LIPIDY OSOCZA

1. Triacyloglicerole

2. Cholesterol wolny i zestryfikowany

3. Fosfolipidy

4. Wolne kwasy tłuszczowe

Transport lipidów w środowisku wodnym (we krwi) jest możliwy po ich połączeniu się z białkami (apoproteinami) w związki wielkocząsteczkowe zwane lipoproteinami.

LIPOPROTEINY

• sferyczne cząstki

- niestechiometryczne kompleksy białkowo-lipidowe

- rdzeń - triacyloglicerole i estry cholestrolu

- powierzchnia - cząsteczki amfipatycznych lipidów (fosfolipidy i cholesterol wolny)

i białek

• oddziaływania pomiędzy cząsteczkami - niekowalencyjne

- wiązania wodorowe

- siły van der Waalsa

• następuje wymiana lipidów i apoprotein pomiędzy lipoproteinami osocza oraz pomiędzy lipoproteinami i błonami komórkowymi

PODZIAŁ LIPOPROTEIN

Klasa/ Parametr	ChM	VLDL	IDL	LDL	HDL	Lp(a)
Gęstość [g/mL]	<0,95	0,95- 1,006	1,006-1,019	1,019- 1,063	1,063-1,210	1,040- 1,130
Ruchliwość w EF	start	prebeta1	prebeta2	beta	alfa	prebeta
Średnica [nm]	>70	26-70	22-24	19-23	4-10	26-30
Główne lipidy	egzogenne TAG	endogenne TAG	endogenne TAG, estry cholesterolu	estry cholesterolu	fosfolipidy	estry cholesterolu, fosfolipidy
Główne białka	A-I B-48 C-I C-II C-III E	B-100 C-I C-II C-III E	B-100 E	B-100	A-I A-II E	(a) B-100

Podział uwzględniający różnice gęstości poszczególnych frakcji lipoproteinowych - uzyskany metodą ultrawirowania

• chylomikrony: 0,98 g/mL

• lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL): <1,006 g/mL

• lipoproteiny o pośredniej gęstości (IDL): 1,006- 1,019 g/mL

• lipoproteiny o małej gęstości (LDL): 1,019-1,063 g/mL

• lipoproteiny o dużej gęstości (HDL): 1,063-1,21 g/mL

• Lp(a) - 1,040-1,130 g/mL

Podział uzyskany podczas elektroforezy (agaroza; pH 8,6):

• -lipoproteiny (HDL)

• pre--lipoproteiny (VLDL, IDL, Lp(a))

• -lipoproteiny (LDL)

• chylomikrony (ChM)

CHEMICZNY SKŁAD (%)PRAWIDŁOWYCH LIPOPROTEIN

Frakcja/ Skład (%)	ChM	VLDL	IDL	LDL	HDL
Triacyloglicerole	80-90	50-70	20-25	5-10	3-5
Cholesterol wolny	1-3	7-10	7-10	5-8	3-5
Estry cholesterolu	2-5	4-13	10-12	40-45	15-20
Fosfolipidy	3-7	15-20	15-20	20-22	20-30
Białka (apoproteiny)	1-2	8-12	18-20	20-25	45-55

APO(LIPO)PROTEINY

Apoproteina	Masa cząsteczkowa [Da]	Miejsce syntezy	Stężenie w osoczu [g/L]
AI	28 300	Jelito, wątroba	1,0-1,2
AII	17 000	Wątroba, jelito	0,3-0,5
AIV	46 000	Wątroba, jelito, płuca, śledziona	0,16
B-48	265 000	Jelito
B-100	550 000	Wątroba	0,7-1,0
CI	6500	Wątroba, jelito	0,04-0,06
CII	8800	Wątroba, jelito	0,03-0,05
CIII	8900	Wątroba, jelito	0,12-0,14
D	20 000	Mózg, wątroba, nerki, komórki endothelium
E-2, E-3, E-4	39 000	Wątroba, mózg, płuca, śledziona, mięśnie	0,025-0,100

Apoproteina	Funkcja
AI	Aktywator LCAT, ligand receptora HDL, rola strukturalna w HDL-ach
AII	Rola strukturalna, kofaktor HTGL, inhibitor LPL
AIV	Transport zwrotny cholesterolu, aktywator LCAT i LPL
B-48	Rola strukturalna
B-100	Ligand receptora apo B/E, rola strukturalna
CI	Kofaktor LCAT
CII	Aktywator LPL
CIII	Inhibitor apo-CII
D	Transport lipidów
E-2, E-3, E-4	Ligand receptora apo B/E i receptora LRP, transport cholesterolu

ENZYMY METABOLIZMU LIPOPROTEIN

Lipaza lipoproteinowa (LPL)

• glikoproteina (55 000)

• hydrolaza acyloglicerolu

• występuje w: tkance tłuszczowej, mięśniach szkieletowych, mięśniu sercowym, płucach, wątrobie, śledzionie

• związana z powierzchnią komórek - głównie śródbłonka naczyniowego (za pośrednictwem siarczanu heparanu)

• aktywność w tkankach zależy od czasu jaki upłynął od posiłku oraz od wydzielania hormonów (gł. insuliny)

- duża aktywność w tkance tłuszczowej po posiłku

- duża aktywność w mięśniach w okresie poresorpcyjnym

• wstrzyknięcie heparyny powoduje:

- uwolnienie LPL do krwi

- zmianę wykorzystania kwasów tłuszczowych przez narządy

• aktywatory: apo CII (na czczo na HDL-ach) i fosfolipidy (wiążą apo CII z lipoproteiną)

