slajdy, III rok, Genetyka kliniczna


PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction)

Klonowanie genu (Lawyer i wsp. 1989).

Założenia reakcji

Przebieg reakcji, cykle reakcji PCR:

-Wiązanie starterów (annealing) - 50-65 ºC przez 30-60 sek, najbardziej istotny czynnik w optymalizacji reakcji, na ten etap ma wpływ temperatura, stężenie matrycy i startera oraz czas; jeżeli temperatura hybrydyzacji jest za wysoka - przyłączanie primerów jest niemożliwe. Przy zbyt niskiej temperaturze może zachodzić niespecyficzne przyłączenie starterów do wielu miejsc na matrycy - w efekcie powstaje duża ilość niespecyficznych produktów o nieznanej sekwencji.

- Wydłużanie łańcucha (extension) - 72 ºC - wydłużanie startera następuje zawsze od końca 3'-OH, sukcesywne dosyntetyzowanie DTP zachodzi najczęściej w temperaturze 72 ºC, aczkolwiek może być wyższa,
czas trwania polimeryzacji to 20 sekund - dla fragmentów do 500 pz i 40 sekund dla fragmentów do 1,2 kpz;
Proces ten katalizowany jest przez polimerazę DNA; szybkość reakcji w optymalnych warunkach dla polimerazy Taq wynosi od 2000 nukleotydów/min; dla całkowitej syntezy badanego fragmentu czas trwania tego etapu wyznaczamy zakładając połowę optymalnej prędkości

Skład mieszaniny reakcyjnej: Matryca (DNA, cDNA), para syntetycznych oligonukleotydów służących jako startery syntezy DNA, Trójfosforany deoksyrybonukleotydów dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP , kationy dwuwartościowe (Mg2+), Termostabilna polimeraza Taq, Bufor o pH 8,8

Matryca - nie może być zdegradowana ani zanieczyszczona

DNA musi być wysokocząsteczkowe, wolne od białek i inhibitorów enzymów

Etapy pobierania materiału, prawidłowego oznaczenia próbki, transportu, przechowywania i izolacji DNA są warunkami koniecznymi aby zagwarantować wysoką wydajność izolacji i wysoki stopień czystości DNA

zbyt duża ilość DNA może prowadzić do zwiększenia zawartości niespecyficznych produktów PCR

1. Ilość DNA matrycowego użytego do reakcji PCR zależy od źródła jego pochodzenia

genomowy 0,1 - 1μg
plazmidowy lub fagowy 0,01-1 μg

Polimeraza - obecnie stosuje się termostabilną polimerazę DNA (Taq polimeraza) wyizolowaną z bakterii Thermus aquaticus (Początkowo do reakcji PCR używano fragmentu Klenowa polimerazy DNA I E.coli. Niestety enzym ten jest inaktywowany przez wysoką temperaturę, która jest potrzebna do rozdzielenia nici DNA. W konsekwencji na początku każdego cyklu musiała być dodawana świeża porcja enzymu).

- optymalna ilość enzymu wynosi od 0,5 - 2,5 U w próbce na 50 ul na około 40 cykli,

- zwiększenie stężenia enzymu - niespecyficzne produkty,

- zmniejszenie stężenia enzymu - zbyt małe ilości produktu.

Termostabilne polimerazy DNA różnią się między sobą odpornością na wysoką temperaturę, dokładnością wbudowywania nukleotydów i prędkością działania podczas amplifikacji (np. odznaczającej się większą wiernością kopiowania - polimerazę Pfu)

dNTP

-dATP, dCTP, dGTP, dTTP

-w mieszaninie reakcyjnej każdego z czterech nukleotydów jest zazwyczaj po 200 uM

-nierówne ilości czterech dNTP redukują wydajność amplifikacji,

-niskie stężenie nukleotydów minimalizuje ich błędne wstawianie w nowo syntetyzowanej nici.

