ENZYMY

Jednostki aktywności enzymów

• konwencjonalne - ustalane przez autorów metod

• jednostka aktywności enzymatycznej (katal = kat) - jest to aktywność, która przekształca 1 mol substratów w czasie 1 sekundy (mkat, nkat, pkat)

• bezwzględna międzynarodowa jednostka standardowa enzymu (U lub IU) - jest to aktywność, która przekształca 1 mmol substratu (lub 1 mmol odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30°C i w optymalnych warunkach (szczególnie pH i stężenia substratu) (U, mU, kU)

1 kat = 6∙10⁷ U

1 U = 16,67∙10^-9 kat = 16,67 nkat

• w przypadku takich substratów jak białko, wielocukier lub inna substancja, w której więcej niż jedno wiązanie ulega reakcji określenie „1 mmol substratu” zastępuje się wyrażeniem „1 mmol odpowiednich grup” - miarą szybkości reakcji jest liczba rozłożonych wiązań peptydowych czy glikozydowych, a nie liczba całkowicie zhydrolizowanych cząsteczek

• w przypadku reakcji pomiędzy dwiema identycznymi cząsteczkami za podstawę przyjmuje się nie 1 mmol, a 2 mmol (e) danej substancji

• aktywność enzymów w płynach biologicznych wyraża się w ilości jednostek standardowych na 1000 mL płynu

Kinetyka reakcji enzymatycznej - enzymy allosteryczne

Enzymy oligomeryczne:

• przyłączenie substratu do jednej podjednostki powoduje zmiany konformacyjne w pozostałych podjednostkach = zwiększa się powinowactwo substratu do ich centrów aktywnych

Enzymy allosteryczne:

• przyłączenie ligandu (efektora allosterycznego) do centrum allosterycznego w podjednostce regulatorowej enzymu powoduje zmianę konformacji w podjednostkach z centrami aktywnymi = zwiększa/zmniejsza się ich powinowactwo do substratu

Kinetyka reakcji w przypadku enzymów oligomerycznych/allosterycznych ma wykres sigmoidalny!

Metody analityczne stosowane do oznaczeń aktywności enzymów

- analiza klasyczna (np. miareczkowanie)

- analiza instrumentalna - metody spektrofotometryczne, polarymetryczne, refraktometryczne, potencjometryczne itd.

Pomiar bichromatyczny

- przy dwóch długościach fali

- pozwala na eliminowanie wpływu substancji

towarzyszących i zanieczyszczeń

Metody oznaczania aktywności enzymów

• metody statyczne

- dwupunktowe - porównanie ilości substratu lub produktu w 2 punktach czasu: w czasie zero i po zakończeniu inkubacji

- należy zapewnić warunki reakcji aby zapewnić stałą szybkość reakcji przez cały czas inkubacji

• metody kinetyczne

- pomiar zmian stężenia substratu lub produktu w jednostce czasu, w początkowym okresie reakcji

- wymagają ciągłej rejestracji zmian stężeń badanego składnika w czasie (pomiar wielopunktowy lub ciągły)

STOSOWANE UKŁADY POMIAROWE

1. Test optyczny

2. Analogi naturalnych substratów

• fosfatazy

- p-nitrofenylofosforan (pNPP)

- a-naftylofosforan

• amylaza

- p-nitrofenylo-D-maltoheptozyd (pNP-G7)

- 2-chloro-p-nitrofenylo-aD-maltotriozyd (CNP-G3)

3. Substancje, z których pod wpływem enzymów powstają barwne produkty reakcji

• 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)

4. Przeciwciała (oznaczanie stężenia białka) - metody immunoturbidymetryczne, radioimmunologiczne, immunoenzymatyczne

Test optyczny prosty - enzym, którego aktywność oznaczamy wykorzystuje NAD⁺, NADP⁺, NADH+H⁺ lub NADPH+H⁺

Przykład: oznaczanie aktywności LDH

LDH

pirogronian + NADH+H⁺ <-> mleczan + NAD⁺

spadek ekstynkcji na minutę jest miarą aktywności LDH (dehydrogenazy mleczanowej)

Test optyczny z reakcją wskaźnikową

- enzym, którego aktywność oznaczamy nie wykorzystuje koenzymów NAD⁺, NADP⁺, NADH+H⁺ lub NADPH+H⁺

- jego aktywność oznacza się przez sprzężenie ich działania z reakcją wskaźnikową podczas której wykorzystywane są te koenzymy

Przykład: oznaczanie aktywności ALT

ALT

L-alanina + a-ketoglutaran <-> L-glutaminian + pirogronian

LDH

pirogronian + NADH+H⁺ <-> mleczan + NAD⁺

Test optyczny z reakcją pomocniczą i wskaźnikową

- gdy nie można oznaczyć końcowego produktu reakcji bezpośrednio za pomocą reakcji wskaźnikowej należy wprowadzić dodatkowy, pomocniczy układ enzymatyczny

Przykład: oznaczanie aktywności CK

CK

kreatyna + ATP <-> fosfokreatyna + ADP

kinaza pirogronianowa

ADP + fosfoenolopirogronian <-> pirogronian + ATP

LDH

pirogronian + NADH+H⁺ <-> mleczan + NAD⁺

! W teście optycznym możemy wykonywać oznaczenia przy 340 nm (głównie), 334 nm lub 365 nm!