Wątrobowa lipaza lipoproteinowa (HTGL/HL)

• glikoproteina

• syntetyzowana w wątrobie

• wiąże się z powierzchnią śródbłonka w zatokach wątroby

• hydrolizuje triacyloglicerole w:

- IDL-ach

- remnantach chylomikronów

- HDL (przekształca HDL₂ w HDL₃)

Acylotransferaza acylo-CoA:cholesterol (ACAT)

• enzym mikrosomalny

• katalizuje reakcję estryfikacji cholesterolu w obecności CoA i ATP

• inhibitory:

- kwasy żółciowe

- czynniki blokujące grupy sulfhydrylowe

• wykazuje swoistość w stosunku do różnych kwasów tłuszczowych - szybkość estryfikacji maleje w zależności od rodzaju kwasu w kolejności:

oleinian>palmitynian>stearynian>linoleinian

• aktywność ACAT zależy od zawartości cholesterolu w komórce

Hydrolaza estrów cholesterolu (esteraza cholesterolowa)

• w wątrobie, ścianie naczyniowej, nabłonku jelitowym, korze nadnerczy i jajnikach (synteza hormonów steroidowych)

• katalizuje odwracalną reakcję estryfikacji cholesterolu i hydrolizy estrów cholesterolu:

estry cholesterolu + H₂O cholesterol wolny + kwas tłuszczowy

Acylotransferaza lecytyna:cholesterol (LCAT)

• sekrecyjny enzym osocza

• synteza w wątrobie

• związana z frakcją HDL

• katalizuje reakcję:

lecytyna + cholesterol ester cholesterolu + lizolecytyna

• powstają głównie estry cholesterolu i nienasyconych kwasów tłuszczowych (kwasu linolowego, oleinowego, arachidonowego)

• aktywator: AI (CI)

BIAŁKO PRZENOSZĄCE ESTRY CHOLESTEROLU (CETP)

• glikoproteina

• posiada domeny wiążące triacyloglicerole, estry cholesterolu, fosfolipidy

• synteza - wątroba, nadnercza, trzustka, mięśnie, tkanka tłuszczowa, jelito cienkie, serce i nerki

• odpowiada za transfer:

- estrów cholesterolu pomiędzy lipoproteinami osocza i ich wymianę na triacyloglicerole

(100%)

- fosfolipidów (w ok. 30%)

BIAŁKO PRZENOSZĄCE FOSFOLIPIDY (PTP)

• odpowiedzialne za 70 % transferu fosfolipidów pomiędzy lipoproteinami osocza:

- z lipoprotein bogatych w TAG na HDL-e

- z HDL₃ na VLDL-e i LDL-e

- z CETP z HDL na inne lipoproteiny

RECEPTORY UCZESTNICZĄCE W PRZEMIANACH LIPOPROTEIN OSOCZA

• receptor dla remnantów (LRP)

- w wątrobie

- rozpoznaje apo E

• receptor dla LDL (receptor apo B100/E)

- w wielu komórkach organizmu

- rozpoznaje apo B100 i apo E

- jego synteza jest ściśle uzależniona od zapotrzebowania komórki na cholesterol i

zawartości w niej estrów cholesterolu

• receptor SR-B1 (receptor zmiatający B1)

- w wątrobie i tkankach steroidogennych wiąże HDL za pośrednictwem apo AI i estry

cholesterolu są dostarczane do komórek

- w pozostałych tkankach pośredniczy w przenoszeniu cholesterolu z komórek do

HDL₃ (zwrotny transport choleterolu)

• transportery kasetowe wiążące ATP: ABCA1 i ABCG1

- rodzina białek transportujących z towarzyszącą hydrolizą ATP w celu związania

substratu (co umożliwia jego transport przez błonę)

- ABCG1 - pośredniczy w transporcie cholesterolu z komórek do HDL-i (np. z

makrofagów)

- ABCA1 - preferencyjnie ułatwia wypływ cholesterolu i fosfolipidów do cząstek

pre-HDL lub apo AI przekształcanych następnie w dyskoidalne HDL i HDL₃

LIPOPROTEINA (a)

• glikoproteina, białko ostrej fazy, zmodyfikowana cząstka LDL

• apo (a) i apo B100 - połączone mostkiem dwusiarczkowym

• apo (a) - peptyd sygnałowy, domena proteazowa i struktury obwarzankowe (kringles) utrzymywane przez 3 wiązania dwusiarczkowe (podobne struktury są w plazminogenie, protrombinie, tkankowym i urokinazowym aktywatorze plazminogenu)

• zakres stężeń w osoczu 1-100 mg/dL (prawidłowe nie powinno przekraczać 30 mg/dL)

• podobieństwo budowy apo (a) do plazminogenu może hamować procesy fibrynolizy (działanie prozakrzepowe)

• pobudza regenerację i naprawę uszkodzonych naczyń

• apo (a) występuje w izoformach:

- F (fast) - o ruchliwości elektroforetycznej większej niż apo B100

- B - o ruchliwości elektroforetycznej zbliżonej do apo B100

- S1, S2, S3, S4 (slow) o ruchliwości elektroforetycznej mniejszej niż apo B100

• u osób z małym stężeniem Lp(a) przeważają duże izoformy apo (a) S3 i S4

• u osób ze zwiększonym stężeniem Lp(a) przeważają izoformy małe F, B, S1, S2

• Lp(a) nasila chemotaksję monocytów do blaszki miażdżycowej i aktywację płytek krwi

