowy

IBA - kw. indolilo-3-masłowy

2. Syntetyczne:

NAA Pikloren

2,4-D Dicemba

CYTOKININY:

• Miejsce syntezy cytokinin są wierzchołki korzeni, kambium, rozwijające się liście, pąki, owoce oraz kiełkujące nasiona;

• Stymulują podziały komórkowe i opóźniają starzenie oraz stymulują kiełkowanie nasion, powodują ustępowanie spoczynków pąków, znoszą dominację wierzchołkową, hamują tworzenie i wzrost korzeni;

• W kulturach In vitro cytokininy wykorzystywane są w celu indukcji podziałów komórkowych, inicjacji merystemów pędowych, znoszenie dominacji wierzchołkowej (co umożliwia wyrastanie pąków bocznych), zahamowanie tworzenia korzeni oraz opóźnienia procesów starzenia.

1. Naturalne:

Trans-zeatyna

ZiP

2. Syntetyczne:

Kinetytna

BAP (BA)

TDZ

PBA

Auksyny wysokie Cytokininy niskie

Wytwarzanie korzeni przez sadzonki

Somatyczna embriogeneza

stężenie Wytworzenie korzeni przez kalus stężenie

Inicjacja kalusa u roślin dwuliściowych

Powstawanie pędów bocznych

Namnażanie pędów bocznych

Niskie Wysokie

GIBERELINY:

• Syntetyzowana w wierzchołkach korzeni rozwijają się w liściach, nasionach, owocach;

• Działanie ich polega na stymulacji wzrostu wydłużeniowego, umożliwiają uzyskanie normalnego wzrostu i pokroju karłowatym mutantom. Uczestniczą również w regulacji ustępowania spoczynku nasion, indukcję kwitnienia roślin dnia długiego, stymulują rozwój kwiatów płci męskiej i niekiedy mogą wywoływać powstawanie owoców partenokarpicznych;

• W kulturach In vitro są wykorzystywane rzadziej niż auksyny, cytokininy. Stosowano w celu indukcji pędów lub przerwaniu spoczynku izolowanych zarodków.

GA₃ - kw. giberelinowy

KWAS ABSCYSYNOWY (ABA):

• Syntetyzowany w liściach, nasionach, korzeniach i owocach;

• Indukuje spoczynek w pąkach i nasionach, hamuje kiełkowanie nasion, hamuje wzrost, indukuje zamykanie szparek, przyspiesza procesy tworzenia oraz opadanie organów;

• W kulturach In vitro wykorzystywany jest do regulacji przebiegu somatycznej embriogenezy, umożliwia prawidłowe wykształcenie zarodków somatycznych; znalazł zastosowanie w inhibicji przedwczesnego kiełkowania zarodków i indukcji odporności na ich dehydratację.

ETYLEN:

• Syntetyzowany przez wszystkie tkanki roślinne;

• Stymuluje ustępowanie spoczynku nasion i pąków, wzrost pędów, korzeni i liści oraz rozwój pąków bocznych, stymuluje tworzenie korzeni przybyszowych, kwitnienie, dojrzewanie owoców, starzenie się organów;

• W kulturach In vitro obserwuje się wpływ zarówno pozytywny (np. stymulacja wzrostu tkanki kalusowej lub wzrostu wydłużeniowego, zwiększona produkcja somatycznych zarodników) jak i negatywny - zmniejszenie liczby wytworzonych zarodków, nieprawidłowy rozwój.

CH₂

Etylen ||

CH₂

Regeneracja i rozwój roślin w kulturach In vitro:

TOTIPOTENCJA - ZDOLNOŚĆ DO ODTWORZENIA CAŁEJ ROSLINY Z POJEDYNCZEJ JOMÓRKI.