Oznaczanie aktywności enzymu metodą kinetyczną

A/min V_K

E [U/L] = ∙ 10⁶

 ∙ d V_A

A/min - zmiana absorbancji w ciągu 1 minuty

 - współczynnik molowy ekstynkcji

V_K - objętość końcowa mieszaniny reakcyjnej

V_A - objętość materiału badanego

d - długość drogi optycznej

STANDARYZACJA METOD ENZYMATYCZNYCH

Zasady standaryzacji oznaczeń aktywności katalitycznej w surowicy ludzkiej opracowane przez IFCC dla:

- kinazy kreatynowej (CK)

- aminotransferazy asparaginianowej (AST)

- aminotransferazy alaninowej (ALT)

- g-glutamylotransferazy (GT/GGT)

- fosfatazy alkalicznej (ACP)

Podstawa standaryzacji - aktywność enzymów jakie uzyskiwano w materiałach biologicznych za pomocą przyjętych przez IFCC procedur wzorcowych.

Procedury wzorcowe (referencyjne)

- dobrze zdefiniowane metody manualne oznaczania aktywności enzymów, które cechują się linową zależnością wyników pomiaru od stopnia rozcieńczenia materiału

- dla których w badaniach porównawczych wykazano najmniejszą zmienność międzylaboratoryjną w zakresie aktywności występującej w osoczu/surowicy prawidłowym i patologicznym

- opracowano nowe metody robocze do oznaczania enzymów i dostosowano je do nowoczesnych analizatorów biochemicznych = metody standaryzowane wobec wzorca IFCC

- stosowanie międzynarodowych certyfikowanych wzorców aktywności enzymów (MCRM) do kalibracji metod roboczych

Podstawowe warunki standaryzacji

• aktywność enzymu musi być stała w czasie oznaczania

• mierzona aktywność enzymu musi być proporcjonalna do rozcieńczenia próbki

• zakres roboczy metody musi odpowiadać zakresowi wielkości aktywności enzymu mierzonej w laboratorium

• reakcję enzymatyczną należy zawsze prowadzić w temperaturze 37°C

Badanie aktywności enzymatycznej

• w tkankach

• w płynach ustrojowych

- osocze lub surowica

- płyn mózgowo-rdzeniowy

- mocz

Cele diagnostyki enzymologicznej

• wykorzystanie enzymów - wskaźników schorzeń związanych z uszkodzeniem tkanek/narządów

• stwierdzenie defektów enzymatycznych

Oznaczenia enzymów wykonujemy w celu:

- rozpoznawania chorób

- monitorowania przebiegu chorób

- prognozowania (np. CK>600 U -> ok. 50% śmiertelności)

Podział enzymów w zależności od sposobu ich przedostawania się do przestrzeni pozakomórkowej

1. Enzymy komórkowe (wskaźnikowe) - uwalniane w wyniku uszkodzenia błony komórkowej lub rozpadu komórki

- mikrosomalne - GGT

- lizosomalne - ACP

- mitochondrialne - AST, CK, GLD

- cytoplazmatyczne - ALT, LDH, AST, CK

- błony plazmatyczne - ALP, 5'-NT, GGT

2. Enzymy sekrecyjne - wydzielane do krążenia, gdzie spełniają swoją funkcję

- czynniki krzepnięcia i fibrynolizy

- acylotransferaza lecytyna:cholesterol (LCAT)

- cholinesteraza ChE (pseudocholinesteraza)

3. Enzymy ekskrecyjne - produkowane przez gruczoły i wydzielane do śliny, światła przewodu pokarmowego, płynu nasiennego itp.

- amylaza

- lipaza

Stężenie enzymów w osoczu/surowicy - wypadkowa procesów:

• szybkości syntezy i sekrecji

• obrotu komórkowego

• aktywności mięśniowej

• uszkodzenia komórek

- fizycznego (oparzenia, zmiażdżenia)

- chemicznego (rozpuszczalniki organiczne,

detergenty, pestycydy, metale ciężkie)

- biologicznego (infekcje bakteryjne i wirusowe)

- wtórne (w wyniku choroby np. nowotworowej)

• eliminacji białek z łożyska naczyniowego

- mocz (białka niskocząsteczkowe)

- degradacja w komórkach

Enzymy w moczu

1. Enzymy występujące w osoczu, ale nie produkowane w nerce - niskocząsteczkowe enzymy trawienne np. amylaza

2. Enzymy nerkowe

- frakcja nerkowa fosfatazy alkalicznej

- N-acetylo-b-D-glukozaminidaza (NAG)