• Lp(a) jest pobierana przez receptory typu „scavenger”

LIPOPROTEINA X (LpX)

• u pacjentów z cholestazą wątrobową

• budowa - liposomy:

- podwójna warstwa fosfolipidowa (gł. lecytyny) - 66%

- wolny cholesterol - 25%

- białka (1/2 albumina) - 5%

• nie wykazuje właściwości aterogennych

LIPOPROTEINA -VLDL

• powstaje w osoczu:

- podczas stosowania diety bogatotłuszczowej

- w otyłości brzusznej

- w insulinooporności

- cukrzycy typu 2

- gdy wytwarzana jest izoforma apo E2

• gęstość <1,006 g/mL (VLDL)

• ruchliwość elektroforetyczna b-lipoprotein (LDL)

• zawartość

- 40% TAG + ok. 35% cholesterolu

• aterogenna

ZMODYFIKOWANE LDL

• utlenione LDL - retencja LDL i zaburzenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej

- mm-LDL (wczesna faza modyfikacji)

- ox-LDL (późna faza modyfikacji)

• insulinooporność i cukrzyca - podwyższone stężenia glukozy

- gli-LDL

- glioksy-LDL

APOPROTEINA E (Apo E)

• chylomikrony, VLDL, IDL, HDL

• rozpoznawana przez receptory: LRP i B/E

• osłania apo AI

• nasila aktywność białka CETP

• wykazuje polimorfizm (3 allele w jednym locus + modyfikacja potranslacyjna)

• 6 fenotypów: apo E 2/2, apo E 3/2, apo E 3/3, apo E 4/2, apo E4/3, apo E 4/4

Poszczególne izoformy wykazują różną siłę wiązania z receptorami LRP:

• izoforma apo E2

- wykazuje mniejsze powinowactwo do receptora LRP -> zmniejsza się zawartość

cholesterolu w komórkach wątroby -> zwiększa się ilość receptorów B/E

• izoforma apo E4

- wykazuje większe powinowactwo do receptora LRP -> zwiększa się zawartość

cholesterolu w komórkach wątroby -> zmniejsz się ilość receptorów B/E

- bierze udział w patomechanizmie choroby Alzheimera (powstają kompleksy apo E4 i

peptydu powstającego z białka prekursorowego amyloidu)

DYSLIPIDEMIE / DYSLIPOPROTEINEMIE

Klasyfikacja hiperlipoproteinemii według Fredricksona

Typ	Wygląd surowicy	CH	TAG	EF	ChT/TAG
I	mleczna	N/↑	↑↑↑	ChM	< 0,2
IIa	klarowna	↑↑↑	N	nadmiar LDL	> 1,5
IIb	klarowna, opalizująca	↑↑	↑↑	nadmiar LDL i VLDL	> 1,5
III	mętna	↑↑	↑↑	IDL	ok.1
IV	mętna	N/↑	↑↑↑	nadmiar VLDL	< 0,2
V	mleczna	↑↑	↑↑↑	ChM i nadmiar VLDL	0,15-0,6

KLASYFIKACJA HIPERLIPIDEMII

(wg Europejskiego Towarzystwa Miażdżycowego)

	CH mmol/L (mg/dL)	TAG mmol/L (mg/dL)
Hipercholesterolemia izolowana: - łagodna - umiarkowana - znaczna	5,2-6,5 (200-250) 6,5-7,8 (250-300) > 7,8 (> 300)	<1,7 (150) <1,7 (150) <1,7 (150)
Hipertriglicerydemia izolowana: - umiarkowana - znaczna	<5,2 (200) <5,2 (200)	2,3-4,6 (200-400) >4,6 (>400)
Hiperlipidemia mieszana: - umiarkowana - znaczna	5,2-6,5 (200-250) >7,8 (>300)	2,3-4,6 (200-400) >4,6 (400)

HIPERCHOLESTEROLEMIA

Klasyfikacja genetyczna	Pierwotna przyczyna	Zaburzenia metaboliczne	Typ
Pospolita hiper-cholesterolemia	liczne czynniki genetyczne/ środowiskowe	nadprodukcja LDL i obniżony katabolizm	IIa
Rodzinna złożona hipelipidemia	nieznana	nadprodukcja apo B frakcji VLDL i LDL	IIa
Rodzinna hiper-cholesterolemia	liczne mutacje powodujące upośledzenie funkcji lub brak receptora komórkowego dla LDL	upośledzony katabolizm LDL i nadprodukcja LDL	IIa

HIPERTRIGLICERYDEMIA

Klasyfikacja genetyczna	Pierwotna przyczyna	Zaburzenia metaboliczne	Typ
Pospolita hiper-triglicerydemia	czynniki genetyczne/ środowiskowe	nadprodukcja VLDL	IV
Rodzinna złożona hiperlipidemia	nieznana	nadprodukcja apo B frakcji VLDL i LDL	IV
Rodzinna hipertriglicerydemia	nieznana	nadprodukcja TAG frakcji VLDL i/lub upośledzony katabolizm	IV