-optymalne stężenie dNTP zależy od:

Długości amplifikowanego produktu

Stężenie MgCl2

Stężenie starterów

Startery

Długość typowych starterów powinna wynosić 18-28 nukleotydów, które zawierają Ok. 50-60% par GC

Zawartość GC wiąże się z innym ważnym parametrem jakim jest temperatura topnienia starterów Tm (2n(A+T)+4n(G=C)-5) n-oznacza liczbę określonych nukleotydów

Poszczególne pary starterów powinny wykazywać podobną temperaturę topnienia (zakres 55-72 ºC), co zapewnia powstawanie specyficznych produktów PCR

Tm nie powinna być niższa niż 50 ºC

Ważny jest dobór stężenia starterów: przyjmuje się za optymalne stężenie około 0,1 do 0,5 uM, przy stężeniu wyjściowym 200-1000 pmoli/ul

Wyższe stężenie starterów może prowadzić do akumulacji niespecyficznych produktów i zwiększa prawdopodobieństwo generowania dimerów primerów

3 końce starterów nie powinny być komplementarne w stosunku do siebie (dimery)

Nie powinny zawierać sekwencji palindromowych

Nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych

Kationy dwuwartościowe Mg2+

Dokładność reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów magnezu

Stężenie magnezu (1-4 mM) zawsze nieco przewyższa stężenie dNTP, co zwiększa dokładność polimerazy

Nukleotydy redukują pulę wolnych jonów Mg2+ wpływając w ten sposób na aktywność polimerazy i hybrydyzację starterów

Za dużo jonów Mg2+ zwiększa wartość niespecyficznych produktów PCR i obniża wierność (zgodność) syntezy

Bufor

Zapewnia odpowiednie warunki działania polimerazy

Zakres pH różnych buforów, w zależności od firmy z której pochodzi polimeraza wynosi 8,3-8,8

W skład buforu wchodzi Tris-HCl w ilości 10-50 mM, często również zawiera 50mM KCl, ale stężenie tego składnika może się różnić

Bufor często zawiera również inne dodatki takie jak:

Siarczan amonu

BSA

Tryton

Te dodatki mogą stabilizować polimerazę oraz modyfikować oddziaływania między matrycą a starterami

Czynniki wpływające na reakcję PCR

Wyposażenie np. typ termocyklera, typ probówki reakcyjnej

Primery - para syntetycznych oligonukleotydów służących jako startery syntezy DNA

Objętość próbki reakcyjnej

Wielkość i struktura amplifikowanego produktu

Ogólne zasady przygotowania reakcji PCR

Zachowywanie ostrożności w stosunku do wszelkiego rodzaju zanieczyszczeń (bo reakcja PCR jest bardzo czuła)

Wydzielenie fizycznego rejonu w laboratorium przeznaczonego tylko do doświadczeń z PCR

Używanie tylko osobistych zestawów odczynników i pipet

Używanie rękawiczek do wszystkich operacji związanych z reakcją

Używanie materiałów, butelek i probówek jednorazowego użytku

Używanie oddzielnych zestawów pipet do odczynników probówek DNA

Z powodu niezwykłej czułości PCR konieczne jest (szczególnie w probówkach diagnostycznych!!!) stałe kontrolowanie wykonywanych eksperymentów

Stosuje się specjalnie przygotowane próbki kontrolne które w rutynowych reakcjach PCR powinny być tak zaprojektowane, aby wykrywać kontaminację niepożądanych fragmentów DNA lub produktów PCR

Źródła kontaminacji (zanieczyszczeń) można podzielić na dwa typy:

Zachodzące przed reakcją PCR np. w czasie dostarczania próbek od pacjentów do laboratorium; noszą nazwę pre-PCR

Zachodzące w wyniku czynności laboratoryjnych, zachodzących po reakcji PCR, czyli post-PCR

Analiza produktów PCR

Techniki elektroforetyczne wykorzystują zdolność migracji kwasów nukleinowych w żelach

DNA i RNA mają silny ładunek ujemny, wobec czego w polu elektrycznym przemieszczają się w kierunku od anody do katody

Stosowane w badaniach żele stanowią włóknistą sieć, która ogranicza swobodną migrację

Szybkość przemieszczania się kwasów z żelu zależy od wielkości i kształtu cząsteczek, najszybciej poruszają się cząsteczki małe i nierozgałęzione

W zależności od rodzaju zastosowanego żelu i jego stężenia zmienia się zakres rodzaju cząstek, które można rozdzielić

Żel agarozowy:

-metoda bardzo szybka

-siła rozdziału jest stosunkowo niska

-można rozdzielić cząsteczki o wielkości 100-5000 pz

-praca z żelem jest prostsza, żel dłużej polimeryzuje i jest stosunkowo grubszy

Żel poliakrylamidowy

-metoda wymagająca dużo czasu

-wysoka rozdzielczość

-można rozdzielić cząsteczki o wielkości 5-1500 pz

-żele są cieńsze i szybciej polimeryzują, praca jest trudniejsza

-poliakrylamid to związek neurotoksyczny

Zastosowanie PCR

AMPLIFIKACJA - czyli uzyskanie zwiększonej ilości fragmentu DNA, w którym występuje mutacja lub polimorfizm, a następnie jego dalsza analiza:

-PCR-RFLP

-PCR-SSCP

-ASO-PCR

-sekwencjonowanie DNA

-hybrydyzacja

-inne

Przydatna w diagnostyce wielu chorób

Wykorzystywana w celu potwierdzenia/wykluczenia ojcostwa

Znajduje zastosowanie w kryminalistyce

Identyfikacja drobnoustrojów chorobotwórczych i wielu innych

MLPA

Metoda molekularna opracowana w 2002 roku przez firmę MRC Holland oparta na ligacji i reakcji PCR

Bardzo elastyczna technika pozwalająca na analizę zarówno na poziomie molekularnym jak również cytogenetycznym

Możliwa jest względna ilościowa ocena równocześnie 40-45 różnych sekwencji nukleotydowych w jednej reakcji

Umożliwia wykrywanie:

-delecji, duplikacji i amplifikacji pojedynczych egzonów

-ocenę metylacji badanych fragmentów,

-badanie poziomu mRNA

-badanie zmian pojedynczych nukleotydów

Reakcja MLPA dzieli się na pięć głównych etapów:

-denaturacja DNA i hybrydyzacja sond MLPA

Denaturacja genomowego DNA (98 ºC)

Hybrydyzacja matrycy z sondami (54 ºC) przez całą noc.

Zastosowane są sondy połówkowe hybrydyzujące do komplementarnych badanych odcinków DNA ulegające ligacji i następnie służace jako jedna matryca dla polimerazy DNA

-reakcja ligacji

Jest możliwa dzięki zastosowaniu enzymu ligazy

-reakcja PCR

Użyte są dwa startery wspólne dla wszystkich sond stosowanych w jednej reakcji

Jeden ze starterów jest wyznakowany fluorescencyjnie

-elektroforetyczny rozdział produktów PCR i analiza danych

Elektroforeza zachodzi w warunkach denaturujących w sekwenatorze kapilarnym

MLPA umożliwia diagnostykę:

Chorób uwarunkowanych delecjami lub amplifikacjami fragmentów genów

Nowotworów

Zespołów mikrodelecyjnych

Aneuploidii

Zmian w rejonach subtelomerowych

SEKWENCJONOWANIE

Metoda Sangera

Metoda „dideoksy” jest enzymatyczną reakcją używaną w odczytywaniu sekwencji nukleotydowej DNA uprzednio sklonowanego. Istotą tej metody jest zastosowanie polimerazy DNA i trifosforanów dideoksyrybonukleotydów (ddNTP), które nie posiadają grupy hydroksylowej w pozycji 3'rybozy, co uniemożliwia przyłączenie do syntetyzowanego łańcucha DNA następnego nukleotydu. Replikacji enzymatycznej ulega jednoniciowe DNA (matryca) do którego na początku łączy się starter a w końcowym etapie wbudowywany jest jeden ddNTP (znakowany radioizotopem lub fluorochromem).

Uzyskane produkty można uwidocznić na kliszy rentgenowskiej po autoradiografii żelu, bądź przy użyciu automatycznego odczytu sekwencji DNA z zastosowaniem sekwenatorów.

Metodą dideoksy można sekwencjonować fragmenty DNA:

-klonowane w wektorach fagowych, kosmidowych, plazmidowych

-produkty PCR

-bezpośrednie sekwencje genomowego DNA

ETAPY SEKWENCJONOWANIA

    1. PCR preparatywny - namnożenie wybranego fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych starterów

    2. Oczyszczanie PCR preparatywnego - wycięcie prążka z żelu

    3. PCR sekwencyjny/asymetryczny - z jednym ze starterów z zastosowaniem dideoksynukleotydów

    4. Oczyszczanie PCR sekwencyjnego

    5. Rozdział otrzymanych fragmentów DNA - elektroforeza kapilarna i analiza wyników

Skład mieszaniny reakcyjnej PCR sekwencyjnego

-oczyszczona matryca po PCR preparatywnym

-jeden starter

-mieszanina dNTP i ddNTP znakowanych fluorescencyjnie

-polimeraza

-bufor

-H2O

Zastosowanie sekwencjonowania

-umożliwia bezpośrednie szukanie mutacji:

Substytucji

Małych insercji

Małych delecji

-dostarcza wielu cennych informacji o strukturze i funkcji genów

-znajomość pełnej sekwencji DNA badanych organizmów umożliwia zrozumienie molekularnych mechanizmów ich funkcjonowania i ewolucji

PIROSEKWENCJONOWANIE

Metoda sekwencjonowania DNA w czasie rzeczywistym. Główną zasadą metody jest wykorzystanie pirofosforanu (PPi) uwalnianego podczas syntezy DNA. W Wyniku kaskady reakcji enzymatycznych dochodzi do emisji światła, którego intensywność zależy od ilości uwolnionego pirofosforanu, a tym samym liczby wbudowanych nukleotydów.