3. Enzymy występujące zarówno w osoczu jak i w nerce - ALT, AST, GGT, CK, ChE, LDH

Badanie aktywności enzymatycznej

• w tkankach

• w płynach ustrojowych

- osocze lub surowica

- płyn mózgowo-rdzeniowy

- mocz

• płynach patologicznych

- wysięki

-przesięki

Cele diagnostyki enzymologicznej

• wykorzystanie enzymów - wskaźników schorzeń związanych z uszkodzeniem tkanek/narządów

• stwierdzenie defektów enzymatycznych

Oznaczenia enzymów wykonujemy w celu:

- rozpoznawania chorób

- monitorowania przebiegu chorób

- prognozowania

Etapy postępowania diagnostycznego

Patologiczna

aktywność enzymów

Informacje

symptomatologiczne

(objawy chorobowe)

identyfikacja określenie natury monitorowanie

lub wykluczenie i wielkości zmian

zmian patologicznych obszaru uszkodzenia

Stężenie enzymów w osoczu/surowicy - wypadkowa procesów:

• szybkości syntezy i sekrecji

• obrotu komórkowego

• aktywności mięśniowej

• uszkodzenia komórek

- fizycznego (oparzenia, zmiażdżenia)

- chemicznego (rozpuszczalniki organiczne,

detergenty, pestycydy, metale ciężkie)

- biologicznego (infekcje bakteryjne i wirusowe)

- wtórne (w wyniku choroby np. nowotworowej)

• eliminacji białek z łożyska naczyniowego

- mocz (białka niskocząsteczkowe)

- degradacja w komórkach

Enzym	Główne źródła enzymu we krwi	Zastosowanie kliniczne
Aminotransferaza alaninowa	Wątroba	Chroroby miąższowe wątroby
Aminotransferaza asparaginianowa	Wątroba, mięśnie szkieletowe, serce, erytocyty	Choroby miąższowe wątroby, choroby mięśni
Fosfataza alkaliczna	Wątroba, kości, błona śluzowa jelit, łożysko	Choroby kości, choroby dróg żółciowych
Amylaza	Trzustka, ślinianki	Choroby trzustki
Cholinesteraza	Wątroba	Zatrucie związkami fosforoorganicznymi, nadwrażliwość na suksametonium, choroby miąższowe wątroby
Kinaza kreatynowa	Mięśnie szkieletowe, serce	Choroby mięśni (zawał serca)
γglutamylotransferaza	Wątroba	Choroby dróg żółciowych, marker nadużycia alkoholu
Dehydrogenaza mleczanowa	Serce, wątroba, mięśnie szkieletowe, erytrocyty, płytki, węzły chłonne	Hemoliza, choroby miąższu wątrobowego, marker nowotworowy
Lipaza	Trzustka	Choroby trzustki
5'-Nukleotydaza	Wątroba	Choroby dróg żółciowych

KINAZA KREATYNOWA (CK)

EC 2.7.3.2; N-fosfotransferaza ATP:kreatyna

• katalizuje odwracalną reakcję fosforylacji kreatyny przez ATP

• niestabilny w osoczu - traci aktywność na skutek utleniania reszt sulfhydrylowych w centrum aktywnym

• aktywość w tkankach

- największa: mm. szkieletowe (2500 U/g białka) i serce (550 U/g białka)

- wątroba i erytrocyty - praktycznie brak aktywności

• dimer; 82 kDa (2 x 41 kDa)

- podjednostka B (loci w 14 chromosomie)

- podjednostka M (loci w 19 chromosomie)

Izoenzymy CK - cytoplazmatyczne:

• CK-1 (CK-BB)

• CK-2 (CK-MB)

• CK-3 (CK-MM)

Izoenzym CK-Mt (locus w chromosomie 15) - występujący w przestrzeni pomiędzy wewnętrzną i zewnętrzną błoną mitochondrialną. W sercu jego aktywność stanowi do 15% aktywności całkowitej.

Tkanka	% Izoenzymów
		CK-BB	CK-MB	CK-MM
Mięśnie szkieletowe	<1	1-3	97-99
Serce	<1	22	78
Mózg	100	0	0
Mięśnie gładkie: przewód pokarmowy pęcherz moczowy	96 92	1 6	3 2

Makro-CK - forma makromolekularna CK stwierdzana okresowo u ok. 6% hospitalizowanych pacjentów w niewielkim stopniu może zwiększyć aktywność CK w surowicy. Interferują z pomiarem CK-MB (immunoinhibicja).

Typy makro-CK:

- typ 1 - kompleks CK (najczęściej CK BB) z immunoglobulinami (często IgG). Częściej występuje u kobiet po 50 roku życia.

- typ 2 - oligomer CK-Mt. Występuje przeważnie u dorosłych osób z poważnymi schorzeniami nowotworowymi lub chorobami wątroby oraz u dzieci w stanach ciężkich.