HIPERLIPIDEMIA MIESZANA

Klasyfikacja genetyczna	Pierwotna przyczyna	Zaburzenia metaboliczne	Typ
Rodzinna złożona hiperlipidemia	nieznana	nadprodukcja apo B frakcji VLDL i LDL	IIb
Rodzinna hiper-cholesterolemia	liczne mutacje powodujące upośledzenie funkcji lub brak receptora komórkowego dla LDL	upośledzony katabolizm LDL i nadprodukcja LDL	IIb
Rodzinna hiper-triglicerydemia	nieznana	nadprodukcja TAG frakcji VLDL i/lub upośledzony katabolizm	IV
Zespół hiper-chylomikronemii	brak/niedobór LPL lub jej aktywatora apo CII	upośledzony katabolizm ChM, czasem wtórne upośledzone usuwanie VLDL	I lub V

INNE RODZAJE KLASYFIKACJI DYSLIPIDEMII

• pierwotne i wtórne

• jednogenowe,wielogenowe, złożone

PIERWOTNE DYSLIPIDEMIE

Związane z zaburzeniami transportu lipidów egzogennych

• sitosterolemia (zwiększone wchłanianie steroli roślinnych)

• abetalipoproteinemia (brak syntezy VLDL i ChM)

• choroba Andersona (brak syntezy ChM)

• rodzinna hipertriglicerydemia (chylomikronemia) związana z niedoborem LPL

• rodzinna hipertriglicerydemia (chylomikronemia) związana z niedoborem apo CII

• hiperlipidemia typu III (rodzinna dysbetalipoproteinemia) - izoforma apo E2 + inne przyczyny

Związane z zaburzeniami transportu lipidów endogennych

• złożone hiperlipidemie (złożone podłoże genetyczne) - izoforma apo E4 (najczęściej)

• rodzinna złożona hiperlipidemia (nasilona sekrecja apo B100 i synteza VLDL w wątrobie, wzrost aktywności apo CIII + inne)

• rodzinna hipercholesterolemia (upośledzona funkcja receptora dla LDL )

• rodzinny defekt apoproteiny apo B100

• dyslipidemia z nadprodukcją Lp(a)

• hipobetalipoproteinemia

• brak aktywności lipazy wątrobowej

Związane z zaburzeniami drogi transportu zwrotnego cholesterolu do wątroby

• rodzinna hipoalfalipoproteinemia

• brak apo AI

• zmieniona budowa apo AI

• choroba tangierska (mutacje genu transportera ABCA-1)

• upośledzenie aktywności LCAT

• hiperalfalipoproteinemia związana z niedoborem CETP

• brak apo AII

Przyczyna	Podwyższona frakcja lipoprotein	HDL
Endokrynna, metaboliczna
- cukrzyca	LDL i/lub VLDL/ChM	↓
- niedoczynnośc tarczycy	LDL i/lub VLDL/ChM/IDL	↓
- choroba Cushinga	LDL i/lub VLDL	N
- akromegalia	VLDL	?
Nerkowa
- niewydolność nerek	IDL lub VLDL	↓
- zespół nerczycowy	LDL i/lub VLDL/ChM	↓
Wątrobowa
- cholestaza	LDL (LpX)	↓
- alkoholizm	VLDL, ChM	N

Przyczyna	Podwyższona frakcja lipoprotein	HDL
Immunologiczna:
- toczeń rumieniowaty	ChM lub IDL	N
- gammapatie monoklonalne	LDL i/lub VLDL/ChM lub IDL	↓
Leki:
- -blokery	VLDL, LDL	↓
- tiazydy	LDL i/lub VLDL	N/↓
- glikokortykoidy	VLDL i/lub ChM z/bez LDL	N/↓
- estrogeny	VLDL/ChM	N
- gestageny	LDL i VLDL	↓

WSKAZANIA DO PRZEPROWADZENIA BADAŃ LIPIDOWYCH

• ocena ryzyka wieńcowego

• pierwotne dyslipoproteinemie (objawy: żółtaki, obwódka starcza, zmętnienie rogówki, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, hepatosplenomegalia)

• wtórne dyslipoproteinemie

• wyjaśnienie etiologii ostrego zapalenia trzustki

• profilaktyka

• kontrola leczenia obniżającego stężenie tłuszczów (dietetycznego, farmakologicznego) i leczenia chorób wywołujących wtórne hipercholesterolemie

MATERIAŁ DO BADAŃ LIPIDOWYCH

• krew żylna - krótkotrwały ucisk stazy

• pacjent minimum 12-14 godzin na czczo (bez głodówek)

• ostatni posiłek przed badaniem - z małą ilością tłuszczu, bez alkoholu (szczególnie ważne podczas oznaczania stężenia TAG)

• w ciągu 24 godzin przed pobraniem krwi nie wykonywać żadnej ciężkiej pracy fizycznej

• surowica lub osocze wersenianowe (1 mg EDTA na 1 mL krwi)

• przechowywanie materiału - w szczelnie zamkniętych probówkach:

- do 4 dni w lodówce

- w temp. -20°C do 6 miesięcy

- w temp. -70°C do roku

Test zimnej flotacji

• ocena wyglądu surowicy/osocza (na czarnym tle)

- mętny wygląd - zależy od nadmiaru TAG (VLDL lub ChM)

• do wąskiej probówki nalewamy 2-5 mL surowicy i wstawiamy do lodówki na 12-18 godzin

• wynik:

- gęsty kożuszek - kożuszek - mętna

na powierzchni - mętna surowica surowica

- przejrzysta surowica

↑ChM - typ I ↑ ChM typ V ↑ VLDL - typ IV/IIB

↑ VLDL

OZNACZANIE CHOLESTEROLU CAŁKOWITEGO

Metody kolorymetryczne (chemiczne)

! Krew nie może być zhemolizowana - hemoliza wpływa na stężenie cholesterolu w osoczu (zwiększa)!