Każda żywa komórka nawet zróżnicowana, zawiera pełną informację genetyczną, która w odpowiednich warunkach może zostać uruchomiona i doprowadzić do regeneracji poszczególnych organów bądź całej rośliny. Warunkiem wyzwalającym totipotencje jest pozbawienie komórki korelacyjnego wpływu organizmu macierzystego. W praktyce polega to na wyizolowaniu i przeniesieniu komórek na pożywkę zawierającą odpowiednią kombinację roślinnych regulatorów wzrostu i rozwoju.

KOMPETENCJA - ZDOLNOŚĆ KOMÓRKI DO ODBIORU SYGNAŁÓW I REAGOWANIA NA NIE ZA POMOCĄ ODPOWIEDNICH RECEPTORÓW.

TOTIPOTENCJA I KOMPRETENCJA KOMÓREK ROSLINNYCH MOGĄ ULEC ZMIENIE W TRAKCIE TRWANIA KULTURY IN VITRO.

MORFOGENEZA ROŚLIN IN VITRO - przekształcenia, które prowadząco powstania wielokomórkowego organizmu wraz ze skomplikowanym układem tkanek i organów.

Morfogeneza roślin In vitro może się odbywać w wyniku:

• Organogenezy

• Somatycznej embriogenezy

ORGANOGENEZA - wytworzenie określonych organów.

W kulturach In vitro obserwujemy:

• Organogenezę pędową (pedogenezę)

• Organogenezę korzeniową (ryzo genezę)

Kierunek organogenezy - a więc to, czy powstaną pędy czy korzenie zależy od proporcji pomiędzy auksynami i cytokininami. Przewaga auksyn decyduje o formowaniu się korzeni; natomiast przewaga cytokinin - o tworzeniu pędów.

ORGANOGENEZA BEZPOŚREDNIA - wytworzenie organów bezpośrednio na eksplantacie.

Eksplantat (komórka lub komórki kompetentne) - organ

ORGANOGENEZA POŚREDNIA - wytworzenie organu jest poprzedzone przez stadium kalusa i organy powstałe z tkanki kalusowej.

Eksplantat kalus (komórka/komórki o indukowanej kompetencji) organ

Kalus - jest tkanką niejednorodną (niestabilnie genetycznie) i nie wszystkie jego komórki mają jednakowe zdolności rozwojowe.

POŚREDNIA ORGANOGENEZA NIE DAJE JEDNORODNOŚCI ROŚLIN

Eksplantat pierwotny Odróżnicowanie komórek DEDYFERENCJACJA KALUS Powtórne zróżnicowanie odmłodzonych komórek DEDYFERENCJACJA TWORZENIE ORGANÓW

SOMATYCZNA EMBRIOGENEZA - kierunek morfogenezy In vitro, w którym z roślinnych komórek somatycznych formuje się zarodki przybyszowe nie połączone wiązkami przewodzącymi z tkanką macierzystą. Zarodki powst. z komórek. Które nie są produktem fuzji gametycznej.

• BEZPOŚREDNIA - zarodki tworzą się bezpośrednio z komórek eksplantatu.

Eksplantat zarodek

• POŚREDNIA - w trakcie procesu wyst. faza kalusa, tkanki, z której komórek regenerowane są zarodki.

Eksplantat kalus zarodek / zarodki

INDUKCJA SOMATYCZNEJ EMBRIOGENEZY ZACHODZI NAJCZĘŚCIEJ POD WPŁYWEM AUKSYN

MIKROROZMNAŻANIE - Mikropropagacja, klonowanie In vitro

Mikrorozmnażanie - polega na wyłożeniu na pożywkę warunkach In vitro eksplantatu, z którego na drodze indukowanej morfogenezy uzyskujemy namnożone rośliny identyczne z tą od której pochodził eksplantat.

Przy wykorzystaniu tej metody należy uwzględnić:

• Metoda musi gwarantować wysoki stopień identyczności genotypowej i fenotypowej (brak mutacji i długo utrzymujących się zmian epigenetycznych);

• Powinna być opłacalna w porównaniu z mnożeniem tradycyjnym.