PCR preparatywny - jeden starter znakowany biotyną

PCR sekwencyjny zachodzi już w pirosekwenatorze

W metodzie tej wykorzystano jednocześnie działanie czterech enzymów, są to:

-polimeraza DNA uwalnia pirofosforan (PPi) podczas wstawiania kolejnych nukleotydów do syntetyzowanej nici.

-sulfurylaza przekształca uwolniony pirofosforan w ATP z wykorzystaniem adenozyno-5'-fosfosiarczanu (APS)

-lucyferaza katalizuje reakcję przemiany lucyferyny (przy udziale tlenu i ATP) dając oxylucyferynę, CO2, AMP, PPi i światło, którego natężenie jest rejestrowane

-apiraza rozkłada dNTP do dNDP, dNMP i fosforanu. W tej reakcji nie ma substratu żadnego innego oprócz dNTP.

ZALETY:

-szybkość

-wydajność

-powtarzalność

WADY:

-wysokie koszty aparatury

-wysokie koszty odczynników

-brak możliwości analizy długich sekwencji genomowych

Wykorzystanie:

-genotypowanie powstałych wcześniej polimorfizmów (głównie SNP)

-oznaczanie patogenów

-wykrywanie i charakteryzowanie mutacji

-oznaczania metyzacji miejsc CpG

-przeszukiwanie i charakteryzowanie bibliotek cDNA

NGS (next generations seguencing)

-sekwencjonowanie nowej generacji zrewolucjonizowało analizę DNA

-NGS opiera się na resekwencjonowaniu

-odczytane fragmenty sekwencji nukleotydów składa się w jedną całość i porównuje się do sekwencji wzorcowej

W pierwszym etapie analizowany DNA poddaje się fragmentacji a do powstałych fragmentów przyłącza się krótkie znakowane adaptory.

Zmodyfikowane fragmenty DNA są unieruchomione na specyficznym nośniku.

Kolejnym etapem jest powielanie DNA i właściwe sekwencjonowanie z zastosowaniem reakcji polimerazy, pirosekwencjonowania lub reakcji ligazy w zależności od wybranej platformy NSG

Metoda wydajna, szybka i relatywnie tania w porównaniu z sekwencjonowaniem Sangera, niestety mało precyzyjna!

Zasadniczo NGS w nauce i diagnostyce znajduje zastosowanie do:

-sekwencjonowania całych genomów

-sekwencjonowania wyłącznie eksonów

ASA-PCR(ang. allele specific amplification)

Technika umożliwiająca wykrywanie mutacji przy pomocy specyficznych oligonukleotydów. Oprócz starterów flankujących stosuje się starter w pełni komplementarny do allela z mutacją lub startery, z kórych jeden jest w pełni komplementarny do allela z mutacją a drugi do allela niezmutowanego. Startery są tak zlokalizowane, że w wyniku PCR powstają produkty różniące się długością w zależności od genotypu użytej próbki DNA.

Amplifikacja allelo-specyficzna jest metodą wykorzystywaną do wykrywania polimorfizmu alleli oraz istnienia punktowych mutacji.

Podstawą tej techniki jest założenie, że nie komplementarność nukleotydów przy końcu 3' jednego lub obu stosowanych primerów zapobiega elongacji końca 3' startera przez polimerazę Taq.

Wydajna inicjacja syntezy DNA w takim PCR jest determinowana przez sekwencję ostatniego lub dwóch ostatnich nukleotydów na końcu 3'.

Jeśli są one komplementarne do matrycy, to badane allele są wydajnie amplifikowane, a przy braku komplementarności dla innych alleli, amplifikacja ich jest zahamowana.

Zastosowanie: Wykrywanie znanych mutacji. Wykrywanie sprzężonych z chorobą genów np. w nowotworach układu krwiotwórczego:

-w diagnostyce mastocytozy, AML oraz GIST (mutacje punktowe w genie c-KIT)

-w nowotworach mieloproliferacyjnych (mutacje w genach MPL oraz JAK2)

Badania zasad powstawania oporności przeciw chemioterapeutykom u mikroorganizmów,

Badania powiązań genetycznych,

Wyjaśnienia mechanizmu badanej choroby.