• w osoczu in vitro:

ChW : ChE = 1 : 3

• w erytrocytach

ChW : ChE = 4 : 1

Bilirubina w stężeniu powyżej 10 mg% wpływa na oznaczenie cholesterolu - przyjmuje się poprawki zależne od stężenia bilirubiny:

- przy stężeniu bilirubiny >5mg% na każdy 1 mg% należy dodać 2,5 mg% cholesterolu

Metody kolorymetryczne oznaczania cholesterolu dzielimy na:

• jednostopniowe - reakcja barwna(rutynowe)

• wielostopniowe

- czterostopniowe

ekstrakcja cholesterolu

zmydlanie

izolowanie

reakcja barwna

- trzystopniowe

ekstrakcja cholesterolu

zmydlanie

reakcja barwna

EKSTRAKCJA

Cholesterol jest związany z lipoproteinami - należy go z tych połączeń wyekstrahować mieszaniną odczynników:

• etanolu i eteru - całkowita ekstrakcja cholesterolu

• etanolu i acetonu

• metanolu i chloroformu (mieszanina Folcha)

ZMYDLANIE

Hydroliza estrów cholesterolu za pomocą alkoholowego roztworu KOH (na ciepło) - uzyskanie postaci wolnej cholesterolu

IZOLOWANIE

• najczęściej strącanie digitoniną

- powstają digitonidy

- stosunek molekularny cholesterolu do digitoniny 1:1

- podczas strącannia stosuje się nadmiar digitoniny (10:1)

- przed reakcją barwną należy pozbyć się digitonidów (pirydyną lub CH₃COOH

REAKCJE BARWNE

A. Reakcja Liebermanna - Burcharda - najstarsza

• do roztworu dodaje się mieszaninę bezwodnika CH₃COOH i stężonego H₂SO₄

Roztwór: cholesterol w chloroformie, kwasie octowym, dioksanie lub bezpośrednio

próbka surowicy/osocza

• reakcja L-B nie jest swoista dla cholesterolu - z odczynnikiem reagują także bilirubina, witaminy, inne steroidy.

B. Kwas p-toluenosulfonowy

• z bezwodnikiem CH₃COOH, CH₃COOH lodowatym i H₂SO₄

C. Reakcja z FeCl₃, CH₃COOH lodowatym i H₂SO₄

Referencyjna metoda oznaczania cholesterolu całkowitego

Metoda Abell-Kendalla (chemiczna 3-stopniowa):

• ekstrakcja: mieszanina alkoholu etylowego i eteru

• zmydlanie : alkoholowy roztwór KOH

• reakcja barwna: Libermanna-Burcharda

Metody enzymatyczne

HYDROLIZA

esteraza cholesterolowa

cholesterol zestryfikowany + H₂O cholesterol + RCOOH

UTLENIENIE

oksydaza cholesterolowa

cholesterol + O₂ 4- cholestenon + H₂O₂

OZNACZANIE

• elektroda tlenowa - oznaczanie tlenu zużytego w tej reakcji

• spektrofotometrycznie - pomiar powstałego D4- cholestenonu (l_max- 240 nm)

• reakcja Hanztscha - katalaza + metanol

- metanol utlenia się do aldehydu mrówkowego, który w obecności acetyloacetonu i

amoniaku daje barwny kompleks 3,5-diacetylo-1,4dihydrolutydyny (405-415 nm)

• reakcja Trindera - kolorymetrycznie w obecności peroksydazy z 4-aminoantypiryną w obecności fenolu (500-550 nm)

4-aminoantypiryna + fenol = odczynnik Trindera

peroksydaza

H₂O₂ + fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H₂O

Metoda CHOD-PAP = oksydaza + odczynnik

cholesterolowa Trindera

• test optyczny

katalaza

H₂O₂ + etanol aldehyd octowy + 2H₂O

dehydrogenaza aldehydu octowego

aldehyd octowy + NADP⁺ kwas octowy + NADPH+H⁺

Interferencje - metody enzymatyczne oznaczania cholesterolu

Interferują związki barwne lub uczestniczące w reakcji utleniania:

• bilirubina o stężeniu powyżej 5 mg/dL (85,5 mol/L) - dodaje się oksydazę bilirubiny

• kwas askorbinowy

• hemoglobina - stosuje się pomiar bichromatyczny

• inne sterole zawierające grupę -OH (np. sitosterol) mogą reagować z zastosowanymi odczynnikami

Oznaczanie estrów cholesterolu

ChT - ChW = ChE

ChT - cholesterol całkowity

ChW - cholesterol wolny (oznaczony bez etapu zmydlania)

ChE - estry cholesterolu

Metoda rozcieńczeń izotopowych z wykorzystaniem spektrometrii masowej

• metoda definitywna oznaczania cholesterolu (ID/MS)

Ch + Ch znakowany (1:1) -> hydroliza estrów -> ekstrakcja

z przekształceniem cholesterolu w etery (analiza GC/MS)

• oblicza się stosunek cholesterolu znakowanego do nieznakowanego i stężenie cholesterolu w próbce

• bardzo wysoka czułość i precyzja

Zakresy wartości prawidłowych stężeń cholesterolu całkowitego

• zakres wartości prawidłowych trudny do zdefiniowania (odbiega od zakresu wartości pożądanych = nie powodujących wzrostu ryzyka choroby niedokrwiennej serca)