Podjednostka M posiada na swoim C-końcu resztę lizynową, ale we krwi występują izoformy powstające w wyniku działania karboksypeptydaz:

- karboksypeptydazy B (EC 3.4.17.2)

- karboksypeptydazy N (EC 3.4.17.3)

Izoformy CK-MM₃:

- CK-MM₁ - bez jednej reszty lizynowej

- CK-MM₂ - bez obydwu reszt lizynowych

Izoforma CK-MB₂:

- CK-MB₁ - podjednostka M bez reszty lizynowej

CK - duży wzrost aktywności:

• wszystkie typy mięśniowej dystrofii

• wirusowe zapalenie mięśni

• zapalenie więlomięśniowe

W chorobach mięśni pochodzenia neurogennego:

- myasthenia gravis (nużliwość mięśniowa)

- stwardnienie rozsiane

- poliomyelitis (choroba Heinego-Medina)

- parkinsonizm

aktywność CK w surowicy jest prawidłowa

• ostra rabdomioliza

• zespoły zmiażdżeniowe

• złośliwa hypertermia

• zawał mięśnia sercowego (CK i CK-MB)

CK - umiarkowany wzrost aktywności (>5-krotny):

• zabiegi chirurgiczne i injekcje

• inne choroby mięśnia sercowego

- zabieg wykonania bypass(ów)

- przeszczepienie serca

- zapalenie mięśnia sercowego

- zator płucny

• poród

• aktywność CK w surowicy wykazuje korelację z aktywnością gruczołu tarczowego - u ok. 60% pacjentów z hypotyreozą stwierdza się przeciętnie 5-krotny wzrost aktywności CK

CK - niewielki wzrost aktywności

• ćwiczenia fizyczne i urazy mięśniowe (także CK-MB)

• miopatia uremiczna (także CK-MB)

• noworodki (szczególnie z uszkodzeniem mózgu lub niską masą urodzeniową) - podwyższona aktywność CK w surowicy związana jest z obecnością CK-BB

CK-BB

• nie przechodzi przez barierę krew-mózg

• może być wydzielana ektopowo przez niektóre typy nowotworów

Zawał mięśnia sercowego

• CK-MB₂/CK-MB₁

- ok. 0,47 w 2 godzinie od wystąpienia objawów

- 0,6 - 1,5 po upływie następnych 2 godzin

Brak zmian CK-MB₂/CK-MB₁ w 95% wyklucza zawał mięśnia sercowego

• CK-MB (wzrost do 20-30% całkowitej aktywności CK)

- wzrost po 3-6 godzinach od wystąpienia zawału

- maksimum po 12-24 godzinach

• CK-MB_mass

≥ 10 mg/L potwierdza zawał serca (8-10-krotny wzrost ponad poziom referencyjny)

- ma znaczenie prognostyczne dla wystąpienia zawału u osób z dusznicą bolesną

- jest wskaźnikiem reperfuzji w przebiegu leczenia zawału:

powodzenie terapii: znaczny wzrost w 4-6 godzinie od jej rozpoczęcia, a następnie znaczne zmniejszenie

niepowodzenie terapii - utrzymujący się wysoki poziom po 6 godzinach od jej wdrożenia

Oznaczanie aktywności CK - metoda spektrofotometryczna (test optyczny)

Optymalizacja metody - dodanie:

• N-acetylocysteiny

• EDTA - związanie jonów Ca⁺² i stabilizacja mieszaniny reakcyjnej

• adenozynopentafosforan - zahamowanie kinazy adenylanowej

• wg procedury IFCC pomiar w 37°C

Przechowywanie materiału:

• 8 godzin w temperaturze pokojowej

• 48 godzin w 4°C

• 1 miesiąc w -20°C

• niewielkiego stopnia hemoliza jest dopuszczalna

• większa hemoliza jest niedopuszczalna (zwiększa się ilość enzymów i intermediatów uwalnianych z erytrocytów = G6PD, AK, ATP)

Aktywność CK w surowicy - zależy od:

• płci

• wieku

• masy mięśniowej

• aktywności fizycznej

• rasy

Zakres referencyjny aktywności CK (rasa kaukaska):

• mężczyźni 46 - 171 U/L

• kobiety 34 - 145 U/L

Oznaczanie izoenzymów CK:

• metoda elektroforetyczna

• metody immunochemiczne - oznaczanie CK-MB

a) technika immunoinhibicji podjednostki M (przeciwciała) w CK-MM i w CK-MB i pomiar aktywności podjednostki B

Metoda zakłada nieobecność CK-BB i innych źródeł interferencji np. makro-CK!

b) technika kanapkowa z zastosowaniem przeciwciał rozpoznających dimer MB (zakres referencyjny dla mężczyzn 5 mg/L)

DEHYDROGENAZA MLECZANOWA (LD; LDH)
EC 1.1.1.27 Oksydoreduktaza L-mleczan:NAD

• enzym cytoplazmatyczny - obecny we wszystkich komórkach

• 134 kDa

• heterotetramer - 4 podjednostki

• 2 rodzaje łańcuchów polipeptydowych

- typ M (A) - „mięśniowy” (chromosom 11)