Real-time PCR (PCR w czasie rzeczywistym)

Metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji w czasie rzeczywistym. Wraz z przybywaniem produktów PCR wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor. Odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze komputera.

Monitorowanie jest możliwe dzięki znakowaniu starterów, sond oligonukleotydów lub amplikonów cząstkami zdolnymi do fluorescencji. Sygnał zależny od ilości produktu w każdym cyklu i zostaje wzmocniony, kiedy ilość specyficznego amplikonu wzrasta.

Analiza ilościowa poziomu ekspresji genu oparta jest na wykorzystaniu kontroli endogennych. Kontrola endogenna zwana jest inaczej genem referencyjnym lub kontrolą wewnętrzną.

Dzieląc poziom ekspresji transkryptu, uzyskany dla badanego genu, przez poziom ekspresji kontroli endogennej otrzymujemy znormalizowaną wartość, niezależną od wyjściowej ilości dodanej do analizy matrycy.

Zastosowanie: Pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w materiałach klinicznych, u możliwia monitorowanie postępów leczenia (określenie wyjściowego poziomu wiremii lub bakteriemii jest wskazaniem koniecznym do rozpoczęcia właściwego leczenia).

BARWNIKI

    1. niespecyficzne:

      1. bromek etydyny, jodek propidyny, czy najbardziej popularny: SYBR Greek

      2. emitują one światło o określonej dłogości po związaniu się z dwuniciowym DNA, a amplifikacja docelowej sekwencji zachodzi jedynie dzięki obecności specyficznych starterów forward i reverse.

    2. Specyficzne:

      1. Specjalnie zaprojektowane i zsyntetyzowane dla danej sekwencji

      2. Sondy wyznakowane są fluorescencyjnie

      3. Podczas reakcji dochodzi do przeniesienia energii zaabsorbowanej przez jeden fluorochrom (reporter) na drugi, który emituje światło o innej długości (np. HybProbes) lub dochodzi do wygaszenia emisji fluorochromu przez związek wygaszający (np. TaqMan)

Nested-PCR (PCR gniazdowy)

Stosowane są dwie pary starterów: zewnętrzna (komplementarna do końców poszukiwanej sekwencji) i wewnętrzna (przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do pierwszej pary starterów). Produkt powstały po amplifikacji z pierwszą parą starterów poddaje się kolejnej amplifikacji z druga parą. Zapewnia to większą specyficzność metody. Reakcja amplifikacji odbywa się w dwóch etapach:

  1. pierwsza amplifikacja z zastosowaniem pierwszej pary starterów (położonych bardziej zewnętrznie)

  2. produkty powstałe w fazie pierwszej (preegzystujące produkty amplifikacji), stają się następnie matrycą dla wewnętrznej pary primerów (położonej bardziej wewnętrznie - internal primers).

W przypadku, gdy niemożliwe jest zastosowanie dwóch różnych par starterów specyficzność i wrażliwość reakcji można sprawdzić poprzez przeprowadzenie tzn. semi-nested PCR. Metoda ta polega na użyci jednego primera wewnętrznego; współdziałającego ze starterem charakterystycznym dla pierwszego etapu. Zwiększa to wrażliwość metody i jednocześnie nie obniża jej specyficznośći.

Zastosowanie: Szybka diagnostyka zakażeń wirusowych. Kontrola specyficzności amplifikacji matrycy. Duża czułość metody wykorzystywana jest w monitorowaniu choroby resztkowej w diagnostyce białaczek (RT-PCR)

PCR multipleks

Metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów DNA, różniących się wielkością, co w praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie reakcyjnej kilku par starterów.

Zastosowanie: Jednoczesna amplifikacja kilku regionów jednego lub kilku genów. W jednej reakcji uzyskać można nawet 13 amplikonów. Wykrywanie delecji powodujących występowanie chorób dziedzicznych związanych z chromosomem X (DMD, BMD). Analiza występowania i rozróżniania patogenó chorobotwórczych. Często w diagnostyce chorób genetycznych i nowotworów „multiplet PCR” jest pierwszym etapem dalszych badań, takich jak multiplet HD czy multiplet SSCP.