Istnieją trzy sposoby mikrorozmnażania:

1. Poprzez wyłożenie na pożywkę merystemów, pąków wierzchołkowych i/lub bocznych (pachwinowych, kątowych), znajdujących się na roślinie matecznej.

Wydajność tej metody zależy od liczby pąków, które u danego gat. tworzą się na pędzie.

Zaletą tej metody jest jednolitość genetyczna roślin potomnych z rośliną mateczną (stabilność genetyczna), ponieważ w procesie morfogenezy nie uczestniczy tkanka kalusowa.

2. Poprzez indukowanie w kulturach pędów przybyszowych (tj. pędów, których zaczątki w eksplantacie nie występowały) wyrastających bezpośrednio z eksplantatu lub kalusa na nim utworzonego.

W przypadku indukowania pędów przybyszowych powstają one często w kalusie (po kilku pasażach).

U niektórych gat. można je uzyskać bezpośrednio w wyniku podziałów komórek warstwy subepidermalnej, które tworzą merystemy pędowe, a następnie pąki na fragmentach liści, cebul, łusek.

Ten sposób mikrorozmnażania pozwala na otrzymanie licznych roślin (zależnie od zdolności morfogenetycznych kalusa).

Wadą jest możliwość wystąpienia niestabilności genetycznej z powodu pośrednictwa kalusa oraz spadek zdolności do morfogenezy w miarę pasażowania.

Eksplantatanty np.: pąki kwiatowe główki kwiatowe, blaszki liściowe, ogonki liściowe, międzywęźla, fragmenty korzeni, skrawki bulwy, łuski liściowe - cebule.

3. Przez indukowanie najczęściej na kalusie przybyszowych zarodków somatycznych.

Somatyczna embriogeneza (przebiega w dwóch fazach)

Faza I

Indukcji - następuje pod wpływem auksyn powodujących odróżnicowanie komórek, ich podziały komórki potomne nie rozdzielają się ale tworzą zgrupowania zwane jako masa zarodkowa. Podlega ona intensywnym podziałom nie zmieniając kierunku rozwojowego do czasu usunięcia auksyny z pożywki.

Faza II

Różnicowanie - w masie zarodkowej przeniesionej na pożywkę bez auksyny następuje rozwój zarodków poprzez stadium globularne, sercowate, torpedy.

Dla prawidłowego kiełkowania zarodki powinny wykształcić funkcjonalne merystemy pędowe i korzeniowe co dokonuje się w procesie ich dojrzewania, a sprzyja temu zwiększona ilość sacharozy i dodatek ABA w pożywce.

Technika mikrorozmnażania obejmuje nast. etapy:

1. Założenie i stabilizacja kultury.

2. Namnażanie pędów.

3. Ukorzenianie.

4. Adaptacja do warunków In vivo.

Ad. 1

• Dezynfekcja materiału roślinnego;

• Wycinanie eksplantatów i wykładanie na pożywki;

• Indukcja wzrostu pędu lub kalusa;

• Etap kończy się z chwilą wytworzenia pędów lub kalusów zdolnych do organogenezy.

Ad. 2

• Celem jest uzyskanie pożądanej liczby pędów więc w zależności od wydajności namnażania polega na wykonaniu odpowiedniej liczby pasażu (może stanowić najdłuższy okres kultury);

• W zależności od gatunku, a nawet genotypu w składzie pożywki uwzględnia się cytokininy, auksyny, gibereliny.

Ad. 3

• Pędy powstające w wyniku rozkrzewiania oddziela się od eksplantatu inicjalnego i przenosi na pożywkę stymulującą ukorzenianie co osiąga się najczęściej poprzez dodatek auksyn (u niektórych gatunków ukorzenianie następuje pod koniec pasażu namnażania). Stymulacja ukorzeniania zachodzi także pod wpływem retardantów, floreglurynolu, wit. D, aminokwasów.