- typ H (B) - „sercowy” (chromosom 12)

• 5 izoenzymów:

- LDH1 (HHHH; H₄)

- LDH2 (HHHM; H₃M)

- LDH3 (HHMM; H₂M₂)

- LDH4 (HMMM; HM₃)

- LDH5 (MMMM; M₄)

Rozmieszczenie narządowe izoenzymów LDH

• mięsień sercowy, nerki, erytrocyty - głównie LDH1 i LDH2

• wątroba, mięśnie szkieletowe - głównie LDH4 i LDH5

• śledziona, płuca, węzły chłonne, leukocyty, płytki - źródło różnych izoenzymów LDH

W osoczu osób zdrowych dominują LDH1 i LDH2

LDH1/LDH2 ≈ 0,76

Zawał mięśnia sercowego

• zwiększenie aktywności LDH1 w surowicy

• odwrócenie stosunku LDH1/LDH2 > 1,0

• wzrost aktywności LDH po ok. 20 godzinach od wystąpienia bólu zamostkowego

• maksimum (2-10-krotne przekroczenie wartości referencyjnych) - po upływie 2-2,5 doby

• HBDH

Oznaczanie aktywności LDH

• test optyczny prosty - reakcja przemiany mleczanu do pirogronianu jest metodą referencyjną (IFCC)

- surowica powinna być oddzielona jak najszybciej (płytki)

- nie powinno być śladów hemolizy (erytrocyty)

- izoenzymy wykazują zróżnicowaną wrażliwość na niską temperaturę (-20°C) - próbki powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej (do 3 dni bez utraty aktywności)

Zakres referencyjny:

- dorośli 125 - 220 U/L

- dzieci 180 - 360 U/L

Nieprawidłowe aktywności LDH

Choroba	LDH1	LDH2	LDH3	LDH4	LDH5
Zawał m. sercowego	+	+
Zawał płuca				+	+
Wirusowe zapalenie wątroby				+	+
Toksyczne zapalenie wątroby				+	+
Białaczka granulocytowa		+	+
Zapalenie trzustki		+	+
Niedokrwistość megaloblastyczna	+	+
Niedokrwistość hemolityczna	+	+
Nowotwory	+

Izoenzymy - rozdział metodą elektroforetyczną

Zakresy referencyjne w surowicy:

LDH1 14-26%

LDH2 29-39%

LDH3 20-26%

LDH4 8-16%

LDH5 6-16%

AMINOTRANSFERAZY

ALT: alaninowa (EC 2.6.1.2 Transferaza L-alanina:2-oksoglutaran)

AST: asparaginianowa (EC 2.6.1.1 Transferaza L-asparaginian:2-oksoglutaran)

• katalizują reakcję przeniesienia grupy aminowej

• równowaga reakcji przesunięta w kierunku tworzenia alaniny/asparaginianu

• PLP (fosforan 5'-pirydoksalu) - koenzym

• ALT - występuje w cytoplazmie

• AST - występuje w cytoplazmie i mitochondrium (5-10% aktywności AST w surowicy osób zdrowych)

Znaczenie kliniczne aminotransferaz

Wzrost aktywności:

• choroby wątroby:

- wirusowe zapalenie wątroby

- alkoholowe zapalenie wątroby

- toksyczne zapalenie wątroby

- marskość wątroby

- przerzuty do wątroby

- inne

• zawał mięśnia sercowego

• dystrofie mięśniowe

• inne choroby mięśniowe (także pochodzenia neurogennego)

• niedokrwistość hemolityczna

Wskaźnik de Ritisa (AST/ALT)

• prawidłowy > 1,0

• ostre wirusowe zapalenie wątroby 0,1 - 1,0

• przewlekłe zapalenie wątroby 0,9 - 4,0

• cholestaza pozawątrobowa 0,2 - 2,0

• marskość wątroby 0,6 - 1,8

• metastaza do wątroby 0,9 - 5,0

• zawał serca (2 doba) > 2,0

Metody oznaczania aminotransferaz

• test optyczny z reakcją wskaźnikową

• procedura referencyjna z pomiarem w 37°C

• PLP - rekomendowany przez IFCC

• w surowicy nie powinno być śladu hemolizy

Przechowywanie materiału:

• AST w surowicy jest stabilna przez 48 godzin w tempereturze 4°C

• ALT w surowicy powinna być oznaczona w dniu pobrania (traci aktywność w temp. 25°C, 4°C, -20°C), w celu zachowania aktywności surowice powinny być zamrożone

(-70°C)

Zakresy referencyjne - aktywność w surowicy:

AST

- mężczyźni do 35 U/L

- kobiety do 31 U/L

ALT

- mężczyźni do 45 U/L

- kobiety do 34 U/L

GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA (GGT)

EC 2.3.2.2 Glutamylotransferaza peptyd g-glutamylowy:aminokwas

• związana z błonami plazmatycznymi komórek

- mikrosomy

- w błonach komórkowych (transport aminokwasów lub peptydów w poprzek błony)