Mutacje genowe:

Mutacje jako skutek braku naprawy replikacji DNA:

Mutacje spontaniczne:

Mutacje indukowane:

Mutacje fizyczne:

Mutacje jako skutek braku naprawy replikacji DNA;

Błąd replikacji powoduje powstanie niedopasowania nukleotydu (mismatch ) ale się on utrwali, powiela się dalej jako zmieniona ale komplementarna para nukleotydów.

Polimeraza DNA działa tak by nie popełnić błędów.

Poślizg replikacyjny

Rodzaje mutacji

  1. Duże zmiany genu

  1. Mutacje punktowe

  1. Mutacje transkrypcyjne

  2. Mutacje translacyjne

  3. Mutacje RNA

Efekt dużych zmian genu i mutacji punktowych

Efekt mutacji

Skutki mutacji genowych

Mutacja a funkcja białek

II. Metody badań molekularnych

Enzymy restrykcyjne

Typ I

Wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawierające aktywność metylazy i restryktazy . Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, bliżej nieokreślonym miejscu. Z tego powodu nie mają większego zastosowania praktycznego.

Typ II

Przecinają DNA w zdefiniowanych miejscach w obszarze rozpoznanej sekwencji lub w jej pobliżu. Składa się z podjednostek polipeptydowych. Rozpoznaje sekwencje symetryczne.

Typ IIs

Zbliżone do typu II, przecinają z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która jest asymetryczna

Typ III

rozpoznaje dwie sekwencje nukleotydów w pobliżu siebie i dopiero wtedy dochodzi do cięcia, bez znaczenia praktycznego, za duże wymagania

Typ IV

zbliżony do typu II, zawiera aktywność metylazy, peptydazy (nie mogą działać jednocześnie), przycinają w zdefiniowanym obszarze poza sekwencją rozpoznawalną, enzym przyłącza się w zależności od substratu

Enzymy restrykcyjne rozpoznają tą samą sekwencję DNA, a przecinające DNA w odmiennych miejscach nazywamy neoschizomerami

Enzymy restrykcyjne różniące się sekwencją swojego polipeptydu i pochodzące z odmiennych organizmów, a rozpoznające tą samą sekwencję DNA i przecinające DNA w takim samym miejscu nazywamy izoschizomerami. Interesującą własnością izoschizomerów jest to, że pomimo tej samej specyficzności substratowej z reguły mają zupełnie odmienną strukturę trzeciorzędową co wskazuje na ich osobne pochodzenie ewolucyjne

Podział enzymów restrykcyjnych wg rodzaju wytwarzanych końców.

Końce te są komplementarne do podobnych tworzonych w innych.

Zastosowanie:

Ligazy - trwale łączą pocięte fragmenty

Główne kierunki analizy DNA

Genomy DNA

↓ ↓

Amplifikacja DNA hybrydyzacja molekularna

↓ ↓

amplifikacja in vitro - southern Blot

PCR - northern Blot

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Tm- jest to tzw. odwracalny punkt topnienia - temperatury przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i tworzącymi się w wyniku renaturacji

Kompleksy:

Sondy molekularne

Zalety sond syntetycznych

Znakowana najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie radioizotopu w miejsce niepromieniotwórczych at. fosforu

W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych struktur hybrydy jest bezpośrednia autoradiografia.

Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórczego znakowania sond molekularnych polegające na dołączeniu biotyny lub oligoksygeniny w procesach dwustopniowych

Hybrydyzacja Southern

Etapy:

  1. Izolacja i oczyszczenie DNA z komórek lub tkanek

  2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami

  3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA wg wielkości i ich denaturacja in situ

  4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy

  5. Związane DNA z filtrem w temperaturze 80oC lub poprzez naświetlania UV

  6. Hybrydyzacja z sondą

  7. Ustalenie położenia fragmentów do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii reakcji barwnych lub fluoroscencji

Zastosowanie H. S. umożliwia:

Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może ustąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które powodują zanikanie bądź pojawienia się miejsc restrykcyjnych

Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach dziedzicznie uwarunkowanych chorób jak również w wykrywaniu mutacji somatycznych w badaniach genetycznych.

Hybrydyzacja Northern

Jest to metoda służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych genów (badanie ekspresji genu).

Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern

Sonda daje sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA

DNA- fingerprinting

Występujących w eukariotycznym DNA sekwencji powtórzonych cechujących się dużą zmiennością, nadaje DNA poszczególne osobnicze cechy indywidualne

Metodyka

Zastosowanie:

Więcej niż jeden prążek niezidentyfikowany - wykluczenie


Wyszukiwarka