Ad. 4

• Ponieważ rośliny z kultur In vivo char. się:

- znacznym uwodnieniem tkanek,

- słabym zdrewnieniem,

- niecałkowicie wykształconą tkanką okrywającą,

- niefunkcjonalnymi aparatami szparkowymi;

• Dlatego też podatne na wysychanie i porażenie przez choroby i szkodniki;

• Z tego powodu w okresie adaptacji należy je chronić przed wysychaniem i zakażeniami wykorzystując szklarnie, mnożarki, pokoje wzrostowe o ustalonych warunkach temp., światła i wilgotności.

Metody eliminowania wirusów:

• Kultura In vitro merystemów wierzchołkowych,

• Chemioterapia,

• Termoterapia,

• Krioterapia.

Kultura merystemów wierzchołkowych.

Fragmenty merystemów (0,2-1,0mm dł.) izoluje się z:

• Paków wierzchołkowych

• lub bocznych

Kultury merystemów inkubuje się w pomieszczeniu o temp. 18-22^oC, przy doświetlaniu ciągłym światłem, stosując pasaże na świeżą pożywkę co 3-4 tyg. Duże znaczenie ma przygotowanie roślin do przeniesienia ze szkła do doniczek (pasaż na pożywkę ukorzeniającą, o zwiększonej zawartości auksyny, zmniejszonym stężeniu soli mineralnych oraz bez sacharozy). Zabieg ten ułatwia roślinom podjęcia fotosyntezy i powrót do samożywności. Po czym otrzymujemy roślinę odpowiednią do wysadzenia na podłoże glebowe.

Do przeprowadzenia pierwszego testowania i wyeliminowaniu roślin podejrzanych o zawirusowanie otrzymujemy elitarny matecznik, który utrzymuje się w warunkach pełnego zabezpieczenia przed wtórną infekcją. Rośliny mateczne co 3 miesiące poddaje się regularnym kontrolom fitosanitarnym.

CHEMIOTERAPIA IN VITRO:

• antymetabolity należą do związków o wysokiej aktywności przeciwwirusowej. Są to substancje włączające się w metabolizm wirusów i wywołujące zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusowego, hamując ich namnażanie się. Należą do nich analogi pirymidyn - uracyl, tionacyl, bromo-uracyl oraz analogi puryn. Najczęściej są stosowane jako dodatek do pożywki dla kultury merystemów wierzchołkowych w celu zwiększenie skuteczności zwalczania wirusów;

• także niektóre surfaktanty wykazują właściwości podobne do antymetabolitów, np. DEMEB

TEMPERATURA IN VITRO:

• traktowanie eksplantatów wyłożonych na pożywkę (np. merystemów wierzchołkowych pędów czy kalusa) podwyższoną temperaturę (36^oC podczas dnia i 30^oC w nocy przez 4-8 tyg.) eliminuje wiele wirusów, a nawet niektóre gat. bakterii systemicznie zasiedlających tkanki przewodzące roślin;

• warunki terapeutyczne dobiera się eksperymentalnie, dla konkretnego gat. rośliny i rodzaju wirusa, uwzględniając zakres temperatur tolerowanych przez roślinę, a jednocześnie mieszczących się pomiędzy optimum inaktywującym wirusa a maksimum tolerowanym jeszcze przez eksplantat;

• termoterapia In vitro, np. Vitis vinifera, dawała najlepsze rezultaty, kiedy traktowano podwyższoną temp. 36^oC przez 6 tyg. ukorzenione już rośliny. Natomiast świeżo izolowane merystemy bardzo źle znosiły ten zabieg, zwłaszcza że należało go powtórzyć dwukrotnie, aby uzyskać całkowitą eliminację wirusa.

KRIOTERAPIA:

• większość wirusów toleruje niskie temp. podczas krioprezerwacji eksplantatów. Tylko niewielka grupa termo labilnych wirusów roślinnych może być eliminowana przez mrożenie.

• Przykładem może być wirus szarki śliwy (PPV), który wyeliminowano stosując metodę kombinowaną, czyli izolację małych merystemów wierzchołkowych pędów (0,3-1mm) i krioterapię.

---