• enzym działa wyłącznie na peptydy lub związki peptydopodobne zawierające końcową resztę γ-glutamylową (przyłączoną do reszty związku za pośrednictwem węgla γ)

Rozmieszczenie tkankowe GGT

• nerki - kanaliki proksymalne

• wątroba

• trzustka

• jelita

Znaczenie kliniczne GGT

Wzrost aktywności:

• choroby związane z zastojem w drogach odprowadzających:

- choroby wątroby i dróg żółciowych

- choroby trzustki

• indukcja lekami

- barbiturany, fenytoina, estrogeny

- alkohol (wskaźnik abstynencji - 2-5 tygodni)

• pierwotny rak wątroby

• przerzuty innych nowotworów do wątroby

Metody oznaczania GGT

• metoda kolorymetryczna - procedura rekomendowana przez IFCC:

- L-g-glutamylo-3-karboksy-4-nitroanilid (pochodna GGPNA) - donor

- glycyloglicyna - akceptor

- produkt - 5-amino-2-ntrobenzoesan (410 nm)

- pomiar w 37°C

Przechowywanie materiału:

GGT - stabilna, zachowuje aktywność w ciągu 1 miesięca w temperaturze 4°C i do roku w -20°C

Zakresy referencyjne - aktywność w surowicy

• dorośli

- mężczyźni do 55 U/L

- kobiety do 38 U/L

• noworodki (donoszone) 6-7-krotne wartości referencyjne dla dorosłych

• 5-7 miesięczne niemowlęta - wartości takie jak u dorosłych

FOSFATAZA ALKALICZNA (ALP)

EC 3.1.3.1 Zasadowa fosfohydrolaza monoestrów ortofosforanowych

• katalizuje hydrolizę wielu naturalnych i syntetycznych substratów (w środowisku alkalicznym)

• enzym jest związany z błonami

- na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej

- związany z białkami i fosfolipidami błonowymi

• Mg⁺², Co⁺², Mn⁺² - aktywatory

• Zn⁺² wchodzi w skład cząsteczki enzymu (metaloenzym)

• inhibitory: fosforany, borany, szczawiany, cyjanki

• bufory: obojętne (węglanowy, barbitalowy); hamujące (glicynowy, propyloaminowy); aktywujące (TRIS, dietanoloaminowy)

Rozmieszczenie tkankowe ALP

• błona śluzowa jelita cienkiego

• nerki - kanalik proksymalny (kręty)

• kości - osteoblasty

• wątroba

• łożysko

Izoenzymy i izoformy ALP

Locus

chromosom 1 chromosom 2

gen tkankowo gen ALP gen ALP gen ALP

-nieswoistej ALP komórek łożyskowej jelitowej

zarodkowych

warianty tkankowe nieprawidłowa ekspresja w nowotworach

nerki wątroba kości inne Nagao Regan Kasahara

Znaczenie kliniczne ALP

W osoczu osób zdrowych występują izoformy - wątrobowa, kostna i jelitowa (nie u wszystkich osób)

Fizjologiczny wzrost aktywności:

• u ciężarnych - izoenzym łożyskowy

• dzieci - izoforma kostna

• osoby z grupą krwi B i O po posiłku - izoenzym jelitowy

• kobiety w okresie menstruacji - izoenzym jelitowy

• doustne leki antykoncepcyjne - izoenzym jelitowy

Patologiczny wzrost aktywności

• choroby wątroby - izoforma wątrobowa

• pierwotne i wtórne choroby kości - izoforma kostna

- choroba Pageta

- osteomalacja

- krzywica

- osteoporoza postmenopauzalna

- nowotwory kości

• pierwotna i wtórna nadczynność przytarczyc - izoforma kostna

• nowotwory - produkcja ektopowa izoenzymów łożyskowego, jelitowego i komórek zarodkowych

Oznaczenia aktywności ALP

• metoda kolorymetryczna

- substrat fosforan 4-nitrofenylu (PNPP)

- produkt - jon 4-nitrofenoksydowy (405 nm)

- IFCC rekomenduje użycie buforu AMP (aminometylopropanolowego)

- rekomendowana temperatura oznaczenia 37°C

• surowica bez hemolizy

• na czczo (dieta ubogotłuszczowa)

Przechowywanie materiału:

• oznaczenie powinno być wykonane jak najszybciej (do 4 godzin od pobrania)

• podczas przechowywania w -70°C następuje stopniowe zmniejszanie aktywności (ok. 2% dziennie)

Oznaczanie izoenzymów i izoform ALP

Właściwości wykorzystywane w celu różnicowania izoenzymów i izoform:

• ruchliwość elektroforetyczna

• wrażliwość na czynniki denaturujące - temperatura (izoforma kostna), czynniki chemiczne

• wrażliwość na działanie selektywnych inhibitorów (mocznik - izofoma kostna; L-fenyloalanina - izoenzym jelitowy i łożyskowy)