- duża zmienność biologiczna (wiek, płeć, dieta, wahania

sezonowe, dobowe, faza cyklu menstruacyjnego, ciąża, zawał mięśnia sercowego,

zabiegi chirurgiczne)

- duża częstość hipercholesterolemii

- długi okres latencji do klinicznych objawów następstw hipercholesterolemii

• zakłada się zakres wartości pomiędzy 10 i 90 percentylem

Wiek	Stężenie cholesterolu całkowitego
		[mg/dL]	[mmol/L]
> 40 r. ż.	< 240	< 6,2
30-40 r. ż.	< 220	< 5,7
20-30 r. ż.	< 200	< 5,2
< 20 r. ż.	< 170	< 4,4
> 1 r. ż.	< 225	< 5,8
< 1 r. ż.	< 190	< 5,0
Przelicznik [mg/dL] na [mmol/L]: 0,026

Nieprawidłowe stężenia cholesterolu całkowitego

Wartości podwyższone:

• pierwotne hipercholesterolemie

• wtórne hipercholesterolemie - w przebiegu:

- przewlekła niewydolność nerek

- zespół nerczycowy

- przewlekłe choroby wątroby i dróg żółciowych (szczególnie pierwotna żółciowa

marskość wątroby)

- niedoczynność tarczycy

- cukrzyca (źle wyrównana)

• leki: gestageny (doustne środki antykoncepcyjne), glikokortykoidy, leki moczopędne

• złe nawyki żywieniowe

Wartości obniżone:

• poniżej 140 mg/dL (3,6 mmol/L)

• ciężkie choroby wyniszczające (nowotwory, przewlekłe zakżenia, operacje, urazy wielonarządowe)

• nadczynność tarczycy

• niewydolność wątroby

• głodzenie

OZNACZANIE STĘŻENIA TRIACYLOGLICEROLI (TAG)

Metody kolorymetryczne (chemiczne)

EKSTRAKCJA

• odczynnikiem Bloora (etanol:eter etylowy; 3:1 v/v)

- ekstrakcji ulegają także fosfolipidy

- suszenie ekstraktu i ważenie

ADSORPCJA

• usuwanie fosfolipidów - adsorpcja mieszaniną albuminy i zeolitu

• usuwanie glukozy - adsorpcja mieszaniną Ca(OH)₂ i CuSO₄

ZMYDLANIE

• etanolowym roztworem KOH

• następuje uwolnienie glicerolu

REAKCJA BARWNA

• glicerol utlenia się pod wpływem kwasu nadjodowego do formaldehydu

• formaldehyd kondensuje z acetonem w obecności amoniaku - powstaje kompleks barwny: 3,5-diacetylo-1,4-dihydrolutydyna (405 nm)

Metody fluorymetryczne

• 3,5-diacetylo-1,4-dihydrolutydyna (DDL) - może być oznaczana metodą fluorymetryczną

Metody enzymatyczne

HYDROLIZA

lipaza

triacyloglicerol + 3H₂O glicerol + 3 kwasy tłuszczowe

OZNACZANIE GLICEROLU

• z wykorzystaniem testu optycznego

1. kinaza glicerolowa

glicerol + ATP glicerolofosforan + ADP

dehydrogenaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + NAD⁺ fosfodihydroksyaceton + NADH+H⁺

2. kinaza glicerolowa

glicerol + ATP glicerolofosforan + ADP

kinaza pirogronianowa

ADP + fosfoenolopirogronian pirogronian + ATP

LDH

pirogronian + NADH+H⁺ mleczan + NAD⁺

• z wykorzystaniem pomiaru kolorymetrycznego

1. kinaza glicerolowa

glicerol + ATP glicerolofosforan + ADP

dehydrogenaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + NAD⁺ fosfodihydroksyaceton + NADH+H⁺

diaforaza

NADH+H⁺ + barwnik tetrazoliowy formazan + NAD⁺

Pomiar: 500 nm

2.

kinaza glicerolowa

glicerol + ATP glicerolofosforan + ADP

oksydaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + O₂ fosfodihydroksyaceton + H₂O₂

peroksydaza

H₂O₂ + fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H₂O

Pomiar: 500-550 nm (metoda z odczynnikiem Trindera, PAP)

Reakcja Trindera - kolorymetrycznie w obecności peroksydazy z 4-aminoantypiryną w obecności fenolu (500-550 nm)

4-aminoantypiryna + fenol = odczynnik Trindera

Interferencje - metody enzymatyczne oznaczania TAG

• endogenny glicerol - w prawidłowych warunkach w niewielkich ilościach (równowartość ok. 10 mg/dL TAG)

• zwiększenie stężenia glicerolu:

- cukrzyca

- stres (emocjonalny)

- dożylne podawanie leków zawierających glicerol

- przedłużone przechowywanie w temperaturze >-20°C

Metoda stałego odcinka czasu (fixed time method)

- oparta na rożnicy wartości pomiarów w dwóch punktach czasowych

- pozwala na eliminację błędu wynikającego z obecności glicerolu

Zakres wartości prawidłowych stężeń TAG

50 -180 mg/dL (0,55-2,0 mmol/L)

Przelicznik z [mg/dL] na [mmol/L]: 0,0114

Nieprawidłowe stężenia TAG

Wartości podwyższone:

• pierwotne hipertriglicerydemie

• wtórne hipertriglicerydemie - w przebiegu:

- cukrzyca

- dna moczanowa

- choroba Cushinga

- gammapatie monoklonalne

- toczeń rumieniowaty układowy

- choroby spichrzania glikogenu

- ciąża

- skłonność: otyłość, nadużywanie alkoholu, dieta bogatowęglowodanowa

• leki: blokery receptorów b, tiazydy, glikokortykoidy, estrogeny (doustne leki antykoncepcyjne)

Oznaczanie stężenia cholesterolu frakcji HDL

Metody strąceniowe

• precypitacja lipoprotein VLDL, IDL, Lp(a), LDL, ChM

- za pomocą polianionów (heparyna, siarczan dekstranu, fosforowolframian)

reagujących z dodatnio naładowanymi grupami lipoprotein

- w obecności kationów dwuwartościowych reakcja ulega przyśpieszeniu

- precypitacja 10-15 minut -> wirowanie 45 000g; 1 minuta lub 1500g; 30 minut

• w supernantancie: cholesterol HDL (oznaczany metodą enzymatyczną)

Najczęściej stosowane mieszaniny polianionów z dwuwartościowymi kationami:

• heparyna z Mn⁺²

• siarczan dekstranu z Mg⁺² (najlepszy przy wysokich stężeniach TAG)

• kwas fosforowolframowy z Mg⁺²

• glikol polietylenowy 20 000 (wytrąca także HDL₂)

!Gdy stężenie TAG>400 mg/dL precypitacja jest utrudniona - należy zastosować wirowanie, filtrację lub rozcieńczenie badanej próbki osocza!

Metody bezpośrednie

Oznaczenie cholesterolu we frakcji HDL - metodą enzymatyczną z zastosowaniem:

• przeciwciał poliwalentnych przeciwko apo-B

• czynników kompleksujących

- cyklodekstryna - opłaszcza lipoproteiny (głównie z apo-B, HDL

są opłaszczone w niewielkim stopniu) = osłania cholesterol we frakcjach poza HDL

przed enzymami uczestniczącymi w reakcji

- specyficzny detergent usuwa cyklodekstrynę z frakcji HDL

Oznaczanie stężenia cholesterolu frakcji LDL

Metody pośrednie

1. Wzór Friedewalda

- oznaczenie stężenia cholesterolu całkowitego (ChT), triacylogliceroli (TAG), cholesterolu frakcji HDL (Ch-HDL)-> podstawienie do wzoru:

TAG

Ch-LDL = ChT - Ch-HDL - [mg/dL]

5

TAG

Ch-LDL = ChT - Ch-HDL - [mmol/L]

2,2

Wzór Friedewalda nie powinien być stosowany, gdy:

• stężenie TAG przekracza 300 mg/dL (400 mg/dL)

• surowica zawiera znaczące ilości chylomikronów

- nie zostały pobrane na czczo

- u pacjentów z dysbetalipoproteinemią

2. Oznaczanie lipoprotein  - metoda ultrawirowania z precypitacją polianionami (metoda referencyjna)

- osocze wersenianowe (2 mL) z roztworem burowym o gęstości 1,006 g/mL (1 mL) poddajemy wirowaniu (105 000 x g, 18 godzin, 10°C)

- uzyskujemy rozdział:

VLDL, -VLDL, ChM (warstwa flotująca)

osocze

LDL, HDL (infranatant) + Lp(a), IDL

- infranatant - mieszany, rekonstytuowany do znanej objętości

- oznaczenie cholesterolu w infranatancie

- obliczenie stężenia cholesterolu frakcji LDL i VLDL:

[Ch-LDL] = [Ch frakcji o gęstości >1,006 g/mL] - [Ch-HDL]

[Ch-VLDL] = [ChT] - [Ch frakcji o gęstości >1,006 g/mL]

3. Elektroforeza lipoprotein

• metoda półilościowa

• pozwala uwidocznić różnice w szybkości wędrówki lipoprotein (wskazuje na zmiany lub defekty genetyczne nie dające się ocenić innymi metodami) - np. szerokie pasmo , odpowiadające flotującym b-lipoproteinom jest charakterystyczne dla hipelipidemii typu III.

• nośnik: bibuła, octan celulozy, agaroza, żel poliakrylamidowy

• barwienie:

- czerwień olejowa O w 40-55% etanolu (najczęściej stosowana)

- czerń sudanowa B

- czerń amidowa

• (lub) wytrącenie w żelu za pomocą polianionów

• ocena densytometryczna

Metody bezpośrednie

• selektywna precypitacja z:

- siarczanem poliwinylu

- heparyną w niskim pH

• metody wykorzystujące mieszaninę przeciwciał poliklonalnych przeciwko apo-AI i apo-E związanych z żywicą, które wiążą i usuwają VLDL, IDL, HDL

• metody z homogennymi reagentami - pomiar stężenia cholesterolu LDL (metodą enzymatyczną) po zamaskowaniu cholesterolu związanego z frakcjami innymi niż LDL (przeciwciała poliklonalne przeciwko apo-AI i apo-E)

Zakresy wartości stężeń cholesterolu frakcji HDL i LDL

	Ryzyko choroby wieńcowej	Cholesterol LDL		Cholesterol HDL
				[mg/dL]	[mmol/L]	[mg/dL]	[mmol/L]
	Kobiety	normalne	< 160	< 4,2	> 65	> 1,7
		podwyższone	> 180	> 4,7	< 45	< 1,2
	Mężczyźni	normalne	< 160	< 4,2	> 55	> 1,5
		podwyższone	> 180	> 4,7	< 35	< 0,9

Wartości docelowe leczenia hipolipemicznego

Wynik badania	Ryzyko zawału	Docelowa wartość cholesterolu LDL
Rozpoznana choroba wieńcowa	Bardzo wysokie	< 100 mg/dL
Cholesterol > 300 mg/dL i więcej niż jeden dodatkowy czynnik ryzyka	Wysokie	< 130 mg/dL
Cholesterol 200-300 mg/dL i jeden dodatkowy czynnik ryzyka	Dość duże	< 155 mg/dL

Czynniki wpływające na stężenia cholesterolu frakcji LDL i HDL

	LDL	HDL
Aktywność fizyczna	↓	↑
Brak aktywności fizycznej	↑	↓
Glikokortykoidy, androgeny, -blokery, leki moczopędne	↑	↓
Estrogeny	N/↑	↑
Gestageny	↑	↓

Czynniki ryzyka choroby wieńcowej

• palenie papierosów

• nadciśnienie

• hipercholesterolemia

• niskie stężenie cholesterolu HDL

• płeć męska (w okresie pomenopauzalnym ryzyko u kobiet jest takie samo jak u mężczyzn)

• cukrzyca

• wczesna choroba wieńcowa u bliskich krewnych

• choroba naczyń obwodowych i mózgowych u krewnych

• otyłość

Układ odniesienia dla wyników laboratoryjnych

• interpretacja stężeń lipidów i frakcji lipoproteinowych - ocena ryzyka zagrożenia miażdżycą i chorobą niedokrwienna serca (wartości decyzyjne)

• zalecane wartości decyzyjne: cholesterol całkowity < 200 mg/dL

Poziom	LDL [mg/dL]	HDL [mg/dL] kobiety	HDL [mg/dL] mężczyźni
Pożądany	< 135	> 66	> 58
Graniczny	135-175	66-42	58-35
Wysokiego ryzyka	> 175	< 42	< 35

Lipidowe czynniki ryzyka choroby wieńcowej

• cholesterol całkowity / cholesterol HDL > 5

• cholesterol LDL / cholesterol HDL > 4

• duże stężenie TAG przy niskim stężeniu cholesterolu HDL

• obecność małych gęstych LDL

Oznaczanie apolipoprotein

Metody:

• radioimmunologiczne

• immunoenzymatyczne

• immunodyfuzja radialna (metoda referencyjna)

• immunoturbidymetryczne

Zakresy wartości prawidłowych stężenia apolipoprotein

Apoproteina	Zakres normy [mg/dL]
Apo B100	50-130
Apo CI	110-205
Apo E	3-5
Apo CII	3-8

OZNACZANIE STĘŻENIA FOSFOLIPIDÓW

Metody chemiczne

I. 1. Ekstrakcja - odczynnikiem Bloora (etanol + eter etylowy), eterem naftowym, izopropanolem, odczynnikiem Folcha (chloroform + metanol)

2. Hydroliza - uwolnienie fosforu i utlenienie fosforu organicznego do nieorganicznego (HClO₄, HNO₃ + H₂O₂)

3. Reakcja barwna - reakcja fosforu nieorganicznego z molibdenianem amonu -> fosfomolibdenian amonu -> reakcja z Zn⁺² do błękitu molibdenowego (660 nm)

II. 1. Wytrącanie fosfolipidów z białkami (TCA)

2. Utlenienie fosforu organicznego do fosforu nieorganicznego (HClO₄)

3. Reakcja barwna

Metody enzymatyczne

• lecytyna - główny fosfolipid osocza

• fosfolipazy

- A₁ - uwalnia resztę acylową w pozycji 

- A₂ - uwalnia resztę acylową w pozycji 

- C - uwalnia resztę fosfocholiny

- D - uwalnia resztę choliny

1. fofataza alkaliczna

fosfocholina + H₂O cholina + P_i

kinaza choliny

cholina + ATP fosfocholina + ADP

kinaza pirogronianowa

ADP + fosfoenolopirogronian pirogronian + ATP

LDH

pirogronian + NADH+H⁺ mleczan + NAD⁺

2. oksydaza choliny

cholina + 2O₂ + H₂O betaina + H₂O₂

H₂O₂ + fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H₂O

Pomiar: 500-550 nm (metoda z odczynnikiem Trindera, PAP)

Znaczenie kliniczne oznaczania fosfolipidów

• zakres wartości prawidłowych w osoczu

- fosfor fosfolipidów 6-11 mg/dL

- stężenie fosfolipidów 150-300 mg/dL

- stosunek cholesterol/fosfolipidy ≈ 0,98 (wzrasta z wiekiem do ok. 1,4)

• zwiększone stężenie fosfolipidów

- miażdżyca naczyń

- niewydolność wątroby

- cukrzyca

• oznaczanie lecytyny w płynie owodniowym - ocena dojrzałości układu oddechowego płodu

- stężenie > 5,1 mg/dL - prawidłowe dojrzewanie

- stężenie 4,7-5,1 mg/dL - zaburzenia dojrzewania

OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (WKT)

• ocena poheparynowej aktywności lipolitycznej osocza (aktywność LPL)

• znaczenie w hiperlipoproteinemii typu I i V

• metoda miareczkowa

- ekstrakcja izopropanolem i heptanem

- miareczkowanie mianowanym roztworem NaOH wobec

wskaźnika (błękit tymolowy)

• prawidłowe stężenie WKT w surowicy: 0,2-0,8 mmol/L

• zwiększone stężenie WKT: cukrzyca, głodzenie, adrenalina, hormon wzrostu

18

---