• powinowactwo lektynowe

• właściwości immunochemiczne - indukowanie produkcji specyficznych przeciwciał

Zakresy wartości referencyjnych - aktywność ALP w surowicy

• dzieci do15 roku życia 54-369 U/L

• mężczyźni

od 20 do 50 roku życia 53-128 U/L

≥ 60 roku życia 56-119 U/L

• kobiety

od 20 do 50 roku życia 42-98 U/L

≥ 60 roku życia 53-141 U/L

5'-NUKLEOTYDAZA (5'-NT)

EC 3.1.3.5 Fosfohydrolaza 5'-nukleotydowa

• występuje w siateczce środplazmatycznej i w błonach komórkowych wielu komórek m.in. kanalików wątrobowych

• hydrolizuje wiązanie fosfomonoestrowe w AMP i GMP

• produkty - adenozyna/guanozyna i nieorganiczny fosforan

Znaczenie kliniczne 5'NT

Wzrost aktywności w chorobach dróg żółciowych z zastojem żółci (cholestazą)

Zakres referencyjny aktywności 5'NT

3-7 U/L (niezależny od płci)

Oznaczanie aktywności 5'NT

• metoda kolorymetryczna

- substrat - IMP

- produkt - inozyna -> hipoksantyna (fosforylaza nukleozydów purynowych) -> moczan (oksydaza ksantynowa) -> H₂O₂ -> utlenienie chromogenu (510 nm)

- oznaczenie w 37°C

Przechowywanie materiału:

• 5'NT w surowicy jest stabilna 4 dni w 4°C i 4 miesiące w

-20°C

CHOLINESTERAZA (ChE; PSEUDOCHOLINESTERAZA)

EC 3.1.1.8 Acylohydrolaza acylocholiny

Enzymy hydrolizujące acetylocholinę:

• Acetylocholinesteraza (AChE) (prawdziwa cholinesteraza, esteraza cholinowa I, EC 3.1.1.7) - występuje w:

- erytrocytach

- śledzionie

- płucach

- zakończeniach nerwowych

- substancji szarej w mózgu

• Acylocholinesteraza (ChE) (pseudocholinesteraza, esteraza cholinowa II, EC 3.1.1.8) - występuje w:

- wątrobie - skąd jest wydzielana do surowicy (enzym sekrecyjny)

- trzustce

- sercu

- substancji białej w mózgu

Znaczenie kliniczne ChE

Synteza enzymów pozostaje pod kontrolą kilku genów - klinicznie ważne są nietypowe warianty genetyczne (alleloformy) cholinesteraz o zmniejszonej aktywności do acetylocholiny

• najczęstszy fenotyp U/U - prawidłowa aktywność

• wariant atypowy A (homozygota)

- zmniejszona aktywność

- zwiększona oporność na inhibicję enzymu przez dibukainę (inhibitor kompetycyjny)

• wariant F

- nieco większa aktywność niż wariant A

- zwiększona oporność na inhibicję przez fluorki

• wariant S (niemy) - brak enzymu lub jedynie minimalna aktywność

Aktywność ChE stosuje się w celu:

• oceny czynności wątroby (zdolność do syntezy)

• monitorowania i diagnostyki zatruć związkami fosforoorganicznymi (nieodwracalne inhibitory)

• wykrycia pacjentów ze zmniejszona aktywnością (atypowymi formami enzymu), którzy mogą wykazywać przedłużoną reakcję na leki zwiotczające stosowane podczas zabiegów chirurgicznych (np. sukcynylocholinę)

- fenotypy najbardziej podatne na przedłużone porażenie mięśni oddechowych: A/A, A/S, F/F, F/S, S/S, A/F i niekiedy U/A

- oznacza się liczbę dibukainową i fluorkową (stopień hamowania aktywności ChE)

Oznaczanie aktywności ChE

• metoda kolorymetryczna

- substrat - ester acylotiocholiny (butyrylotiocholina)

- produkt - tiocholina -> bezbarwny chromogen DTNB -> pomiar przy 410 nm

- procedura referencyjna - pomiar w 37°C

• metody biologii molekularnej - oznaczenie genetycznych defektów

Przechowywanie materiału:

• enzym bardzo stabilny - zachowuje aktywność

- kilka tygodni w temperaturze 4°C

- kilka lat w temperaturze -20°C

Zakresy referencyjne aktywności ChE

• dorośli - fenotyp U/U

- kobiety 33-76 U/L

- mężczyźni 40-78 U/L

• noworodki - ok. ½ aktywności u osób dorosłych

• przez następne 3-6 lat życia następuje wzrost aktywności do wartości większych niż u dorosłych o ok. 30%

• potem zmniejszanie aktywności - osiągnięcie wartości jak u dorosłych w okresie dojrzewania

• w czasie ciąży i w połogu - zmniejszenie aktywności o ok. 30%

AMYLAZA (AMY)

EC 3.2.1.1 Glukanohydrolaza 1,4-a-D-glukanu

• hydrolizuje wiązania a-1,4-glikozydowe w łańcuchach polisacharydowych

• metaloenzym - wymaga obecności Ca⁺² dla zachowania swojej aktywności

• aktywatory - jony Cl^-, Br^-, NO₃^-, HPO₄^-2, cholanowe

• optymalne pH: 6,9 - 7,0

• 54-62 kDa

• jedyny enzym osoczowy fizjologicznie obecny w moczu

Rozmieszczenie tkankowe AMY

• izoenzym S - produkowany w śliniankach (obecny w ślinie)

• izoenzym P - produkowany w trzustce (obecny w soku trzustkowym)

• aktywność AML jest także stwierdzana w:

- nasieniu, nasieniowodach

- jajnikach, jajowodach

- mięśniach poprzecznie prążkowanych

- płucach

- tkance tłuszczowej

- siarze

- łzach

- mleku

- płynach z otrzewnej i opłucnej

• izoenzymy P i S podlegają modyfikacjom potranslacyjnym (glikozylacja, deaminacja, deglikozylacja) - powstaje wiele izoform

Znaczenie kliniczne AMY

Wzrost aktywności:

• zapalenie trzustki

- w ostrym zapaleniu wzrost aktywności po 5-6 godzinach od pierwszych objawów -> maksimum po 24 godzinach -> powrót do wartości prawidłowych po 3-4 dniach

• zapalenie ślinianek

• pozatrzustkowe choroby w jamie brzusznej

- choroby dróg żółciowych

- niedrożnośc jelit

- zapalenie krezki

- perforacja wrzodu żołądka

- zapalenie błony śluzowej żołądka i dwunastnicy

- pęknięcie tętniaka aorty

- ostre zapalenie wyrostka robaczkowego

- zapalenie otrzewnej

• choroby układu moczowo-płciowego

- pęknięcie jajowodu (ciąża pozamaciczna)

- nowotwór jajnika

- niewydolność nerek

• inne

- zmiany w śliniankach

- ostre nadużycie alkoholu

- cukrzycowa kwasica ketonowa

- makroamylazemia

- wstrząs septyczny

- zabiegi kardiochirurgiczne

- nowotwory

- leki

Makroamylazy

• czasem obecne w surowicy

• powodują hyperamylazemię

• są to kompleksy amylazy (najczęściej typu S) i immunoglobulin IgG lub IgA

• >200 kDa

• nie są filtrowane do moczu

• nie mają znaczenia klinicznego

Oznaczanie aktywności AMY

• test optyczny

- substrat - z krótkim łańcuchem glikozylowym (oligosacharydy: maltopentoza lub maltotetroza)

- enzym dodatkowy, pomocniczy i wskaźnikowy

• metoda kolorymetryczna - referencyjna

- substrat - 4-NP-glikozyd (4-nitrofenyloglikozyd np. 4-NP-G7 = maltoheptoza)

- enzym dodatkowy (-glukozydaza)

- produkt - 4-nitrofenol (405 nm)

- pomiar w 37°C (IFCC)

Przechowywanie materiału:

• AMY zachowuje aktywność w ciągu 4 dni w temperaturze pokojowej, 2 tygodnie w temperaturze 4°C, 1 rok w temperaturze -20°C, 5 lat w temperaturze -70°C

Oznaczanie izoenzymów AMY

• elektroforeza

• chromatografia jonowymienna

• ogniskowanie izoelektryczne

• selektywna inhibicja S-AMY (inhibitor z kiełków pszenicy)

• immunoprecypitacja

• immunoinhibicja

Zakresy referencyjne AMY w surowicy

• 31-107 U/L

• dorośli: 40-50% stanowi P-AMY (13-53 U/L)

LIPAZA (LPS)

EC 3.1.1.1 Acylohydrolaza triacyloglicerolowa

• glikoproteina

• monomer

• 48 kDa

• filtrowana do moczu, ale całkowicie reasorbowana zwrotnie

• kofaktor - kolipaza

• aktywator - sole żółciowe

Znaczenie kliniczne LPS

• produkowana prawie wyłącznie w trzustce (żołądek, błona śluzowa jelit - niewielkie ilości)

Wzrost aktywności:

• ostre zapalenie trzustki

- wzrost w ciągu 4-8 godzin -> maksimum aktywności po 24 godzinach -> powrót do wartości prawidłowych 8-14 dni

• przyczyny pozatrzustkowe

- perforacja wrzodu żołądka lub dwunastnicy

- niedrożność jelit

- niedrożność naczyniowa krezki

- zapalenie dróg żółciowych

- niedrożność przewodu trzustkowego (nowotwór lub kamień)

- niewydolność nerek

Oznaczanie aktywności LPS

Metody:

• miareczkowa

• turbidymetryczna

• kolorymetryczna - referencyjna

• fluorymetryczna

• immunochemiczna

Przechowywanie materiału:

• LPS jest aktywna 1 tydzień w temperaturze pokojowej; 3 tygodnie w 4°C; kilka lat w -70°C

Zakres wartości referencyjnych LPS

do 38 U/L

24

---